Bandscheibendegeneration führt zu einem hohen Grad an Beeinträchtigungen und Schmerzen. Unser Protokoll ermöglicht es uns, die Bandscheibenentwicklung und ihre Veränderungen in der Degeneration morphologisch zu untersuchen. Das dichte Kollagen-Typ-Eins-Netzwerk macht es normalerweise schwierig, die Bandscheibe durch Mikroskopie zu analysieren.
Mit dem optischen Schnitt können wir die 3D-Anordnung der Chondrozyten innerhalb der verschiedenen Gewebe untersuchen. Beginnen Sie mit der Platzierung intraoperativ erhaltener Bandscheiben- oder IVD-Proben in DMEM, ergänzt mit 2 Volumenprozent Penicillin-Streptomycin und 1,2 Volumenprozent Volumen Amphotericin B, unmittelbar nach der Entnahme, lagern IVD-Proben bei vier Grad Celsius bis zur weiteren Verarbeitung. Bei gefrorenem Auftauen der menschlichen IVD-Proben bei Raumtemperatur und Identifizierung des Ursprungs des menschlichen IVD-Gewebes anhand mikroskopischer Eigenschaften wie College-Dichte und -Orientierung.
Um das Bandscheibengewebe zu sammeln, nehmen Sie das Bewegungssegment, das aus der IVD mit ihren beiden benachbarten Wirbeln besteht, und sezieren Sie mit einer chirurgischen Klinge Nummer 15 die gesamte Rinderscheibe vom subchondralen Knochen, drehen Sie die Bandscheibe um, um die zentrierten Bereiche zu erreichen. Nachdem Sie die verschiedenen Bereiche des Knorpels identifiziert haben, verwenden Sie eine chirurgische Klinge Nummer 20 oder 22, um den interessierenden Bereich aus der gesamten Bandscheibe auszuschneiden. Die IVDs von Rinderembryonen mit einer Kronen-Rumpf-Länge von weniger als 20 Zentimetern sollten ohne Dissektion verarbeitet werden.
Durchgeführte Entkalkung des Gewebes wie im Manuskript beschrieben. Bestätigen Sie eine erfolgreiche Entkalkung, wenn eine 20-Gauge-Nadel das Bandscheibengewebe oder gegebenenfalls die Wirbel ohne nennenswerten Widerstand durchdringt. Exaktieren Sie die Gewebeproben im zehnfachen Volumen von 4% iger Formaldehydlösung in PBS über Nacht bei vier Grad Celsius.
Legen Sie das Gewebe am nächsten Tag in ein wasserlösliches Einbettungsmedium auf den Kryotomenknopf, so dass normalerweise entweder eine axiale Ebene oder eine Ebene erzeugt wird, die senkrecht den Kollagentyp eins schneidet. Verwenden Sie das Standard-Kryotom, um das eingebettete Gewebe mit einer Dicke von 70 Mikrometern in menschlichen Proben und 40 Mikrometern in Rinderproben zu schneiden. Sammeln Sie die Abschnitte auf einem Glasobjektträger, bevor Sie die Abschnitte dreimal mit PBS spülen, fügen Sie einen geeigneten Fluoreszenzfarbstoff hinzu, gefolgt vom Montagemedium, und bedecken Sie die Abschnitte mit einem Abdeckschein.
Legen Sie einen Objektträger mit einem Fleckengewebeschnitt auf den Probenhalter des Blütenstandsmikroskops, indem Sie das Strukturbeleuchtungsgerät starten, um eine Einzelfeldbildbildgebung mit Fluoreszenzfiltern und ausreichender Beleuchtung durchzuführen. Verwenden Sie eine Bildoptimierungssoftware, die mit dem Blütenstandsmikroskop kompatibel ist, und verarbeiten Sie die Bilder, indem Sie die Intensität und Helligkeit optimieren. Um den Abschnitt als Ganzes zu visualisieren, verwenden Sie die Mosaikbildgebungstechnik, indem Sie die 60-Erfassungseinstellungen im Symbolleistenfenster öffnen und die Mosaikeinstellungen im Mosaikregister anpassen.
Definieren Sie dazu die Anzahl der Spalten und Zeilen von Sichtfeldbildern, die später zu einem Übersichtsbild zusammengeführt werden sollen, drücken Sie setup und passen Sie die Fokuskorrektur einzelner Kacheln an. Nachbearbeitung der Bilder durch Optimierung der Intensität und Helligkeit. Um die räumliche Chondrozytenorganisation zu analysieren, verwenden Sie die in der Software integrierte 3D-Funktion, indem Sie die Z-Stack-Einstellungen mit der Start/Stopp-Taste anpassen, die Scanparameter wie die Start- und Stopppositionen in der Z-Achse und den Slice-Abstand definieren.
Identifizieren Sie einzelne zelluläre Muster und verwenden Sie ein Zellzähl-Plugin für die quantitative Analyse der zellulären Muster, berechnen Sie die Zelldichte, indem Sie die gezählten Zellen durch die Größe der ausgewählten Region von Interesse teilen. Die Architektur des IVD mit seinem dichten Kollagenfasernetzwerk im Ring und dem weicheren Kern ist in den Mosaikbildern der axialen und sagittalen Ebene zu erkennen. In vergrößerten Bereichen aus den Mosaikbildern wurden unterschiedliche räumliche Organisationsmuster von Chondrozyten wie Einzelzellen, Paare und Strings bemerkt.
Die Untersuchung verschiedener Entwicklungs- und Reifestadien der Rinderringfibrose zeigte eine kontinuierliche Abnahme der Zelldichte während der Embryonalscheibenentwicklung. Auf der anderen Seite wurden eine zunehmende Zelldichte und Clusterbildung in der erwachsenen menschlichen Bandscheibe während der Degeneration beobachtet. Die Zelldichte in den frühen Stadien der IVD-Entwicklung in der Rinderringfibrose und im Rinderkern pulposus nahm bis zur Geburt rapide ab.
Durch die Kanalbildgebung des IVD mit dem Epitom ermöglichte die Visualisierung der 3D-Architektur der räumlichen Muster wie Zytoplasma und Zellkern, in der intakten IVD wurden sowohl Einzel- als auch Chondrozytenpaare gesichtet. Während im degenerierten Anulus Zellhaufen gefunden wurden. Der schwierigste Teil besteht darin, das Gewebe seinem Ursprung zuzuordnen und das Eingebettete für den Schnitt zu korrigieren.
Dies ist unerlässlich, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Nachdem wir IVD-Gewebe aus verschiedenen Stadien und Ursprüngen korrekt seziert und ausgewählt haben, können wir die Analyse durch weitere biochemische und biomechanische Analysen wie ELISA oder Rasterkraftmikroskopie vertiefen.
