Die Autoren bedanken sich bei Dr. John Harbell für seine wissenschaftliche Unterstützung und Zeit für das ETI-Projekt gewidmet danken. Die Autoren möchte auch danken, Beiersdorf AG (Deutschland), IIVS (USA), Mary Kay Inc. (USA), Avon Products Inc. (USA), Procter &amp; Gamble / Cosmital (Schweiz), Laboratoire Pierre Fabre (Frankreich), Harlan Laboratories (Vereinigtes Königreich), und LVMH Parfume (Frankreich) für die Teilnahme an multizent Internationale Pre-und Validierungsstudien der Test auf Augenreizung 15.

<ol>
	<li>National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Request+for+Ocular+Irritancy+Test+Data+From+Human,+Rabbit,+and+In+Vitro+Studies+Using+Standardized+Testing+Methods.">Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods.</a> Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+(EC)+No+1907/2006+of+the+European+Parliament+and+of+the+Council+of+18+December+2006+concerning+the+Registration,+Evaluation,+Authorisation+and+Restriction+of+Chemicals+(REACH),+establishing+a+European+Chemicals+Agency,+amending+Directive+1999/45/EC+and+repealing+Council+Regulation+(EEC)+No+793/93+and+Commission+Regulation+(EC)+No+1488/94+as+well+as+Council+Directive+76/769/EEC+and+Commission+Directives+91/155/EEC,+93/67/EEC,+93/105/EC+and+2000/21/EC.">Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC.</a> OJ. 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Publikationskosten für diesen Artikel wurden von MatTek Corporation, bezahlt.

Wir haben den Test auf Augenreizung (Abbildung 1), die für die EpiOcular Gewebemodell entwickelt wurde, vorgestellt. Das ETI ist in der Lage, die Augen reizenden und ätzenden Stoffen (GHS Kategorien 1 und 2 kombiniert) aus Materialien, die keine Kennzeichnung (GHS Keine Kategorie) mit hoher Sensitivität und Spezifität 17. Das EIT zu trennen, wie sie hier vorgestellt wird nicht zwischen GHS-Kategorie unterscheiden 1 von Kategorie 2 Chemikalien. Das EIT wurde für die Einstufung und Kennzeichnung von Augenreizungspotenzial von einer breiten Palette von Chemikalien, einschließlich kosmetischen und pharmazeutischen Inhaltsstoffen validiert. In Verbindung mit anderen in vitro-Tests wird das EIT als Ersatz für die in-vivo-Kaninchenaugenreiztest dienen. Das EIT verwendet zwei ähnliche, aber unterschiedliche Protokolle für flüssige und feste Materialien, die in der Länge der Exposition und der Nachbelichtung Inkubationszeiten (Figur 1) variieren. Die in der EIT verwendet Endpunktist die Lebensfähigkeit des Gewebes, durch das MTT-Assay, der zuvor in validierten menschlichen Epithelgewebe Modelle 20,21 verwendet wurde bestimmt. Um diesen Test durchzuführen, wird keine spezielle Ausrüstung neben Standard-Zellkultur Ausrüstung benötigt. Aufgrund der hohen Gewebe zu Gewebe Reproduzierbarkeit, n = 2 Geweben anstelle der Regel empfohlen, n = 3 verwendet. Der Fähigkeit zur Nutzung n = 2 Geweben ist ein kritischer Aspekt des Protokolls, denn sie erlaubt es einem erfahrenen Bediener, zwei Gewebe gleichzeitig zu verarbeiten, wodurch die Variabilität des Assays, die entstehen, minimiert aufgrund der unterschiedlichen Handhabung von einzelnen Tissues 14. Auch durch Verwendung von n = 2 Geweben pro Testartikel, die Reizwirkung von 10 Testsubstanzen der gleichen physikalischen Zustand (flüssig oder fest), zusammen mit den positiven und negativen Kontrollen, unter Verwendung von einem Satz (24 Gewebe) ausgewertet werden. Andere wichtige Punkte, die zuverlässige Klassifizierung von Materialien gewährleisten Spezifikationen für die positive Kontroll substance (Gewebeviabilität ≤50.0%), Reproduzierbarkeit zwischen doppelte Gewebe (Differenz &lt;20,0%) und negative Kontrolle OD-Ablesungen (&gt; 0,8 und &lt;2,5). Bei der Durchführung des EIT-Test, ist es wichtig, auf die validierten Protokoll und der vorgeschlagenen Dosierung und Spülen Pläne (Tabellen 3 und 4) zu halten, da Abweichung vom Protokoll oder Änderungen der Inkubationszeiten kann zu veränderten Ergebnissen führen. Ebenso werden Abweichungen von der 3 Stunden Zeit für MTT Inkubation in verschiedenen MTT Lesungen führen und Assay-Ergebnis auswirken. Gelegentlich kann eine Testchemikalie müssen optische oder andere Eigenschaften, die mit MTT Gewebelebensfähigkeitstest oder verursachen Reduktion von MTT stören können. Zum Beispiel kann eine Testchemikalie direkt MTT in blau-lila-Reaktionsprodukt, oder sie kann eine gefärbte Substanz, die Licht in der gleichen Größenordnung wie MTT Formazan (~ 570 nm) absorbiert werden. Allerdings werden diese Testchemikalien prESENT nur ein Problem, wenn zum Zeitpunkt des MTT-Tests, ist immer noch eine ausreichende Menge des Materials auf den heutigen (oder absorbiert) des Gewebes. Um diese Störungen zu vermeiden, sind umfangreiche Spülvorgänge in den EIT-Protokoll einbezogen. Wenn Spülen nicht entfernen Sie die TA und die TA stört MTT-Reduktion, müssen zusätzliche Kontrollen verwendet werden, zu erkennen und zu korrigieren ist. Kurz gesagt, wenn eine direkte MTT-Reduktion der Prüfsubstanz wird vermutet, 50 ul (oder 50 mg für Feststoffe) der betreffenden Chemikalie wird 3 h mit Arbeits MTT-Lösung bei SCC (NC 50 ul sterilem, entionisiertem Wasser inkubiert wird, sollte gleichzeitig laufen). Wenn der MTT Lösung blau-violett, ist der Testgegen vermutlich das MTT reduziert. In diesem Fall ist eine Funktionsprüfung mit gefrier getötet Gewebekontrollen durchgeführt werden sollte, um zu bewerten, ob das Testmaterial auf die Gewebebindung und zu einer falschen MTT-Reduktionssignal. Wenn es nennens MTT-Reduktion in der TA-ausgesetzt, getötet Gewebekontrolle(relativ zu der Menge bei der unbehandelten lebensfähiges Gewebe), muß die mittlere Gewebelebensfähigkeit des Testgegenstands durch Subtrahieren der mittleren Überlebensfähigkeit des getötet Steuerung korrigiert werden. Das EIT irrt auf der Seite der Sicherheit, wie durch die niedrige Inzidenz von falsch negativen Klassifikationen 14,15,18 gezeigt. Wichtig ist, dass keiner der GHS-Kategorie 1 Chemikalien, die ätzend auf die Augen sind und stellen den schwersten Augengefahr, wurden als nicht reizend in diesem Assay 14,15,18,19 klassifiziert. Schließlich ist einer der Hauptvorteile des RhCE in vitro-Testverfahren die Möglichkeit der Prüfung reine Flüssigkeit und festen Materialien (die nicht mit zweidimensionaler, untergetaucht Zellkulturen möglich ist). Das EIT wird bei der Bestimmung des Augenreizungspotenzial von einer breiten Palette von Materialien gemäß der UN GHS Einstufung und Kennzeichnung System einen wichtigen Beitrag. Der Ersatz von Tieren o bestimmen,sondere Toxizität ist seit vielen Jahren ein Ziel der toxikologischen Forschung. Das EIT Testmethode hat eine formelle Validierungsstudie durch EURL ECVAM unterstützt im Jahr 2014 abgeschlossen und die EpiOcular EIT wurde im Jahr 2015 in den Testleitlinien der OECD OECD TG 492 implementiert.

Consumer-Produkte wie Kosmetika, Wasch- und Reinigungsmitteln umfassen eine Vielzahl von Chemikalien, die schwere Schäden verursachen können, wenn sie Kontakt mit den Augen. Daher ist die Prüfung dieser Mittel zur Augenreizung durch die US- und EU-Aufsichtsbehörden erforderlich ist, um die Sicherheit der Verbraucher zu gewährleisten 1. Eine Bewertung der Augenreizung Potenzial der Mischungen und Formulierungen ist auch eine Voraussetzung für die Einhaltung der REACH (Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe) Rechtsvorschriften für die Etikettierung von kosmetischen Inhaltsstoffen im Rahmen der EU-Kosmetik-Richtlinie für den Transport von Chemikalien und für die Kennzeichnung von Pflanzenschutzmitteln und Haushaltsprodukte 2. Derzeit Aufsichtsbehörden verlangen, Augengefährdungsbeurteilung unter Verwendung des Global Harmonisierte System zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien (GHS) 3. GHS basiert hauptsächlich auf der Draize Augenreiztest basiert, die am weitesten verbreitete Augenreizung Assay, in dem Fremdstoffe und mixtures werden direkt in den Bindehautsack des Kaninchenauges 4 eingeleitet. Nach GHS-Einstufung, GHS-Kategorie 1 (augenverätzender) bezieht sich auf Chemikalien, die schwere anfänglichen Schädigung der Augengewebe oder schwere Schäden am Auge und Vision, die nicht innerhalb von 21 Tagen nach der Exposition 3,5 vollständig reversibel verursachen testen. GHS Kategorie 2 bezieht sich auf Chemikalien, die wesentlichen Änderungen des Auges, die innerhalb von 21 Tagen nach der Exposition vollständig reversibel sind produzieren zu testen. Testchemikalien, die keine korrosive oder Reizstoffe werden als GHS Keine Kategorie bezeichnet. Seit mehr als 40 Jahren hat sich die Kaninchenaugentest Draize für seinen Mangel an Reproduzierbarkeit, Überschätzung der menschlichen Reaktionen, und der Einsatz von lebenden Tieren 08.05 kritisiert worden. Diese Bedenken wurden viele Vorschläge zur Verfeinerung, Verringerung und Ersetzung der in-vivo-Test 9 gefördert. Der Bedarf an validierten ohne Tier Alternativen weiter gestärktdurch die Annahme der siebten Änderung der Kosmetik-Richtlinie, die die Verwendung von Tieren in die Sicherheitsbewertung kosmetischer Mittel (2005) verboten und Zutaten (in 2009) 2. Seit 1996 ist der rekonstruierte Cornea artigen Gewebemodell wurde in großem Umfang von der kosmetischen Industrie verwendet, um das Reizpotential der Rohstoffe, tensidhaltigen Formulierungen zu bewerten und compoundierten Mischungen, die zur Verwendung in ausgelegt sind, oder in der Nähe von, dem Auge 10-13. Die Nutzung der RhCE Gewebemodell ermöglicht die direkte topische Anwendung des Testmaterials auf die Gewebeoberfläche in seiner nativen, unverdünnt. Auf diese Weise können nicht-wasserlösliche Formulierungen, ohne sie mit Lösungsmitteln verdünnt getestet werden. Als Reaktion auf EURL ECVAM (EU-Referenzlabor Europäische Zentrum für die Validierung alternativer Methoden) Anforderung für eine breite Anwendung, einfache und wirtschaftliche Methode der Test auf Augenreizung (EIT), das eine singl nutzte Belichtungszeit und ist in der Lage, die Augen reizenden und ätzenden Stoffen aus Materialien, die nicht Kennzeichnung erfordern getrennt wurde (Abbildung 1) 14 entwickelt. Basierend auf den Ergebnissen für die 83 Chemikalien (44 Flüssigkeiten und 39 Feststoffe) erzielte das EIT 95.5 / 68.2 / und 81,8% Sensitivität / Spezifität und Genauigkeit (SS &amp; A) für Flüssigkeiten, 100,0 / 68,4 / 84,6% SS &amp; A für Feststoffe und 97,6 / 68,3 / 83,1% und für die gesamte SS &amp; A. Im Jahr 2007, ein Multi-Labor vor, eine Validierungsstudie durch Cosmetics Europe (ehemals Colipa) unter der Schirmherrschaft der EURL ECVAM gesponserte bewertet die Relevanz und Zuverlässigkeit des EIT mit dem Ziel, es zu formellen Validierung 15 bringen. In dieser Studie wurden 298 unabhängige Studien in sieben unabhängigen Labors durchgeführt. Die Ergebnisse der Studie zeigten 99,7% Zustimmung bei der Vorhersage mit niedrigen Variationskoeffizienten für alle teilnehmenden Laboratorien 15. Als Ergebnis im Jahr 2010 die EIT-Protokoll trat eine formelle EURL ECVAMValidierungsprogramm. Die Validierungsstudie verwendet 104 codierte Testchemikalien, einschließlich Einzelstoffe und Mischungen von Chemikalien, für die in-vivo-Referenzdaten (Draize-Augenreizungsdaten) zur Verfügung standen. Basierend auf dem Erfolg dieser Arbeit wurde ein OECD-Prüfrichtlinie Entwurf 2014 vorgelegt Es wird erwartet, dass das EIT wird wesentlich zur Einstufung von Augenreizungspotenzial von einer breiten Palette von Materialien gemäß der UN GHS Einstufung und Kennzeichnung Systems beitragen.

eye irritation test (eit) for hazard identification of eye irritating chemicals using reconstructed human cornea-like epithelial (rhce) tissue model

Um mit dem siebten Änderung der EU-Kosmetikrichtlinie und der EU-REACH-Verordnung zu erfüllen, sind validierte tierversuchsfreien Alternativmethoden für eine zuverlässige und genaue Bewertung der okulare Toxizität beim Menschen erforderlich. Um diesen Bedarf anzusprechen, haben wir eine Augenreizung (EIT), die ein dreidimensionales rekonstruiertes menschlichen Hornhaut artigen Epithelzellen (RhCE) Gewebemodells, die auf normalen menschlichen Zellen basiert, nutzt entwickelt. Das ETI ist in der Lage, die Augen reizenden und ätzenden Stoffen (GHS Kategorien 1 und 2 kombiniert) und jene, die keine Kennzeichnung (GHS Keine Kategorie) zu trennen. Der Test verwendet zwei getrennte Protokolle, eine für flüssige Chemikalien, und ein zweites, ähnliches Protokoll für feste Testartikel konzipiert. Das EIT Vorhersagemodell verwendet einen einzelnen Expositionszeit (30 min für Flüssigkeiten, 6 Stunden für Feststoffe) und eine einzelne Gewebelebensfähigkeit cut-off (60,0%, wie durch den MTT-Test bestimmt). Basierend auf den Ergebnissen für 83 Chemikalien (44 Flüssigkeiten und Feststoffen 39) EIT erreicht 95,5 / 68,2 / 81,8% sensitivity / Spezifität und Genauigkeit (SS &amp; A) für Flüssigkeiten, 100,0 / 68,4 / 84,6% und SS &amp; A für Feststoffe und 97,6 / 68,3 / 83,1% und für die gesamte SS &amp; A. Das EIT wird wesentlich zur Klassifizierung des Augenreizungspotenzial von einer breiten Palette von flüssigen und festen Chemikalien, ohne die Verwendung von Tieren zu regulatorischen Testanforderungen gerecht zu leisten. Die EpiOcular EIT-Verfahren wurde im Jahr 2015 in den OECD-Prüfungsrichtlinien als TG 492 implementiert.

Repräsentative EIT Ergebnisse mit 10 Testartikel (TA) und Negativ- und Positivkontrollen durchgeführt, sind in Tabelle 6 und Abbildung 3 dargestellt. Der OD = 1,31 für die NC entspricht 100% Gewebelebensfähigkeit, damit der PC (mittlere OD = 0,41) hatten relativen Gewebelebensfähigkeit von 31,2%. Wenn das EIT-Protokoll wurde in 15 gültigen unabhängigen Experimenten in 7 Labors unter Verwendung des flüssigen Exposition Protokoll und in 8 unabhängige gültige Versuche in 4 Labors, unter Verwendung der festen Exposition Protokoll durchgeführt, die durchschnittliche Gewebelebensfähigkeit für den PC mit der Flüssigkeit Protokoll betrug 36,4 ± 4,0 % bzw. 32,3 ± 6,4% in der Feststoff Protokoll. In allen Fällen waren die positiven Kontrollergebnisse unterhalb des Cut off-Wert von 60,0% 15. Wie in Figur 3, TA1, TA2, TA4, TA7 gezeigt und TA8 hatten Gewebelebensfähigkeiten&gt; 60,0% und wurden daher als &quot;NI&quot; klassifiziert. TA3, TA5, TA6, hatte TA9 und TA10 Gewebe Bewohnbarkeit X04; 60,0% und damit als &quot;I&quot; klassifiziert. Die Differenz der Gewebelebensfähigkeit zwischen doppelte Gewebe war &lt;20,0% für alle TAs mit Ausnahme von TA2. Daher Ergebnisse für alle Test Artikel, mit Ausnahme von TA2, wurden als &quot;qualifiziert&quot;, da sie alle EIT Akzeptanzkriterien (Abschnitt 10.2) erfüllt. Wegen der hohen Variabilität zwischen doppelte Gewebe für TA2 in der anfänglichen Experiment wurde ein zweites Experiment notwendig, qualifizierte EIT Ergebnisse zu erhalten. Das EIT Testverfahren wie hierin beschrieben, unter Verwendung der RhCE Gewebemodell wurde für die Bewertung der Augenreizung in mehreren multilaboratory Validierungsstudien, einschließlich der formellen Bestätigung durch EURL ECVAM / Cosmetics Europe 15,17-19 verwendet. In allen Studien wurde der EIT gezeigt reproduzierbar sein und konnte Chemikalien (beide Stoffe und Gemische) die Einstufung und Kennzeichnung für Augenreizungen oder schwere Augenschäden ac ohne eigenes korrekt zu identifizierenCording zu UN GHS 15,17-19. Das EIT Testverfahren erfüllt die Akzeptanzkriterien der Validation Management Group (VMG) für die Augenreizung für Sensitivität, Spezifität und Gesamtgenauigkeit und derzeit anhängig ist es formale Umsetzung als teilweiser Ersatz für die in vivo Kaninchen Draize-Test 19. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig1.jpg" /> Abbildung 1: Überblick über die EIT-Protokoll für flüssige und feste Testartikel verwendete Abkürzungen: AM, Assay-Medium;. SCC, Standardkulturbedingungen; PBS Dulbecco Phosphat-gepufferter Saline; RT Raumtemperatur. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig2.jpg" /> Abb. 2: Die standardisierte 96-Well-Platte-Konfiguration für das MTT Gewebeviabilität Test zwei 200 ul Aliquots sind train die entsprechenden Vertiefungen einer pre-markierten 96-Well-Platte nsferred. Verwendete Abkürzungen: NC, negative Kontrolle; PC, Positivkontrolle; TA1-TA20, Testartikel 20.01; Blank, Extraktionsmittellösung. 96- MTT Plattenkonfiguration ist mit Excel-Tabelle zur RhCE Gewebelebensfähigkeit und EIT Ergebnisse zu berechnen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig3.jpg" /> Abbildung 3: EIT-Ergebnisse für 10 Test Artikel, NC und PC-Steuerungen mit RHCE-Gewebemodell erhalten Die Grafik wird aus einer Excel-Tabelle zur EIT Ergebnisse zu präsentieren generiert.. Testchemikalien, die Lebensfähigkeit des Gewebes ≤ 60,0%, bezogen auf NC reduziert werden als Reizstoffe (&quot;I&quot;, TA3, TA5, TA6, TA9 und TA10) und Testchemikalien, die Lebensfähigkeit des Gewebes&gt; 60,0% werden als nicht-Reizstoffe eingestuft hatte (klassifiziert &quot; NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7 und TA8). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="7"> Startzeit für die EIT-Protokoll Arbeitsschritte (ein Tag der Arbeit für einen Operator) </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Jede Zeile entspricht einem Paar von Geweben </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reihenfolge der Schritte: </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Flüssigkeiten: </td><td> PBS </td><td> TA Belichtung </td><td> Post- Durchnässen </td><td> Post- <td> MTT Reaktion </td><td> MTT Extraktion </td><td> Maßnahme </td></tr><tr><td></td><td> 30 Minuten </td><td> 30 Minuten </td><td> 12 min </td><td> 120 min </td><td> 180 min </td><td> 120 min </td><td> OD </td></tr><tr><td> NC </td><td> 9.00 </td><td> 9.30 </td><td> 10.00 </td><td> 10.12 </td><td> 0.12 </td><td> 15.12 </td><td> nach </td></tr><tr><td> PC </td><td> 9.01 </td><td> 9.31 </td><td> 10.01 </td><td> 10.13 </td><td> 0.13 </td><td> 15.13 </td><td> 17.30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 9.02 </td><td> 9.32 </td><td> 10.02 </td><td> 10.14 </td><td> 0.14 </td><td> 15.14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 &lt;/ strong&gt; </td><td> 9.03 </td><td> 9.33 </td><td> 10.03 </td><td> 10.15 </td><td> 0.15 </td><td> 15.15 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 9.04 </td><td> 9.34 </td><td> 10.04 </td><td> 10.16 </td><td> 0.16 </td><td> 15.16 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 9.05 </td><td> 9.35 </td><td> 10.05 </td><td> 10.17 </td><td> 0.17 </td><td> 15.17 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 9.06 </td><td> 9.36 </td><td> 10.06 </td><td> 10.18 </td><td> 0.18 </td><td> 15.18 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 9.07 </td><td> 9.37 </td><td> 10.07 </td><td> 10.19 </td><td> 0.19 </td><td> 15.19 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 9.08 </td><td> 9.38 </td><td> 10.08 </td><td> 10.20 </td><td> 0.20 </td><td> 15.20 </td><td></td></tr><tr><td><stro<html> ng&gt; TA-8 </td><td> 9.09 </td><td> 9.39 </td><td> 10.09 </td><td> 10.21 </td><td> 0.21 </td><td> 15.21 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 9.10 </td><td> 9.40 </td><td> 10.10 </td><td> 10.22 </td><td> 0.22 </td><td> 15.22 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 9.11 </td><td> 9.41 </td><td> 10.11 </td><td> 10.23 </td><td> 0.23 </td><td> 15.23 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 3:. Beispiel Zeitplan für die Prüfung von flüssigen Testartikel Protocol Schritte einschließlich Vorbenetzung die Gewebe mit DPBS, Anwendung von Test-Artikel (TAS), Spülen und Post-tränken, Post-Inkubationszeit MTT-Test, Extraktion von MTT, und Messung der MTT OD in Spalten dargestellt. Zeiten für die Doppelgewebe in Reihen organisiert. Der gesamte Test Test 10 TAs und Kontrollen können in einem Tag abgeschlossen werden. e_content &quot;&gt; <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" height="439" width="582"><tbody><tr><td colspan="6"> Startzeit für das EIT Protokollschritte (2 Tage arbeiten für einen Operator) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Jede Zeile entspricht einem Paar von Geweben </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tag 1 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Tag 2 (am nächsten Tag) </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reihenfolge der Schritte: </td><td> 1 </strong&gt; </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Festkörper: </td><td> PBS </td><td> TA Belichtung </td><td> Post- Durchnässen </td><td> Post- Incubaction </td><td> MTT Reaktion </td><td> MTT Extraktion </td><td> Maßnahme </td></tr><tr><td></td><td> 30 Minuten </td><td> 6 Stunden </td><td> 26 min </td><td> 18 Stunden </td><td> 180 min </td><td> 120 min </td><td> OD </td></tr><tr><td> NC </td><td> 9.00 </td><td> 9.30 </td><td> 15.30 </td><td> 15.56 </td><td> 9.56 </td><td> 0.56 </td&gt; <td> nach </td></tr><tr><td> PC </td><td> 9.02 </td><td> 9.32 </td><td> 15.32 </td><td> 15.58 </td><td> 09.58 </td><td> 0.58 </td><td> 15.30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 9.04 </td><td> 9.34 </td><td> 15.34 </td><td> 16.00 </td><td> 10.00 </td><td> 13.00 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 </td><td> 9.06 </td><td> 9.36 </td><td> 15.36 </td><td> 16.02 </td><td> 10.02 </td><td> 13.02 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 9.08 </td><td> 9.38 </td><td> 15.38 </td><td> 16.04 </td><td> 10.04 </td><td> 13.04 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 9.10 </td><td> 9.40 </td><td> 15.40 </td><td> 16.06 </td><td> 10.06 </td><td> 13.06 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 9.12 </td><td> 9.42 </td><td> 15.42 </td><td> 16.08 </td><td> 10.08 &lt;/ td&gt; <td> 13.08 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 9.14 </td><td> 9.44 </td><td> 15.44 </td><td> 16.10 </td><td> 10.10 </td><td> 13.10 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 9.16 </td><td> 9.46 </td><td> 15.46 </td><td> 16.12 </td><td> 10.12 </td><td> 13.12 </td><td></td></tr><tr><td> TA-8 </td><td> 9.18 </td><td> 9.48 </td><td> 15.48 </td><td> 16.14 </td><td> 10.14 </td><td> 13.14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 9.20 </td><td> 09.50 </td><td> 15.50 </td><td> 16.16 </td><td> 10.16 </td><td> 13.16 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 9.22 </td><td> 9.52 </td><td> 15.52 </td><td> 16.18 </td><td> 10.18 </td><td> 13.18 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Beispiel-Zeitplan für die Prüfung von festen Testartikel. Protokoll Schritte einschließlich Vorbenetzung die Gewebe mit DPBS, Anwendung von Test-Artikel, Spülen und Post-tränken, Post-Inkubationszeit MTT-Test, Extraktion von MTT und Messung der MTT OD in Spalten dargestellt. Zeiten für die Doppelgewebe in Reihen organisiert. Der gesamte Test testet 10 TAs und Kontrollen über einen Zeitraum von zwei Tagen durchgeführt. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Höhe </td><td> Reagens </td><td> Lagerbedingungen </td><td> Ursprung </td><td> Bezeichnung </td><td> Ablaufdatum </td></tr><tr><td> 1 Flasche, 2 ml </td><td> MTT-Konzentrat (MTT-100-CON) </td><td> Unter Lichtschutz (-20 ° C) </td><td> MatTek </td><td> Gefrorene MTT-Konzentrat </td><td> 2 Monate </td></tr><tr><td> 1 Flasche, 8 ml </td><td> MTT Verdünnungs </td><td> 2-8 &amp;# 186; C </td><td> MatTek </td><td> Zum Verdünnen MTT Konzentrat vor der Verwendung in dem MTT-Assay verwenden </td><td> 2 Monate </td></tr><tr><td> 1 Flasche, 60 ml </td><td> Isopropanol (CAS # 67-63-0) </td><td> RT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Extraktionslösung </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabelle 5: MTT-100 Assay Kit Components. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Code N ° </td><td> Gewebe </td><td colspan="2"> Rohdaten </td><td colspan="2"> Blank korrigierten Daten </td><td rowspan="2"> Mittelwert der OD </td><td rowspan="2"> % Der Lebensfähigkeit </td></tr><tr><td></td><td> n </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td></tr><tr><td> NC </td><td>1 </td><td> 1,316 </td><td> 1,352 </td><td> 1,316 </td><td> 1,352 </td><td> 1,334 </td><td> 101,6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,277 </td><td> 1,309 </td><td> 1,277 </td><td> 1,309 </td><td> 1,293 </td><td> 98,4 </td></tr><tr><td> PC </td><td> 1 </td><td> 0,379 </td><td> 0,397 </td><td> 0,379 </td><td> 0,397 </td><td> 0,388 </td><td> 29,6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,419 </td><td> 0,442 </td><td> 0,419 </td><td> 0,442 </td><td> 0,431 </td><td> 32,8 </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1 </td><td> 1,213 </td><td> 1,244 </td><td> 1,213 </td><td> 1,244 </td><td> 1,229 </td><td> 93,5 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 103,2 </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 1 </td><td> 1,210 </td><td> 1,122 </td><td> 1,210 </td><td> 1,122 </td><td> 1,166 </td><td> 88,7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,833 </td><td> 63,4 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 1 </td><td> 0,167 </td><td> 0,168 </td><td> 0,167 </td><td> 0,168 </td><td> 0,167 </td><td> 12,7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,138 </td><td> 0,136 </td><td> 0,138 </td><td> 0,136 </td><td> 0,137 </td><td> 10.4 </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1 </td><td> 1,137 </td><td> 1,160 </td><td> 1,137 </td><td> 1,160 </td><td> 1,149 </td><td> 87,4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,262 </td><td> 1,191 </td><td> 1,262 </td><td> 1,191 </td><td> 1,227 </td><td> 93,4 </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 1 </td><td> 0,610 </td><td> 0,621 </td><td> 0,610 </td><td> 0,621 </td><td> 0,616 </td><td> 46,9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,480 </td><td> 0,484 </td><td> 0,480 </td><td> 0,484 </td><td> 0,482 </td><td> 36,7 </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 1 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0,508 </td><td> 38,7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,396 </td><td> 0,407 </td><td> 0,396 </td><td> 0,407 </td><td> 0,402 </td><td> 30,6 </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1 </td><td> 1,048 </td><td> 1.050 </td><td> 1,048 </td><td> 1.050 </td><td> 1,049 </td><td> 79,9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,149 </td><td> 1.150 </td><td> 1,149 </td><td> 1.150 </td><td> 1.150 </td><td> 87,5 </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 1 </td><td> 1,032 </td><td> 1,034 </td><td> 1,032 </td><td> 1,034 </td><td> 1,033 </td><td> 78,7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,941 </td><td> 0,935 </td><td> 0,941 </td><td> 0,935 </td><td> 0,938 </td><td> 71,4 </td></tr><tr><td> TA9 </td&gt; <td> 1 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,144 </td><td> 0,149 </td><td> 0,144 </td><td> 0,149 </td><td> 0,147 </td><td> 11.2 </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 1 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 11.4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,254 </td><td> 0,255 </td><td> 0,254 </td><td> 0,255 </td><td> 0,255 </td><td> 19,4 </td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> bedeuten </td><td> Dif. </td><td> Mittelwert </td><td> Dif. </td><td> Dif. / 2 </td><td colspan="2"> Klassifikation </td></tr><tr><td></td><td> der OD </td><td> der OD </td><td> Bewohnbarkeit [%] </td><td> der Bewohnbarkeit </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NC </td><td> 1,314 </td><td> 0,041 </td><td> 100,0 </td><td> 3.12 </td><td> 1.56 </td><td> NI </td><td> qualifiziert </td></tr><tr><td> PC </td><td> 0,410 </td><td> 0,043 </td><td> 31,2 </td><td> 3.23 </td><td> 1.62 </td><td> ICH </td><td> qualifiziert </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1,292 </td><td> 0,127 </td><td> 98,3 </td><td> 9.63 </td><td> 4.81 </td><td> NI </td><td> qualifiziert </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 0,999 </td><td> 0,333 </td><td> 76,1 </td><td> 25,36 </td><td> 12.68 </td><td> NI </td><td> D&gt; 20 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 0,152 </td><td> 0,030 </td><td> 11,6 </td><td> 2.32 </td><td> 1.16 </td><td> ICH </td><td> qualifiziert </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1,188 </td><td> 0,078 </td><td> 90,4 </td><td> 5.94 </td><td> 2.97 </td><td> NI </td><td> qualifiziert </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 0,549 </td><td> 0,134 </td><td> 41,8 </td><td> 10,16 </td><td> 5.08 </td><td> ICH </td><td> qualifiziert </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 0,455 </td><td> 0,106 </td><td> 34,6 </td><td> 8.07 </td><td> 4.03 </td><td> ICH </td><td> qualifiziert </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1.100 </td><td> 0,101 </td><td> 83,7 </td><td> 7.65 </td><td> 3.82 </td><td> NI </td><td> qualifiziert </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 0,986 </td><td> 0,095 </td><td> 75,0 </td><td> 7.23 </td><td> 3.62 </td><td> NI </td><td> qualifiziert </td></tr><tr><td> TA9 </td><td> 0,085 </td><td> 0,125 </td><td> 6.4 </td><td> 9.48 </td><td> 4.74 </td><td> ICH </td><td> qualifiziert </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 0,203 </td><td> 0,105 </td><td> 15,4 </td><td> 7.95 </td><td> 3.98 </td><td> ICH </td><td> qualifiziert </td></tr></tbody></table> Tabelle 6:. Für 10 Testartikel erhalten EIT Ergebnisse, NC und PC-Steuerungen Die Tische sind proddurch eine Excel-Tabelle entworfen, um die Lebensfähigkeit des Gewebes und EIT Ergebnisse zu berechnen uced. Testchemikalien, die Lebensfähigkeit des Gewebes ≤ 60,0%, bezogen auf NC reduziert werden als Reizstoffe (&quot;I&quot;, TA3, TA5, TA6, TA9 und TA10) und Test-Chemikalien, die Lebensfähigkeit des Gewebes&gt; 60,0% werden als nicht-Reizstoffe eingestuft hatte (klassifiziert &quot; NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7 und TA8).

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Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Wir haben einen Test auf Augenreizung, die einen dreidimensionalen rekonstruierten menschlichen Hornhaut artigen Epithelzellen (RhCE) Gewebemodell nutzt entwickelt. Der Test ist in der Lage, zwischen den Augenreizstoffes und ätzende Stoffe (GHS Kategorien 1 und 2 kombiniert) und diejenigen, die nicht die Kennzeichnung (GHS Keine Kategorie) erfordern, zu unterscheiden.

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

eye-irritation-test-eit-for-hazard-identification-eye-irritating

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

37.2K Aufrufe.  MatTek Corporation.  Wir haben einen Test auf Augenreizung, die einen dreidimensionalen rekonstruierten menschlichen Hornhaut artigen Epithelzellen (RhCE) Gewebemodell nutzt entwickelt. Der Test ist in der Lage, zwischen den Augenreizstoffes und ätzende Stoffe (GHS Kategorien 1 und 2 kombiniert) und diejenigen, die nicht die Kennzeichnung (GHS Keine Kategorie) erfordern, zu unterscheiden. 

Serie: Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Forschung

Biotechnik

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Tissue Engineering eines Menschen 3D<em&gt; In-vitro-</em&gt; Tumor-Testsystem

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as Aniridia or Steven Johnson Syndrome as well as by external factors such as chemical burns or radiation. Current treatments are (i) the use of corneal grafts and (ii) the use of stem cell expanded in the laboratory and delivered on carriers (e.g., amniotic membrane); these treatments are relatively successful but unfortunately they can fail after 3-5 years. There is a need to design and manufacture new corneal biomaterial devices able to mimic in detail the physiological environment where stem cells reside in the cornea. Limbal stem cells are located in the limbus (circular area between cornea and sclera) in specific niches known as the Palisades of Vogt. In this work we have developed a new platform technology which combines two cutting-edge manufacturing techniques (microstereolithography and electrospinning) for the fabrication of corneal membranes that mimic to a certain extent the limbus. Our membranes contain artificial micropockets which aim to provide cells with protection as the Palisades of Vogt do in the eye.

We report a technique for the fabrication of micropockets within electrospun membranes in which to study cell behavior. Specifically, we describe a combination of microstereolithography and electrospinning for the production of PLGA (Poly(lactide-co-glycolide)) corneal biomaterial devices equipped with microfeatures.

Kombination von Mikrostereolithographie und Elektrospinnen auf Membranen Ausgestattet mit Nischen für die Hornhautregeneration Produzieren

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

Bewertung der Leukozyten-Endothel-Interaktionen unter Strömungsbedingungen in einem<em&gt; Ex vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, typically via intravitreal injections. Encapsulated cells expressing the biologic of choice are becoming a tool for local protein production and release (e.g., via long-term drug delivery). In addition, encapsulation systems utilize permeable materials that allow diffusion of nutrients, waste, and therapeutic factors into and out of cells. This occurs while masking the cells from the host immune response, avoiding the need for suppression of the host immune system. This protocol describes the use of alginate as a polymer in microencapsulation coupled with the electrospray method as a microencapsulation technique. ARPE-19 cells, a spontaneously arising human RPE cell line, has been used in long-term cell therapy experiments due to its lifetime functionality, and it is used here for encapsulation and delivery of the capsules to mouse eyes. The manuscript summarizes the steps for cell microencapsulation, quality control, and ocular delivery.

Presented here is a protocol for the use of alginate as a polymer in microencapsulation of immortalized cells for long-term delivery of biologics to rodent eyes.

Gekapselte Zelltechnologie für die Lieferung von Biologika an das Mausauge

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is deleterious for the cells as it reduces their ability to form a mature and functional layer. Here, we present a method for establishing and subculturing human and sheep corneal endothelial cell cultures that minimizes the loss of cell-to-cell contact. Explants of corneal endothelium/Descemet&#39;s membrane are taken from donor corneas and placed into tissue culture under conditions that allow the cells to collectively migrate onto the culture surface. Once a culture has been established, the explants are transferred to fresh plates to initiate new cultures. Dispase II is used to gently lift clumps of cells off tissue culture plates for subculturing. Corneal endothelial cell cultures that have been established using this protocol are suitable for transferring to biomaterial membranes to produce tissue-engineered cell layers for transplantation in animal trials. A custom-made device for supporting biomaterial membranes during tissue culture is described and an example of a tissue-engineered graft composed of a layer of corneal endothelial cells and a layer of corneal stromal cells on either side of a collagen type I membrane is presented.

This protocol describes the critical steps required to establish and grow corneal endothelial cell cultures from explants of human or sheep tissue. A method for subculturing corneal endothelial cells on membranous biomaterials is also presented.

Wachstum von Human- und Schafhornhaut-Endothelzellschichten auf Biomaterialmembranen

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Kultivierung einer dreidimensional rekonstruierten menschlichen Epidermis im großen Maßstab

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

Quantifizierung der Fibrillar Collagen Organisation mit Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such as the cornea and conjunctiva. While therapeutic effects and pharmacokinetics of the drugs upon subconjunctival injection have been described in some studies, very few assess the ocular distribution of drugs or drug delivery systems (DDS). The latter is critical for the optimization of intraocular DDS design and drug bioavailability to achieve the desired ocular localization and duration of action (e.g., acute versus. prolonged). This study establishes the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to qualitatively study the ocular distribution of fluorescent liposomes in real-time in live mice after sub-conjunctival injection. Being designed for in vivo visual inspection of tissues at the microscopic level, this is also the first full description of the CLM imaging method to study spatio-temporal distribution of injectables in the eye after subconjunctival injection.

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

We present a protocol for the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to non-invasively study the spatio-temporal distribution of liposomes in the eye after subconjunctival injection.

Räumlich-zeitliche In-vivo-Bildgebung von okulären Wirkstoffabgabesystemen mittels faseroptischer konfokaler Lasermikroendoskopie

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Isolierung und Kultur primärer humaner Zahnfleischepithelzellen mit Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...