A.F.-P. was supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No.2015165336. N.V.M was supported by grants from the NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838), and the March of Dimes (#5-FY14-203). We acknowledge Young-Jae Nam, Christina Lubczyk, and Minoti Bhakta for their important contributions to protocol development and data analysis. We also thank John Shelton for valuable technical input and members of the Munshi lab for scientific discussion.

Alle experimentellen Verfahren Tier Praktiken beteiligt sind, wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee am UT Southwestern Medical Center genehmigt. 1. Isolierung von HCN4-GFP E12,5 embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) <ol><li> Richten Sie zeitlich Paarungen zwischen homozygot HCN4-GFP Männchen und CD-1-Weibchen. </li><li> Sacrifice schwangere Frau bei E12,5 von Kohlendioxid Euthanasie und anschließende Zervikaldislokation. <ol><li> Entfernen Sie Gebärmutterhörner mit Pinzette als 22 zuvor beschrieben, 23, und legen Sie sie in eine Petrischale auf Eis mit 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Ca 2+ oder Mg 2+. </li></ol></li><li> Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in der Gewebekultur Haube steril Technik. <ol><li> Entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter und Fruchtblase Schere und Pinzette. Halten Sie die Plazenta für eine bessere Handhabung angebracht. pregnant CD-1 Weibchen normalerweise Geburt zwischen 10 und 14 Welpen geben. </li><li> Mit einer Pinzette zu sezieren, nehmen die isolierten Embryonen und sie schnell zweimal in 70% spülen (v / v) EtOH. HINWEIS: Die Wäschen sollte schnell sein Zelltod zu minimieren. </li><li> Entfernen Sie den Kopf, Gliedmaßen, Schwanz und innere Organe, darunter das Herz aus den isolierten Embryonen. </li><li> Legen Sie das verbleibende Gewebe in einem 10-cm - Schale mit 1 ml 1x PBS und fein zerkleinern und eine sterile Rasierklinge auf etwa 1 mm 3 in der Größe verwendet wird . </li><li> Übertragen zerkleinerte Gewebe in ein 50 ml konisches Röhrchen mit PBS. </li><li> Spin bei 300 g für 3 min. aspirieren vorsichtig überschüssige PBS. </li><li> 1 mL steriler 0,25% Trypsin-EDTA pro Embryo. Inkubiere Zellen in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. Vorsichtig mischen das Rohr alle 4 Minuten. Über Verdauung des Gewebes wird die Ausbeute deutlich niedriger. </li><li> Vortex Zellmischung bei maximaler Geschwindigkeit (3200 rpm) für 4 s. </li><li> In 2 ml Fibroblasten-Medien pro Embryo und mischen. Filter turch einen 100 um Zellsieb mit einer Pipette die Zellen durch das Sieb zu unterstützen. Siehe Tabelle 1 für die Formulierung alle nachfolgenden Medien. </li><li> Spin bei 300 g für 4 min. Sorgfältig absaugen Überstand. </li><li> In 10 ml frischem Fibroblasten-Medien pro 3 Embryonen und verreiben 6-10 mal. </li><li> Platte, die die Zellen in 1 15 cm Gewebekulturschale für alle 3 Embryonen hergestellt. Kultur über Nacht in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Nach der Inkubation über Nacht ersetzen Sie die Medien mit frischen 30 ml Medium pro Platte. Legen Zellen wieder in den Inkubator über Nacht. HINWEIS: Überprüfen Sie für HCN4-GFP + Zellkontamination unter einem Fluoreszenzmikroskop. Die Kultur sollte GFP sein - und nur werden GFP + auf Neuprogrammierung. </li><li> Am nächsten Tag Ernte Zellen mit 3 ml frischem vorgewärmten 0,25% Trypsin-EDTA. Graf und Gefrierzellen. Typischerweise gefrier Zellen bei 3 x 10 6 Zellen pro mL. Die erwartete yield sollte 3 x 10 6 Zellen pro Embryo sein. </li></ol></li></ol> 2. Retrovirus Produktion und Reprogrammierung Achtung: Das folgende Protokoll erfordert die Herstellung und Handhabung von infektiösen Retroviren. Führen Sie die folgenden Schritte in einem Biosafety Level 2 Schrank unter BSL-2-Richtlinien und sterile Technik. Verwenden Sie 10% Bleiche aller Materialien zu entsorgen ausgesetzt Retroviren. <ol><li> Retrovirus - Produktion und MEF Vorbereitung HINWEIS: Das folgende Protokoll ist für die retrovirale Produktion in 6-Well-Platten und MEF-Infektion in 24-Well-Platten. Für andere Formate finden Sie in Tabelle 2. MEFs sind an Tag -1 überzogen, so dass das Timing abgestimmt für jedes Experiment in geeigneter Weise werden müssen (siehe Abschnitt 2.3 und Abbildung 2). <ol><li> Pflegen Plat-E (PE) Zellen gemäß den Empfehlungen des Herstellers. In Kürze, Kultur PE-Zellen in DMEM mit 10% FBS ergänzt, 1 &amp; mgr; g / mL puromycin, 10 ug / ml Blasticidin, Penicillin und Streptomycin. Passage Zellen 1: 4 alle zwei Tage, wenn die Kultur 70-90% Konfluenz erreicht. </li><li> Tag -2: Am Tag vor der Transfektion Samen Plat-E - Zellen bei 1 × 10 6 Zellen / Vertiefung auf einer 6-Well - Platte in Transfektionsmedien. Zellen sollten 70-80% konfluent zum Zeitpunkt der Transfektion werden. </li></ol></li><li> Transfektion Kommerzielle Transfektionsagens verwenden. HINWEIS: Die kommerziellen Reagenzien bei Raumtemperatur (RT) vor der Transfektion sein sollte. Für die DNA - Transfektion, für jede retrovirale Plasmid - DNA einzeln (G, H, M und T) 9 einen GHMT Cocktail zu bilden. <ol><li> Tag -1: In einem 15 ml konischen Polystyrolröhrchen, mischen 60 ul reduziert Serum - Medien mit 6 ul Transfektionsreagenz pro Reaktion für eine 6-Well - Plattenformat. Inkubieren der Mischung für 5 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Da das Transfektionsreagenz hier bindet an Kunststoffen, eindirekt mit dem reduzierten Serummedien dd jede Abnahme der Transfektionseffizienz zu vermeiden. </li><li> In insgesamt 2 ug GHMT Cocktail pro Reaktion und klopfen Sie leicht zu mischen. Nicht mit dem Vortex. Inkubieren der Reaktion für 15 min bei RT. </li><li> In der Mischung aus Schritt 2.2.3 an die PE-Zellen in einer tropfenweise Art und Weise. </li><li> Inkubieren der transfizierten Plat-E - Zellen über Nacht in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. Notieren Sie sich die Zeit der Transfektion. </li></ol></li><li> Seeding von HCN4-GFP embryonalen Maus - Fibroblasten. <ol><li> 1 h vor MEFs Plattierung, eine 24-Well-Platte für Immunzytochemie vorzubereiten. <ol><li> Fügen Sie eine 12 mm Fibronektin Deckglas pro Vertiefung. </li><li> Coat Vertiefungen mit 300 &amp; mgr; l Rinderkollagenlösung (zB surecoat) und Inkubation in einem 37 ° C Inkubator für 1 h. </li><li> Absaugen Beschichtungslösung unmittelbar vor der MEF-Beschichtung. </li></ol></li><li> Tauen Sie eine gefrorene Fläschchen HCN4-GFP MEFs und waschen x1 mit vorgewärmten fibroblast Medien bei 500 xg für 5 min. </li><li> Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen Trypanblau-Ausschluss oder ähnliche Farbstoffe verwendet. Berechne die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml Kultur mit der folgenden Formel: % Lebenden Zellen = [1,00 - (Anzahl der blauen Zellen / Anzahl der gesamten Zellen)] x 100 <ol><li> Berechnen Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen unter Verwendung der folgenden Formel: Lebensfähige Zellen =% lebende Zellen x Verdünnungsfaktor x 10.000 x Gesamtvolumen der Zellsuspension </li></ol></li><li> Seed 3 x 10 4 Zellen pro Vertiefung auf eine Platte mit 24 Vertiefungen mit zuvor hergestellten Rinder - Kollagen - Lösung-Fibronektin Deckglas. </li></ol></li><li> Transduction und Reprogrammierung von MEFs HINWEIS: Nach den Notizen des Herstellers richtig gepflegt Plat-E - Zellen produzieren einen durchschnittlichen Titer von 1 x 10 7 Infektion Einheiten / ml. Obwohl die Titer nicht direkt für jedes Experiment gemessen wird, wird ein GFP Steuerung immer als Surrogat für Infektionseffizienz enthalten.Hohe GFP - Expression und Intensität (GFP +&gt; 95%) korreliert typischerweise mit erfolgreichen GHMT-vermittelte Erzeugung von iCLMs. <ol><li> Tag 0: 24 h nach der Transfektion, filtern das PE Medium retroviralen durch einen 0,45 &amp; mgr; m Porengröße Tensid freie Celluloseacetat - Filter und in ein 15 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen Polybren bis zu einer Endkonzentration von 8 &amp; mgr; g / mL. Sorgfältig Zellen mit 2 ml frischem Transfektionsmediums aufzufüllen. Hinweis: Zellen leicht von der Platte lösen, wenn Medien zu schnell geändert wird. </li><li> Saugen Sie das Medium der kultivierten MEFs und fügen Sie den frisch retroviralen Medium gesammelt; es sollte 1,7 ml Medium pro Well einer 6-Well-Platte ergeben. In ~ 800 &amp; mgr; l pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Zurück MEF Platte in den Inkubator und über Nacht inkubiert. </li><li> Tag 1: Wiederholen Sie die Schritte 2.4.1 und 2.4.2. Entsorgen Sie Zellen nach der 2. Virussammlung. Zurück infizierten MEFs in den Inkubator und lassen Sie sie über Nacht ruhen. </li><li> Tag 2: 48 h nach der Induktion, aspirieren die Zelle konditionierten Medien und Wasch x1 mit 1x PBS. In 500 ul vorgewärmt icLm Medien pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. </li><li> Ersetzen icLm Medien alle 2 - 3 Tage. Prozessplatte 14 Tage nach der viralen Induktion für Immunzytochemie (ICC) Analyse der kardialen Neuprogrammierung. </li></ol></li></ol> 3. Immunfärbung von Reprogrammed MEFs <ol><li> 14-Tage nach der Induktion, aspirieren sorgfältig die Medien. </li><li> Spülen Sie jede Vertiefung mit 300 &amp; mgr; l eiskaltem 1x PBS. Absaugen überschüssige Lösung. </li><li> Fix-Zellen mit 250 &amp; mgr; l von 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Inkubiere 15 Minuten bei RT. HINWEIS: - 2 Wochen vor Anfärbung Fixierte Zellen können 1 in PBS bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Permeabilisierung Zellen durch Waschen Brunnen x3 mit 300 &amp; mgr; l 0,1% PBS-Triton X 100 (PBST). Inkubieren 5 min bei RT zwischen Wäschen. überschüssige Lösung nach dem letzten Wasch absaugen. </li><li> Block 10min bei RT mit 1x Universal-Block-Puffer bei 300 &amp; mgr; l / Vertiefung. </li><li> Bereiten Sie (ICC) Färbepuffers: 1: 1 von 1x PBS und 1x Universal-Blocking-Puffer. Verdünnen primäre Antikörper in ICC Färbepuffers und Inkubation Antikörper über Nacht bei 4 ° C. Weitere Informationen sind dem Abschnitt empfohlenen Verdünnungen. <ol><li> Stain ein Schienenpaar mit Maus α-Actinin, Huhn αGFP und Kaninchen NPPA für iPM und iAM Identifikation. </li><li> Stain ein Schienenpaar mit Maus α-Actinin, Huhn αGFP und Kaninchen Myl2 für iPM und iVM Identifikation. </li></ol></li><li> Am folgenden Tag waschen Brunnen x3 mit 300 &amp; mgr; l 0,1% PBST. Inkubieren 5 min bei RT zwischen Wäschen. überschüssige Lösung nach dem letzten Wasch absaugen. </li><li> Bereiten Sie die sekundären Antikörper-Verdünnungen in ICC Färbepuffers. Weitere Informationen sind dem Abschnitt empfohlenen Verdünnungen. Inkubieren Sekundärantikörper 1 h bei RT, vor Licht geschützt. <ol><li> Stain alle Folien mit den folgenden sekundären antibodies: Maus Alexa-555, Huhn Alexa-488, und Kaninchen Alexa-647. </li></ol></li><li> Waschen Sie Brunnen x3 mit 300 &amp; mgr; l 0,1% PBST. Inkubieren 5 min bei RT zwischen Wäschen. Vor Licht schützen. </li><li> Fügen 2,4 ul Eindeckmedien enthaltend 1,5 &amp; mgr; g / ml 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in ein Glasobjektträger. Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas aus dem Brunnen der 24-Well-Platte, entfernen Sie überschüssige Lösung und Transfer zum Glasträger mit Montage Medien. Drücken Sie vorsichtig das Deckglas überschüssiges Volumen und Luft zu entfernen. </li><li> Seal Folien mit bevorzugten Nagellack oder Kunststoff Versiegelung. Shop gerahmte Dias bei 4 ° C vor Licht geschützt. </li></ol> 4. Identifizierung von Cardiac-Formationsglieder mittels konfokaler Mikroskopie HINWEIS: Für die Bildgebung, ein konfokales Mikroskop mit mindestens zwei Fluoreszenzdetektoren der Lage spektralen Detektion bei 405, 488, 555 und 639 nm Wellenlängen erforderlich ist, um IPMS, IAMS und IVMS zu identifizieren. Image-Zellen ein Plan-Apochromat 20x / 0,75 Ziel oder besser verwenden. Mit Hilfe der Bildanalyse-Software des Herstellers, Scannen Zoom-Bilder 40X-Ölkapselung Bildqualität erreichen können. <ol><li> Bildarchiv: Nehmen Sie 8-Bit-Bilder mit DAPI, Alexa-488, Alexa-555 und Alexa-647-Kanäle (ch.). Pixel Verweilzeit von 6 s, 1024 Rahmengröße, Zeilen Schritt bei 2, und Mitteln von 2 reicht für hochauflösende Bilder. </li><li> Für jede Folie, die von einem Rand beginnen und Scannen nach oben und unten in der roten Fluoreszenzkanal (ch.) Zur α-Actinin + Sarkomer + Zellen (Siehe 3 und 5A Beispiele Abbildung). Sarkomers Riefen sind leichter zu visuell in der 555 nm Wellenlänge zu identifizieren. <ol><li> Sobald ein α-Actinin + Sarkomer + Zelle identifiziert wurde, wechseln Sie in den grünen ch. und merken, wenn es positiv ist (ipm). Wechseln Sie auf dem Computer mit dem fernen Rot 647 ch zu beurteilen. (IAM oder iVM). HINWEIS: Die Zellen, dieα-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - als IPMS bezeichnet. GFP - Expression wird in der gesamten Zelle (4A) gesehen werden. </li><li> Stain Dias mit α-Actinin (Maus-Alexa555), HCN4-GFP (Huhn-Alexa488), NPPA (Kaninchen-Alexa647) und DAPI. Zellen , die α-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP sind - / NPPA + sind iAM. NPPA Färbung erscheint perinukleäre und punctata (4B). </li><li> Stain Dias mit α-Actinin (Maus-Alexa555), HCN4-GFP (Huhn-Alexa488), Myl2 (Kaninchen-Alexa647). Zellen , die positiv für α-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP - / Myl2 + sind IVMS. Myl2 Färbung wird ein gestreiftes Form entlang der Sarkomers Filament aufweisen. Aufgrund von Schwankungen in der Qualität der Färbung und der Z-Ebene, Streifungen nicht immer leicht sichtbar (4C) liegen. </li></ol></li></ol> HINWEIS: Um die tatsächliche Anzahl der potenziell umprogrammiert MEFs, 2 Vertiefungen einer 24-Well-Platte zu bewerten sind parallel zu den experimentellen Vertiefungen ausgesät und 1 Tag geerntet nach der Plattierung. Die Gesamtzahl der plattierten Zellen wird dann durch Mittelung der zwei Vertiefungen bestimmt. Dies wird die tatsächliche Gesamt Zellen plattiert (Ages). <ol><li> Sarkomers + <ol><li> Sichtprüfung jede Zelle auf einem Deckglas für die richtige α-Actinin + / Sarkomer + (rechte Felder Abbildung 3) und Aufzeichnung (5B-i). </li><li> Tabellieren die Gesamtzahl der α-Actinin + / + Sarkomer auf jedem Deckglas und dividieren durch die tatsächliche Gesamt Zellen ausplattiert (ATOTAL) (5B-iii). Wenn beispielsweise ATOTAL = 12.500 Zellen und 100 - Zellen wurden a-Actinin + / + Sarkomer dann 0,8% der plattierten MEFs wurden umprogrammiert. Ein Durchschnittreprograming Experiment Ausbeute 1% α-Actinin + / Sarkomer + Zellen (5C). </li></ol></li><li> Subtype + HINWEIS: Für die folgenden Schritte siehe 5B / C für eine repräsentative icLm Quantifizierung Workflow - Abbildung. Kurz gesagt, für jede Sarkomers + Zelle, tabellarisch , wenn es für beide Subtyp (5B-i) ist einzigartig. Berechnen% Subtype (5B-iii) , indem die Anzahl der Subtyp + Zellen über die durchschnittliche Sarkomers Dividieren + Zellen x 100 (5B-i). Um die absolute% Subtyps Wirkungsgrad (5B-iv) zu berechnen, unterteilen den Subtyp + Zellzahl von 5B-i durch die Gesamtzahl von Zellen ausgesät x 100 (5B-ii). <ol><li> Für jede der α-Actinin + / Sarkomer + Zellen, zu bewerten , ob sie GFP + sind, NPPA + oder Myl2 <sup&gt; +. </li><li> Tabellieren Gesamtanzahl von α-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 -, actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP - / NPPA + und α-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP - / Myl2 + Zellen (5B-i). </li><li> Um den Prozentsatz von jedem Subtyp berechnen, teilen die Anzahl der Subtype + Zellen durch die Gesamtzahl von α-Actinin + / Sarkomer + -Zellen in das gut und multiplizieren mit 100. GHMT erzeugt IPMS, IAMS und IVMS in etwa gleichen Verhältnissen (Fig 5B-iii). </li><li> Um die absolute Anzahl von Subtyp + Zellen zu berechnen, unterteilen die Gesamtzahl der Subtyp + Zellen für die experimentellen Bedingungen durch ATOTAL und multipliziere mit 100 (5B-ii). Im Durchschnitt IPMS 0,3% der gesamten infizierten Zellpopulation darstellen, Iams 0,3% undIVMS 0,25% (5B-iv). </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+high-titer+viral+preparations+by+concentration+using+successive+rounds+of+ultracentrifugation.">Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation.</a> J Transl Med. 9, 137 (2011).</li><li>Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocyte-like+cells+in+vitro.">Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro.</a> Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors.">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nat Commun. 5, 5807 (2014).</li><li>Muraoka, N., Ieda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+myocytes+to+reverse+fibrosis.">Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis.</a> Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).</li><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E., Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Bass, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image+analysis+identifies+signaling+pathways+regulating+distinct+signatures+of+cardiac+myocyte+hypertrophy.">Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die vorliegende Studie bietet einen Direkt Umprogrammierung Strategie zur Umwandlung von MEF in eine vielfältige Reihe von Herz-Subtypen durch Retrovirus-vermittelte Expression des kardialen Transkriptionsfaktoren Gata4, Mef2c, Tbx5 und Hand2 (GHMT). Unter Verwendung eines Multiplex-Immunfärbung Ansatz in Kombination mit einem PM-spezifischen Reporter Maus, sind wir in der Lage iAM zu identifizieren, IVMS und IPMS auf Einzelzellauflösung. Ein solcher Test ermöglicht eine experimentelle in vitro System in de...

Das Herz ist das erste funktionelle Organ im Embryo 1, 2 zu entwickeln. In Verbindung mit dem Kreislaufsystem, liefert sie Sauerstoff, Nährstoffe und einen Entsorgungsmechanismus bei der Entwicklung. Drei Wochen nach der Befruchtung, schlägt das menschliche Herz zum ersten Mal und seine angemessene Regelung wird gepflegt von Kardiomyozyten (CMs). Der irreversible Verlust dieser spezialisierten Zellen ist daher die grundlegende Frage progressive Herzinsuffizienz zugrunde liegen. Während einige Organismen wie Zebrafisch und Xenopus das Potential für kardiale Regeneration haben, ist der erwachsenen Säugetier - Herzen begrenzteren 3, 5, 6. Somit ist die kritische Funktion des Herzens gegeben, ist es nicht erstaunlich , dass Herzkrankheit die häufigste Todesursache in der Welt ist, für 600.000 Todesfälle in den Staaten 7 allein Vereinigten Buchhaltung. Dasrefore, zellbasierte Therapien effizient zu reparieren oder den verletzten Myokard sind von großem klinischem Interesse zu ersetzen. Die bahnbrechenden Studie von Yamanaka und Kollegen 8 zeigte , dass erzwungene Expression von vier Transkriptionsfaktoren ausreichend ist vollständig differenzierten Fibroblasten - Zellen zu pluripotenten Stammzellen zu konvertieren. Allerdings hat die tumorigenen Kapazität aller pluripotenten Stammzellen Strategien war ein kritisches Problem bei der Verwendung für therapeutische Zwecke. Dies motivierte die wissenschaftlichen Bereich für alternative Methoden zu suchen, Zellen zu transdifferentiate während eine pluripotente Stadium vermieden werden. Kürzlich haben mehrere Gruppen die Durchführbarkeit dieser Strategie dargestellt durch direkte Umwandlung von Maus-Fibroblasten induzierten Kardiomyozyten-ähnliche Zellen (iCLMs) mit der ektopischen Expression des Transkriptionsanzeigefaktoren Gata4, Mef2c, Tbx5, und später, Hand2 (GMT und GHMT bezeichnet) 9, 10. Furthermore kann dieselbe Strategie in vivo durchgeführt werden und in menschlichen Geweben 9, 11, 12. Jüngste Studien haben zusätzliche Faktoren oder Signalwege aufgezeigt , die weiter moduliert werden kann , um Herz Umprogrammierung Effizienz 13, 14, 15 zu verbessern. Zusammengenommen zeigen diese Studien das Potenzial gerichtet transdifferentiation für regenerative Therapien. Allerdings bleiben die geringe Effizienz der CM Umprogrammierung, die unbekannten molekularen Mechanismen, inkonsistente Reproduzierbarkeit aufgrund methodischer Unterschiede 16 und die Heterogenität der iCLMs unadressierte. Um icLm Heterogenität direkt zu bewerten, haben wir eine diskrete und robuste Single-Cell-Test für die Identifizierung von Sarkomers Entwicklung und Herz-Linie specification-zwei notwendigen Eigenschaften von funktionellen Kardiomyozyten. Es gibt mindestens drei Haupttypen von CM im Herzen , wie durch ihre Lage und einzigartige elektrische Eigenschaften definiert: atrial (AM), ventrikuläre (VM) und Schrittmacher (PM) 17, 18, 19, 20. In einer konzertierten Kombination ermöglichen sie die richtige Pumpen von Blut. Während Herzverletzung, eine oder alle Subtypen betroffen sein könnten, und die Art der Zelltherapie müssten auf einer Fall-zu-Fall-Basis behandelt werden. Derzeit konzentrieren sich die meisten Strategien auf die gesamte Generation von Kardiomyozyten, während wenig Arbeit, die molekularen Mechanismen zu studieren getan wird, um die Subtyp Spezifikation regelt. Die folgende Studie beschreibt, wie man richtig gut organisierten Sarkomere zu quantifizieren und eine vielfältige Reihe von Kardiomyozyten Subtypen identifizieren. Mit Hilfe eines Schrittmachers (PM) -spezifische Reporter Maus, wir sind in der Lage ein i anwendenmmunocytochemical Ansatz zur Unterscheidung induzierte atriale artigen Myozyten (IAM), induzierte ventrikuläre artigen Myozyten (iVM) und induzierte PM-wie Myozyten (IPMS) 21. Basierend auf unseren Beobachtungen nur Zellen, die Sarkomers Organisation zeigen in der Lage sind spontan zu schlagen. Diese einzigartige Umprogrammierung Plattform ermöglicht es, die Rolle für die Beurteilung der bestimmter Parameter in Sarkomers Organisation, Subtyp-Spezifikation, und die Effizienz der CM Neuprogrammierung bei Einzelzellauflösung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="873">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:319px;">DMEM</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td style="width:347px;">Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:319px;">Medium 199</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11150059</td>
			<td style="width:347px;">Component of iCLM media</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:319px;">Fetal bovine serrum (FBS)</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2442</td>
			<td style="width:347px;">Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:319px;">Insulin-Transferrin-Selenium G</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">41400-045</td>
			<td style="width:347px;">Component of iCLM media</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:319px;">MEM vitamin solution</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11120-052</td>
			<td style="width:347px;">Component of iCLM media</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:319px;">MEM amino acids</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1601149</td>
			<td style="width:347px;">Component of iCLM media</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:319px;">Non-Essential amino acids</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td style="width:347px;">Component of iCLM media</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:319px;">Antibiotic-Antimycotics</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15240062</td>
			<td style="width:347px;">Component of iCLM media</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:319px;">B-27 supplement</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td style="width:347px;">Component of iCLM media</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:319px;">Heat-Inactivated Horse Serum</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">26050-088</td>
			<td style="width:347px;">Component of iCLM media</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:319px;">NaPyruvate</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11360-70</td>
			<td style="width:347px;">Component of iCLM media</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1514022</td>
			<td style="width:347px;">Component of Plat-E media and fibroblast media</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Puromycin&#160;</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11139-03</td>
			<td>Component of Plat-E media</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Blasticidin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:91px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td>400-128P</td>
			<td>Component of Plat-E media</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:319px;">Glutamax</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Component of Fibroblast media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:319px;">Confocal laser scanning LSM700</td>
			<td style="width:91px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For confocal analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:319px;">FuGENE 6 transfection Reagent</td>
			<td style="width:91px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2692</td>
			<td>Transfection reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:319px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">31985-070</td>
			<td>Transfection reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:319px;">Polybrene</td>
			<td style="width:91px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">TR-1003-G</td>
			<td>Induction reagent. Use at a final concentration of 8um/mL</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:319px;">Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic</td>
			<td style="width:91px;">CellBiolabs</td>
			<td style="width:119px;">RV-101</td>
			<td>Retroviral pacaking cell line</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:319px;">Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For MEFs and Plat-E dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse anti &#945;-Actinin (Clone EA-53)</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td>A7811</td>
			<td>Antibody for confocal analysis. Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Chicken anti-GFP IgY</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10262</td>
			<td>Antibody for confocal analysis. Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit Pab anti-NPPA&#160;</td>
			<td style="width:91px;">Abgent</td>
			<td>AP8534A</td>
			<td>Antibody for confocal analysis. Use at 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit Pab anti Myl2 IgG&#160;</td>
			<td style="width:91px;">ProteinTech</td>
			<td>10906-1-AP</td>
			<td>Antibody for confocal analysis. Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:319px;">Vectashield solution with DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:91px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1500</td>
			<td>Dye for confocal analysis</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:319px;">Superfrost Plus Microscope slides</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td>25 x 75 x 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:319px;">BioCoat Fibronectin 12mm coverslips</td>
			<td style="width:91px;">NeuVitro Corp</td>
			<td>GG-12-1.5</td>
			<td>Coverslips for confocal analysis</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:319px;">100um cell strainer</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:319px;">0.45um Syringes filters SFCA 25MM</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-740-106</td>
			<td>For virus filtration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:319px;">6ml Syringes</td>
			<td style="width:91px;">Covidien</td>
			<td>8881516937</td>
			<td>For virus filtration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Chicken IgY (H&#38;L) A488</td>
			<td style="width:91px;">Abcam</td>
			<td>AB150169</td>
			<td style="width:347px;">Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L)&#160;</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31573</td>
			<td style="width:347px;">Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Goat anti-mouse IgG(H+L) A555</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21422</td>
			<td style="width:347px;">Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:319px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">93443-100ml</td>
			<td>For cell permeabilization&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:319px;">Dulbecco&#39;s PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS)</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:319px;">Power Block 10X Universal Blocking reagent</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9495720</td>
			<td>Dilute to 1X in H20</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:319px;">16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA)</td>
			<td style="width:91px;">Electro Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>Use at 4% diluted in dH20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:319px;">6 cm&#160; plates</td>
			<td style="width:91px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">25-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:319px;">6-well plates</td>
			<td style="width:91px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:319px;">24-well plates</td>
			<td style="width:91px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:319px;">10 cm Tissue culture dishes</td>
			<td style="width:91px;">Corning</td>
			<td>4239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:319px;">15 cm&#160; Tissue culture dishes</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:319px;">15 ml Conical tubes</td>
			<td style="width:91px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:319px;">50 ml Conical tubes</td>
			<td style="width:91px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:319px;">0.4% Trypan blue solution</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8154</td>
			<td>For viability</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:319px;">Ethyl Alcohol 200 proof</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">7005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:319px;">Bleach</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">6009</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cardiomyocyte subtypes following transcription factor-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

Unter Ausnutzung der PM-spezifischen Reporter - Maus, entwickelten wir eine multiplex Immunofärbung Strategie diverse endogene Myozyten zu identifizieren , wie in Abbildung 1 dargestellt. Im Anschluss können die Umprogrammierung Schritte in 2 gezeigt ist , die Induktion von Subtyp-spezifischen CMs so früh wie Tag nachgewiesen werden 4 21, wenn auch mit niedriger Rate. Bis zum Tag 14 kann das Experiment gestoppt und für Sarkome...

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Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

assessing-cardiomyocyte-subtypes-following-transcription-factor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.4K Aufrufe.  UT Southwestern Medical Center. This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5. 

Serie: Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are restricted to two specific neurogenic niches: the subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampus and the ventricular-subventricular zone (V-SVZ; also called subependymal zone or SEZ) in the walls of the lateral ventricles. The development of in vivo gene transfer strategies for adult stem cell populations (i.e. those of the mammalian brain) resulting in long-term expression of desired transgenes in the stem cells and their derived progeny is a crucial tool in current biomedical and biotechnological research. Here, a direct in vivo method is presented for the stable genetic modification of adult mouse V-SVZ cells that takes advantage of the cell cycle-independent infection by LVs and the highly specialized cytoarchitecture of the V-SVZ niche. Specifically, the current protocol involves the injection of empty LVs (control) or LVs encoding specific transgene expression cassettes into either the V-SVZ itself, for the in vivo targeting of all types of cells in the niche, or into the lateral ventricle lumen, for the targeting of ependymal cells only. Expression cassettes are then integrated into the genome of the transduced cells and fluorescent proteins, also encoded by the LVs, allow the detection of the transduced cells for the analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects in the labeled cells and their progeny.

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transkriptom Profilieren<em&gt; In-Vivo</em&gt; Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover occur during normal ageing, quantification of these events remains challenging. This is in part due to the rarity of the process and the fact that multiple cellular sources contribute to myocardial maintenance. Furthermore, DNA duplication within cardiomyocytes often leads to a polyploid cardiomyocyte and only rarely leads to new cardiomyocytes by cellular division. In order to accurately quantify cardiomyocyte turnover discrimination between these processes is essential. The protocol described here employs long term nucleoside labeling in order to label all nuclei which have arisen as a result of DNA replication and cardiomyocyte nuclei identified by utilizing nuclei isolation and subsequent PCM1 immunolabeling. Together this allows the accurate and sensitive identification of the nucleoside labeling of the cardiomyocyte nuclei population. Furthermore, 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole labeling and analysis of nuclei ploidy, enables the discrimination of neo-cardiomyocyte nuclei from nuclei which have incorporated nucleoside during polyploidization. Although this method cannot control for cardiomyocyte binucleation, it allows a rapid and robust quantification of neo-cardiomyocyte nuclei while accounting for polyploidization. This method has a number of downstream applications including assessing the potential therapeutics to enhance cardiomyocyte regeneration or investigating the effects of cardiac disease on cardiomyocyte turnover and ploidy. This technique is also compatible with additional downstream immunohistological techniques, allowing quantification of nucleoside incorporation in all cardiac cell types.

Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

Die gleichzeitige Bewertung der Cardiomyocyte DNA-Synthese und Ploidy: Ein Verfahren zur Förderung des Quantifizierung von Cardiomyocyte Regeneration und Umsatz

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in Trophoblast Stammzellen

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissektion und Kultur der Maus Embryonale Niere

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that mouse embryonic, dermal, and cardiac fibroblasts can be reprogrammed into functional induced-cardiomyocyte-like cells (iCMs) through overexpression of cardiogenic transcription factors including GATA4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 both in vitro and in vivo. However, these previous studies have shown relatively low efficiency. In order to restore heart function following injury, mechanisms governing cardiac reprogramming must be elucidated to increase efficiency and maturation of iCMs.
We previously demonstrated that inhibition of pro-fibrotic signaling dramatically increases reprogramming efficiency. Here, we detail methods to achieve a reprogramming efficiency of up to 60%. Furthermore, we describe several methods including flow cytometry, immunofluorescent imaging, and calcium imaging to quantify reprogramming efficiency and maturation of reprogrammed fibroblasts. Using the protocol detailed here, mechanistic studies can be undertaken to determine positive and negative regulators of cardiac reprogramming. These studies may identify signaling pathways that can be targeted to promote reprogramming efficiency and maturation, which could lead to novel cell therapies to treat human heart disease.

Here we present a robust method to reprogram primary embryonic fibroblasts into functional cardiomyocytes through overexpression of GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1, and miR-133 (GHMT2m) alongside inhibition of TGF-&#946; signaling. Our protocol generates beating cardiomyocytes as early as 7 days post-transduction with up to 60% efficiency.

Unterdrückung der Pro-fibrotische Signalisierung potenziert Faktor-vermittelten Reprogrammierung von Maus embryonalen Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...