This protocol was developed in support of a Joint Genome Institute-Community Sequencing Project (#1657). The work was supported in part by the Philomathia Foundation, the National Science Foundation (#0929226) and the Energy Biosciences Institute to S. Somerville; and by Swiss National Science Foundation (#310030_163260) to B. Keller. We would like to thank our colleagues, M. Figureroa and M. Miller (University of Minnesota), R. Panstruga (RWTH Aachen University), C. Pedersen (University of Copenhagen), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (University of California Berkeley), M. Wildermuth (University of California Berkeley), R. Wise (Iowa State University) and S. Xiao (University of Maryland) for their generous advice and for volunteering their protocols as we developed the protocol described here.

1. Herstellung von Pilzmaterial <ol><li> Wachsende Echten Mehltaus <ol><li> Wachsen Pflanzen in Wachstumskammern mit den folgenden Bedingungen: 22 ° C Tagestemperatur, 20 ° C Nachttemperatur, 80% relative Luftfeuchtigkeit, 14 h Tag-Länge und eine Lichtintensität von 125 &amp; mgr; E / m 2 / s (bereitgestellt von Leuchtstofflampen ). </li><li> Infect Gurkenpflanzen (Cucumis sativa Sorte Bush Meister) mit Golovinomyces cichoracearum Stamm UCSC1 wie beschrieben 18, 29. </li></ol></li><li> Ernte Echten Mehltaus Konidien <ol><li> Ernte Konidien von infizierten Pflanzen auf 7 bis 10 Tage nach der Inokulation ein kleines Vakuum mit einem in-line-Filter (11 &amp; mgr; m), auf dem die Konidien akkumulieren. Leichten Druck, führen Sie die Vakuumdüse entlang der Oberfläche des Blattes der Konidien zu sammeln. HINWEIS: Die durchschnittliche Ausbeute von G. cichoracearum beträgt 20 mg von Konidien aus einem stark InFECTED Gurkenblatt von etwa 130 cm 2 Fläche. </li><li> Bürste um 150 mg der Konidien (ungefähr 375 &amp; mgr; l Volumen oder Konidien 7-8 infizierte Gurkenblätter) von dem Filter auf ein Blatt Papier sauber. Von hier aus übertragen Konidien in 2 ml-Kryoröhrchen mit zwei 5/32-Zoll-Durchmesser vorge gekühlt (in flüssigem Stickstoff) Stahl Mahlkugeln. Unmittelbar Rohre flüssigen Stickstoff zurück. Speicher Röhrchen bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Brechen öffnen Konidien durch Kugelmahlen <ol><li> Flash Aluminiumplatten der Kugelmühle in flüssigem Stickstoff einzufrieren. Last Kryoröhrchen in Kugelmühlenständer. Kräftig schütteln die Kryoröhrchen mit Konidien und Stahlkugeln in der Kugelmühle für 30 s bei 30 Zyklen / s (bei Raumtemperatur). Unmittelbar Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff wieder einfrieren. HINWEIS: Am Anfang Zugriff auf eine Probe von Konidien durch Mikroskopie bei 100-facher Vergrößerung für die Effizienz der Zellwand Bruch während des Schleifens. Bei Bedarf mahlt für weitere 1 bis 2 Runden von 30 s für 30 Zyklen / s, but hält die Anzahl der Runden auf ein Minimum. Routine Beurteilung der konidiale Bruch durch Mikroskopie in diesem Stadium ist nicht erforderlich, wenn optimale Bedingungen festgelegt wurden. </li></ol></li></ol> 2. Genomic DNA Purification <ol><li> Konidien Lysis <ol><li> schnell arbeitet Auftauen Konidien zu vermeiden, die Stahlkugeln aus Kryovials mit einem Magneten entfernen. Hinzufügen 700 &amp; mgr; l 65 ° C Lysepuffer (Tabelle 1) und vortex von 5 bis 10 s , bis eine Aufschlämmung gebildet wird. </li><li> Hinzufügen von 300 &amp; mgr; l vorgewärmtes (65 ° C) 5% (v / v) Sarkosyl und sanft invertieren mischen (1 Invertierung pro 3 s) fünfmal. Die Röhrchen für 30 min bei 65 ° C; invertieren sanft 3-mal bei 10, 20 und 30 min. Unter Verwendung einer Breitbohrungspipettenspitze übertragen gesamte Lösung neues 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. In allen nachfolgenden Schritten, Mischung durch schonendes, langsames Inversion und überträgt die DNA-haltige Lösungen mit weiter Bohrung Pipettenspitzen. </li></ol></li><li> DNA-Extraktion I <ol><li> 1 Volumen von ChlorForm: Isoamylalkohol (24: 1 v / v) zu der Lyselösung und sanft invertieren fünfmal zu mischen. Inkubieren für 10 min bei Raumtemperatur, auf halber Strecke fünfmal zu mischen und erneut am Ende der Inkubation vorsichtig invertieren. Zentrifuge bei Raumtemperatur für 15 min bei 14.000 x g. Breitbohrungspipettenspitze, überträgt sorgfältig die wässrige Schicht zu neuen 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen; einschließlich Material von der Oberfläche vermeiden. </li></ol></li><li> DNA-Niederschlag I <ol><li> 1 Volumenraumtemperatur 100% Isopropanol (etwa 750 ul) und Invertzucker sanft sechsmal zu mischen. Zentrifuge bei Raumtemperatur für 15 min bei 14.000 x g. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen. </li><li> Hinzufügen 450 ul vorgekühlten (-20 ° C) 70% Ethanol. Zentrifuge 5 min bei Raumtemperatur bei 14000 x g. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen. Zentrifuge bei 1000 × g für 3 s, entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit feiner Pipettenspitze und entsorgen. Luft-Trocknen des Pellets für 15 min eint Raumtemperatur. Trocknen Sie nicht länger als 15 min. </li><li> Das Pellet in 300 ul TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM Ethylendiamintetra-Essigsäure, pH 8,0). Inkubiere über Nacht bei 4 ° C. Flick vorsichtig jegliches Restmaterial zu suspendieren, die nicht in Lösung ging. </li></ol></li><li> Um RNA-Kontamination zu entfernen, mit 10 ul RNase A (10 mg / ml). vorsichtig umdrehen dreimal zu mischen. Zentrifuge bei 1000 × g für 3 s. Inkubieren bei 37 ° C für 2 h. </li><li> II DNA Extraction <ol><li> In 300 ul Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1 v / v) und vorsichtig invertieren fünfmal zu mischen. Inkubiere 10 Minuten bei Raumtemperatur sanft am Ende der Inkubation bei der Halbzeit fünf Mal zu mischen und wieder umgekehrt wird. Zentrifuge 15 min bei Raumtemperatur bei 14000 x g. Unter Verwendung einer Breitbohrungspipettenspitze, den Überstand in neue 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol></li><li> DNA-Präzipitation II <ol><li> 0.01 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5,2 (approximately 3 &amp; mgr; l), invertieren fünfmal sanft zu mischen. Hinzufügen 2,5 Volumen vorgekühlten (-20 ° C) 100% Ethanol (etwa 750 ul). vorsichtig umdrehen fünf Mal mischen. Inkubieren über Nacht bei -20 ° C </li><li> Zentrifuge 30 min bei 4 ° C bei 14000 x g. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen. </li><li> Hinzufügen 450 ul vorgekühlten (-20 ° C) 70% Ethanol. Zentrifuge 5 min bei 4 ° C bei 14000 x g. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen. Zentrifuge bei 1000 × g für 3 s. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit feiner Pipettenspitze und entsorgen. </li><li> Luft-Trocknen des Pellets für 30-60 min bei Raumtemperatur. Resuspendieren des Pellets in 27,5 &amp; mgr; l TE. Inkubiere über Nacht bei 4 ° C. Flick vorsichtig jegliches Restmaterial zu suspendieren, die nicht in Lösung ging. </li><li> 2,5 ul Aliquot in 22,5 &amp; mgr; l TE (Endvolumen 25 ul) für Qualitätskontrolltests (siehe unten). Store-DNA-Proben bei 4 ° C bis zur Vorlage für die Sequenzierung. Für die langfristige Lagerung, Aufbewahrung von ProbenGefrier-Auftau-Zyklen bei -80 ° C und Scher minimieren zu verhindern. HINWEIS: Achten Sie bei bei diesem Schritt als hochmolekulare genomische DNA Pipettieren kann schwierig sein, richtig zu pipettieren, und es ist wichtig, um sicherzustellen, dass „QC Aliquot“ ist eine genaue Darstellung der genomischen DNA-Probe. </li></ol></li></ol> 3. Qualitätskontrolle <ol><li> Probe Reinheit <ol><li> Verwendung eines TE blank, beurteilen die Probe Reinheit der DNA durch Laden von 1 &amp; mgr; l Aliquot des QC auf einem kleinvolumigen Spektrophotometer. Nehmen Sie A260 / A280 und A260 / A230 Lesungen. Reine DNA wird ein A260 / A280-Verhältnis von etwa 1,8 und A260 / A230-Verhältnis zwischen 1,8 und 2,2 aufweist. </li></ol></li><li> Quantifizierung von genomischer DNA <ol><li> Führen Quantifizierung von QC Aliquot Kommerzielle doppelsträngige DNA Quantifizierungsassay-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. </li></ol></li><li> DNA Quality Assessment I <ol><li> Last etwa 60 ng genomische DNA und eineDNA-Leiter auf einem 0,7% Agarosegel in 1X TAE (40 mM Tris, 20 mM Essigsäure und 1 mM EDTA, pH 8,0). Führen Gelvorrichtung bei 70 V für 40 bis 45 min bis genomische DNA-Banden sind ungefähr 2 cm von dem Bohrloch und Bandtrennung in dem Leiter ist offensichtlich. Diese Bedingungen müssen basierend auf den verfügbaren Gelelektrophorese Vorrichtung angepasst werden. </li></ol></li><li> DNA Quality Assessment II <ol><li> Last etwa 60 ng genomischer DNA und einen hochmolekulare DNA-Leiter (geeignet für Pulsfeld-Gel-Elektrophorese) auf einem 1% igen Agarosegel in 0,5 × TBE (44,5 mM Tris, 44,5 mM Borsäure, 1 mM EDTA, pH 8,3) und läuft in 0,5x TBE Laufpuffer unter Verwendung eines 5 - 80 kbp Wellenform Pulsfeld-Gel-Elektrophorese-Protokoll für 16 h. </li></ol></li><li> Beurteilung von Bakterien-, Pilz- und Pflanzen Kontaminanten <ol><li> Durchführen der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) die entsprechenden internen transkribierten Abstandshalter (ITS) Regionen der ribosomalen Gene zu amplifizieren unter Verwendung der Primer und Amplifikationsbedingungen Listeed in Tabelle 2. Last 10 &amp; mgr; l der erhaltenen Reaktions auf einem Gel. HINWEIS: Eine Bande, die den echten Mehltau ITS-Region sollte mit dem Pilz-ITS-Primer amplifiziert werden. DNA aus diesem Amplicon und jeden erzeugten Amplikons mit den bakteriellen, pflanzlichen oder Primer sollte den Ursprung der Verunreinigung zu bestimmen, sequenziert werden. Nur Mehltau ITS-Sequenzen sollten in der Pilz-Amplikon zu finden. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Um rein, hochmolekulare genomische DNA aus den obligaten biotrophe echten Mehltaupilzen zu erhalten, eine modifizierte Version des zuvor beschriebenen Verfahrens wurde 30 entwickelt. Die durchschnittliche Ausbeute dieses optimierten Protokoll 7 ug DNA pro 150 mg Konidien, eine Verdoppelung der Ausbeute bei einem früheren Protokoll erhalten. Auch erhöhte sich die durchschnittliche Größe von etwa 20 kbp auf über 48,5 kbp. Dieses Protokoll wurde in dem Gurken- G. cichoracearum System o...

<html> Echte Mehltaupilze sind eine Gruppe von obligater biotrophen pilzliche Pflanzenpathogene , dass, wenn sie zusammengenommen, ist die größte Ursache für Pflanzenkrankheiten weltweit 1. Es gibt über 900 beschriebene Arten von Mehltau, der taxonomisch in fünf Stämme innerhalb der Familie Erisyphaceae 2 zusammengefasst wurde. Sowohl auf ihre wirtschaftlichen Bedeutung und die intimen Beziehung, die sie mit ihren Wirten zu entwickeln haben, Mehltau Krankheiten für&gt; 100 Jahre sind der Gegenstand der Forschung. Bei Infektion, entlocken Echte Mehltau drastische Veränderungen in der Zellstruktur, den Stoffwechsel und Molekularbiologie ihrer Wirte, diese Erreger zu profitieren. Das Studium der Echten Mehltau ist jedoch besonders schwierig aufgrund ihres obligater Lebensstil, und das Wachstum des Pilzes in Reinkultur ist noch nicht 3 beschrieben wurde, 4, 5,&quot;Xref&quot;&gt; 6, 7, 8. Zuverlässige, stabile genetische Transformation von Echten Mehltau hat auch noch nicht erreicht worden, obwohl transiente Transformation 9 bei einigen Arten berichtet, 10. Die Sequenzierung und Montage von Echtem Mehltau Genome hat sich als schwierig erwiesen, aufgrund einer Reihe von Merkmalen des Genoms selbst. Mehltaus Genomen sind groß (120-180 MBP) relativ zu anderen Pilz-Genomen, und bestehen aus 60 bis 90% gleichmäßig verteilt repetitiven Elementen 11. Diese Elemente sind nicht-long terminal repeats, sowie uncategorized repetitive Elemente. Zwei formae speciales einer einzigen echten Mehltau - Arten, Blumeria graminis f. sp. hordei und f. sp. tritici (Bgh und Bgt, respectively) sowie die Traubenmehltau Erysiphe necator, haben Bienenn sequenziert und Entwurf Genomen für mehr andere wurde 12 abgeschlossen, 13, 14. Die sich wiederholenden Natur der Genome hat Montage erschwert und das fertige Bgh - Genom wurde in 6.989 supercontigs mit L50 von 2 Mb 12 montiert. Trotz des großen Genoms scheint der Echte Mehltau eine kleine Anzahl von Protein - kodierenden Genen zu haben, mit 5.845 und 6.540 Genen vorhergesagt in Bgh und Bgt ist. Die sequenzierten echte Mehltaue scheinen auch mindestens 99 Kern Gene zu fehlen , die in anderen Pilzen wesentlich sind, die mit der Abhängigkeit der Pilze auf ihrer Wirtspflanze für das Überleben 11, 12, 13, 14 im Einklang steht. Repetitive Sequenzen nahe Telomere, Centromere, ribosomale RNEin Gen - Arrays und Regionen in transponierbaren Elementen angereichert sind schlecht aus Kurz gelesen Sequenzierungsstrategien zusammengesetzt und sind oft unterrepräsentiert in Genomanordnungen 15. Solche Bereiche für viele der Lücken verantwortlich sein wird angenommen , dass in Genomsequenzen auftreten, und dies gilt auch für die echte Mehltaue mit ihren umfangreichen Erweiterung von repetitiven Elementen 16. Highly Kunststoff Genomregionen oft in einem solchen repetitiven Regionen 3 gefunden. Sie dienen als Gebiet von Chromosomenumlagerungen und oft codieren Gene unter starkem Selektionsdruck, wie beispielsweise die Gene, die für Proteine ​​Effektor und die Gene Enzyme des Sekundärstoffwechsels kodieren. Die Fortschritte in der Einzelmolekül - Lang lesen Sequenzierungstechnologien bieten eine mögliche Lösung für die Sequenzierung durch sich wiederholende Regionen von Genomen 15. Zum Beispiel Faino et al. (2015) fanden heraus, dass auch lange Sequenz gelesen Technologien und m optischenapping ließ sie für zwei Stämme der pilzliche Pflanzenpathogen Verticillium Dahlia eine lückenlose Genomsequenz erzeugen, den Anteil der sich wiederholenden DNA - Sequenzen in das Genom zu verdreifachen, die Anzahl der Gen Annotationen erhöht (und die Verringerung der Anzahl von Teil oder fehlende Gen Annotationen ) und aufschlussreich Genom - Rearrangements 17. Um diese langfris las Sequenzierungstechnologien, hohe Konzentrationen von hohen Qualität genomischer DNA, mit minimalen Größen&gt; 20 kbp zu verwenden, benötigt. Hier beschreiben wir unsere Methoden zur konidiale Sammlung, Reinigung von hochmolekularer DNA von Konidien und unsere Qualitätskontrolle Einschätzungen Mehltauart Golovinomyces cichoracearum auf Gurken angebaut mit 18. Dieses Protokoll basiert auf einem Protokoll im Labor Gruppe B. Keller entwickelt (Universität Zürich, Zürich Schweiz) 13, 19und umfasst mehrere Modifikationen, die zu einem erhöhten DNA-Ausbeuten und einen höheren Anteil an DNA&gt; 48,5 kbp in Größe geführt. Das Protokoll enthält auch die Qualitätskontrolle Schritte basieren auf den Empfehlungen aus den Vereinigten Staaten Department of Energy Joint Genome Institute 20, 21, 22. Die Funktion jedes Reagenz in dem Lysepuffer enthalten ist , und die Gründe für jeden Reinigungsschritt werden , wie in Henry (2008) 23 beschrieben. Verfügbare veröffentlichte Protokolle zur Isolierung von hochmolekulare genomische DNA aus pflanzlichen und mikrobiellen Geweben wurden auch bei der Gestaltung dieses Protokolls 24, 25, 26 angehört, 27, 28.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MM400 Ball Mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td>Or equivalent ball mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL tubes for ball milling</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>72.694.007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/32&#34; stainless steel milling balls</td>
			<td>OPS Diagnostics</td>
			<td>GBSS 165-5000-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 65&#176;C&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2825</td>
			<td>Or equivalent water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 37&#176;C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2825</td>
			<td>Or equivalent water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5417R refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Krakeler Scientific&#160;</td>
			<td>38-022621807</td>
			<td>Or equivalent microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorform:IAA (24:1 v/v)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>C0549</td>
			<td>Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1 v/v)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15593031</td>
			<td>Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34923</td>
			<td>Chill to -20&#176;C prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase, Dnase-free (10mg/ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium metabisulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P2522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Lauryl Sacroinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>L9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>H6269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme</td>
			<td>Staples</td>
			<td>423263</td>
			<td>Or equivalent eyewear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Five COBALT nitrile gloves, LARGE</td>
			<td>Neta Scientific</td>
			<td>HFG-N193</td>
			<td>Or equivalent gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000X in water</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide 10mg/ml</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40042</td>
			<td>Hazardous in case of skin contact. Wear nitrile gloves and protective eyewear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Agarose Ultrapure Bioreagent</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>JT4063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FERSM1332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-48kb CHEF DNA size standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippin Prep&#160;&#160;</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>4472172</td>
			<td>Or equivalent pulse-field gel aparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman&#160;qualitative filter paper, Grade 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>WHA1001042</td>
			<td>Or equivalent growth chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percival&#160; Growth Chamber</td>
			<td>Percival</td>
			<td>AR66LXC9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
			<td>Or equivalent spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P11496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td>Dilute 1/50 with water before use (to 1X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090015&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Borate-EDTA, 10X Solution (Electrophoresis)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP13334</td>
			<td>Dilute 1/10 with water before use (to 1X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Liquid nitrogen (-196 &#176;C) is a freezing hazard. It will also expand rapidly upon warming and should not keep in a tightly closed container</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of high molecular weight genomic dna from powdery mildew for long-read sequencing

Die Echten Mehltaupilze sind eine Gruppe von wirtschaftlich bedeutenden pilzliche Pflanzenpathogene. Relativ wenig ist von gut entwickelten genetischen und genomischen Ressourcen auf einen Mangel auf Grund über die Molekularbiologie und Genetik dieser Erreger, teilweise bekannt. Diese Organismen haben große, sich wiederholende Genome, die gemacht haben Genom-Sequenzierung und Montage prohibitiv schwierig. Hier beschreiben wir Methoden zur Erfassung, Extraktion, Reinigung und Bewertung der Qualitätskontrolle von hochmolekularem genomischer DNA aus einem echten Mehltau - Arten, Golovinomyces cichoracearum. Das beschriebene Protokoll umfasst mechanische Störung durch eine optimierte Phenol / Chloroform-Extraktion genomische DNA gefolgt Sporen. Eine typische Ausbeute betrug 7 &amp; mgr; g DNA pro 150 mg Konidien. Die genomische DNA , die dieses Verfahren isoliert wird , verwendet , ist geeignet für die Lang lesen Sequenzierung (dh&gt; 48,5 kbp). Maßnahmen zur Qualitätskontrolle, die Größe, die Ausbeute und Reinheit der genomischen DNA, um sicherzustellen, sind auchin diesem Verfahren beschrieben. Die Sequenzierung der genomischen DNA der hier beschriebenen Qualität wird für die Montage und den Vergleich von mehreren Mehltau Genome, die wiederum erlauben zu einem besseren Verständnis führen wird und eine verbesserte Steuerung dieser landwirtschaftlichen Erreger.

Ein repräsentatives Beispiel für gereinigter genomischer DNA aus G. 60 ng cichoracearum auf einem Agarosegel unter Verwendung von Gelelektrophorese laufen und unter Verwendung von Pulsfeld - Gelelektrophorese sind in den 1 bzw. 2 gezeigt. Genomische DNA-Präparate, die verstreichen, geringfügig übergeben und die Qualitätskontrolle nicht vertreten sind. Genomische DNA-Präparate, die vollständig Qualitätskontrolle...

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Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

Reinigung von High Molecular Weight genomischer DNA aus Echten Mehltaus für Long-Read-Sequenzierung

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

11.6K Aufrufe.  University of California Berkeley. Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

Serie: Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Forschung

Genetik

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic fragments. Organellar genomes also exist in admixtures within a given cell or tissue type (heteroplasmy), and an abundance of subtypes may change throughout development or when under stress (sub-stoichiometric shifting). Next-generation sequencing (NGS) technologies are required to obtain deeper understanding of organellar genome structure and function. Traditional sequencing studies use several methods to obtain organellar DNA: (1) If a large amount of starting tissue is used, it is homogenized and subjected to differential centrifugation and/or gradient purification. (2) If a smaller amount of tissue is used (i.e., if seeds, material, or space is limited), the same process is performed as in (1), followed by whole-genome amplification to obtain sufficient DNA. (3) Bioinformatics analysis can be used to sequence the total genomic DNA and to parse out organellar reads. All these methods have inherent challenges and tradeoffs. In (1), it may be difficult to obtain such a large amount of starting tissue; in (2), whole-genome amplification could introduce a sequencing bias; and in (3), homology between nuclear and organellar genomes could interfere with assembly and analysis. In plants with large nuclear genomes, it is advantageous to enrich for organellar DNA to reduce sequencing costs and sequence complexity for bioinformatics analyses. Here, we compare a traditional differential centrifugation method with a fourth method, an adapted CpG-methyl pulldown approach, to separate the total genomic DNA into nuclear and organellar fractions. Both methods yield sufficient DNA for NGS, DNA that is highly enriched for organellar sequences, albeit at different ratios in mitochondria and chloroplasts. We present the optimization of these methods for wheat leaf tissue and discuss major advantages and disadvantages of each approach in the context of sample input, protocol ease, and downstream application.

The comparison and optimization of two plant organellar DNA enrichment methods are presented: traditional differential centrifugation and fractionation of the total gDNA based on methylation status. We assess the resulting DNA quantity and quality, demonstrate performance in short-read next-generation sequencing, and discuss the potential for use in long-read single-molecule sequencing.

Optimierung und Vergleichsanalyse von pflanzlichen organellaren DNA-Anreicherungsmethoden Geeignet für die Sequenzierung der nächsten Generation

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have been directed toward elucidation of the location and timing of initiation of genome duplication rather than its completion. However, it is critical that we understand regions of the genome that are last to complete replication, because these regions suffer elevated levels of chromosomal breakage and mutation, and they have been associated with both disease and aging. Here we describe how we have extended a technique that has been used to monitor replication initiation to instead identify those regions of the genome last to complete replication. This approach is based on a combination of flow cytometry and high throughput sequencing. Although this report focuses on the application of this technique to yeast, the approach can be used with any cells that can be sorted in a flow cytometer according to DNA content.

We describe a technique for combining flow cytometry and high throughput sequencing to identify late replicating regions of the genome.

G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, milk and urine. One subset of these RNAs are the posttranscriptional regulators &#8211; microRNAs (miRNAs). To delineate the miRNAs produced by specific cell types, in vitro culture systems can be used to harvest and profile exRNAs derived from one subset of cells. The secreted factors of mesenchymal stem cells are implicated in alleviating numerous diseases and is used as the in vitro model system here. This paper describes the process of collection, purification of small RNA and library generation to sequence extracellular miRNAs. ExRNAs from culture media differ from cellular RNA by being low RNA input samples, which calls for optimized procedures. This protocol provides a comprehensive guide to small exRNA sequencing from culture media, showing quality control checkpoints at each step during exRNA purification and sequencing.

This protocol demonstrates how to purify extracellular microRNAs from cell culture media for small RNA library construction and next generation sequencing. Various quality control checkpoints are described to allow readers to understand what to expect when working with low input samples like exRNAs.

Isolieren, Sequenzierung und Analyse von extrazellulären MicroRNAs aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Sequenzierung von mRNA aus Vollblut mit Nanopore-Sequenzierung

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein interactions, and regulation of parental gene transcription. In classical next generation RNA sequencing (RNA-seq), circRNAs are typically overlooked as a result of poly-A selection during construction of mRNA libraries, or are found at very low abundance, and are therefore difficult to isolate and detect. Here, a circRNA library construction protocol was optimized by comparing library preparation kits, pre-treatment options and various total RNA input amounts. Two commercially available whole transcriptome library preparation kits, with and without RNase R pre-treatment, and using variable amounts of total RNA input (1 to 4 &#181;g), were tested. Lastly, multiple tissue types; including liver, lung, lymph node, and pancreas; as well as multiple brain regions; including the cerebellum, inferior parietal lobe, middle temporal gyrus, occipital cortex, and superior frontal gyrus; were compared to evaluate circRNA abundance across tissue types. Analysis of the generated RNA-seq data using six different circRNA detection tools (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC, and CIRCexplorer) revealed that a stranded total RNA library preparation kit with RNase R pre-treatment and 4 &#181;g RNA input is the optimal method for identifying the highest relative number of circRNAs. Consistent with previous findings, the highest enrichment of circRNAs was observed in brain tissues compared to other tissue types.

Circular RNAs (circRNAs) are non-coding RNAs that may have roles in transcriptional regulation and mediating interactions between proteins. Following assessment of different parameters for construction of circRNA sequencing libraries, a protocol was compiled utilizing stranded total RNA library preparation with RNase R pre-treatment and is presented here.

Identifizierung von kreisförmigen RNAs mittels RNA-Sequenzierung

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...