Wir möchten unsere Finanzierungsquellen zu danken, darunter ein großzügiges Geschenk von der Ware Foundation (auf JPV) Die National Institutes of HealthGrant T32-CA079448 (zu PJS), und der Ball State University Startfonds (zu PJS). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zu veröffentlichen.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll stellt eine hocheffiziente Expression, Reinigung und Quantifizierung Schema für die Isolierung des DHX36 Genprodukts, G4-Resolvase1 (G4R1, auch Rhau und DHX36 genannt) (Abbildung 1). Dieses Protokoll verwendet zwei Reinigungsschritte: His-Tag Affinitätsreinigung an Kobalt Affinitätsbeads und enzymatische Reinigung auf G4-DNA-konjugierten Perlen. Der letzte Schritt ist einzigartig, da es die Vorteile der engen Affinität nimmt, hohe Spezifität und katalytische Aktivität, die Abwickeln rG4R1 für G4 Strukturen hat. Die enge Affinität für G4 Strukturen (K d im Nieder pM - Bereich) ermöglicht eine hohe Salzwäsche (nahe der Löslichkeitsgrenze von NaCl) vor der Elution von der G4 - Perlen, stark die Anwesenheit von unspezifischen Proteinen zu reduzieren. Die katalytische Aktivität von G4R1 auf G4 Strukturen ermöglicht die spezifische Elution des aktiven rG4R1 bei der Zugabe von ATP und MgCl 2. Dieses zweistufige Reinigungsschema konsequent produziert hochreine, Katalytisch aktive rG4R1 13 in Mengen geeignet für die meisten biochemischen Analysen. Mehrere wichtige Schritte werden eine gute Ausbeute an hochreinem, katalytisch aktiven rG4R1 gewährleisten. Die erste ist, die richtigen Induktionsbedingungen von His-rG4R1 in dem bakteriellen Expressionsstamm zu gewährleisten. Wir haben gefunden, dass die beste Ausbeute an rekombinantem Protein tritt auf, wenn Zellen auf eine OD 600 von nicht mehr als 0,4 bis 0,6 vor der Induktion gerade gewachsen sind. die Zellen über diesen Punkt hinaus zu wachsen den Einbau von rG4R1 in inclusion bodies durch in einem Verlust von Proteingewinnung, möglicherweise führen kann. Zweitens erhält man eine höhere Konzentration an gereinigtem Protein, das durch &quot;seriell-binding&quot; den Lysaten der Kobalt Affinitätsbeads. Zum Beispiel gebunden wir das Lysat von 0,5 l induzierten Kulturen zu den Kobalt Affinitätsbeads und dann durchgeführt, eine zweite Bindung eines anderen Lysat von einer zusätzlichen 0,5 l der Kultur zu den gleichen Kobalt Affinitätsbeads. DiesSchritt sorgt für eine konzentriertere Herstellung von Protein, das durch die Anzahl der Moleküle rG4R1 zuzunehmen einem gegebenen Volumen von Perlen gebunden, wodurch die volle Kapazität der Kobalt Affinitätsbeads verwendet. Drittens gewährleistet die hohe Salzwäsche nach der Kobalt Affinität Elutionen an die G4 beads Bindungs ​​dass nahezu alle nicht-spezifischen Protein an die Kügelchen Bindung entfernt wird. Viertens kann der ATP / MgCl 2 Elutionsschritt für rG4R1 an die G4 Kügelchen gebunden an katalytisch die tetra Struktur in Einzelstränge entspannen, rG4R1 verursacht von den Kügelchen freigesetzt werden. Wir können die Möglichkeit nicht ganz ausschließen, dass ATP rG4R1 in einem kompetitiven und nicht als katalytische Weise eluieren; Dies ist jedoch weniger wahrscheinlich , dass der Fall zu sein, da wir früher gezeigt haben , dass eine nicht-hydrolysierbare ATP - Analogon nicht ausreichend , um konkurrierend 13 Bindung 18. Die Affinität von rG4R1 für die abgewickelte, einzelsträngige DNA ist eine Größenordnung kleiner als ter beginnt tetra G4-DNA und damit rG4R1 sollte nicht erneut binden an die Kügelchen. Um diese Möglichkeit zu reduzieren, jedoch sollte dieser Schritt bei 37 ° C, und das Elutionsvolumen durchgeführt werden sollte so schnell wie möglich von den Perlen abgetrennt werden. Der Elutionsschritt wird zweimal wiederholt maximale Erholung zu gewährleisten. Wenn Downstream-Anwendungen, die das Protein benötigen frei von DNA-Verunreinigungen zu sein, empfehlen wir eine zusätzliche Bereinigungsschritt, bei dem das gereinigte Präparat wird neu gebunden an Streptavidin-Perlen, um alle biotinylierten DNAs zu entfernen, falls vorhanden. Wir haben gefunden, daß rG4R1 anfällig für Abbau ist, wenn die richtigen Bedingungen nicht gesamten Protokoll gehalten. Um die Integrität und Aktivität des Enzyms zu erhalten, setzen wir die folgenden kritischen Garantien. Proteaseinhibitoren sind vorhanden während des Reinigungsverfahrens gehalten. Das Protokoll wird bei 4 ° C durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Das Protein wird in Gegenwart von la gereinigtctalbumin und β-Mercaptoethanol. Das Protokoll wird in einer angemessenen Frist (in 1 Tag für die Reinigung) durchgeführt. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass mehrere Gefrier-Auftau-Zyklen negativ auf die Aktivität des Proteins beeinflussen, so dass wir Aliquotierung das Protein in &quot;den einmaligen Gebrauch,&quot; 7 &amp; mgr; l-Aliquots nach der Reinigung und lagern Sie sie bei -80 ° C. Obwohl die Anwesenheit von Lactalbumin in der Herstellung erforderlich ist, um die Integrität und Aktivität des Proteins aufrecht zu erhalten, wie oben erwähnt, haben wir festgestellt, dass dies auch Downstream-Anwendungen behindern. Andere potentielle störende Moleküle, die in der gereinigten rG4R1 Zubereitung enthalten sind, schließen ATP, β-Mercaptoethanol, und vereinzelt DNA. Zum Beispiel haben wir diese Proteinpräparat als unvereinbar mit BIAcore-Analyse aufgrund des hohen Hintergrundsignal von den Pufferkomponenten gefunden. Auch die Anwesenheit von Lactalbumin in der Proteinzubereitung schließt die Verwendung von Standard Bradfordund BCA Proteinquantifizierungsassays. Wir haben jedoch eine alternative Gelbasis Quantifizierungsverfahren zu umgehen diese Beschränkung entwickelt. Dieses Reinigungsverfahren, welches die enzymatische Aktivität von G4R1 als Mittel nutzt, um es insbesondere zu reinigen, macht dieses Verfahren unterscheidet sich von anderen Verfahren. Zum Beispiel haben andere Gruppen FLAG-markiertes rG4R1 in menschlichen Zellen exprimierten 15, 25 oder GST-tagged rG4R1 in Insektenzellen 26 und gereinigt durch FLAG- oder GST-Affinitätschromatographie, respectively. Diese Verfahren haben den Vorteil, in einem eukaryontischen Expressionssystem durchgeführt wird, im Vergleich zu einem bakteriellen Expressionssystem. Geschätzte K d -Werte der resultierenden gereinigten GST-G4R1 für G4 Strukturen gefunden wurden eine Größenordnung höher sein 14 als unsere berichtete K d 12 Werte, 13. Wir schreiben this Diskrepanz in K d -Werte von Unterschieden , die mit einem voluminöseren GST-tag im Vergleich zu einem 6 × His-tag, Unterschiede in den Reinheiten aus diesen beiden Reinigungsschemata erhalten werden , und Unterschiede im Ausmaß und der Art der post-translationalen in einem bakteriellen erworbenen Modifikationen gegenüber einem Insekten-Expressionssystem. Unsere Vorgehensweise hat einen entscheidenden Vorteil gegenüber den zuvor genannten Alternativen, da die Reinigung dieses Proteins direkt auf seine enzymatische Aktivität Scharnieren. Daher erhält man in erster Linie ein Enzym, das in der Weise gefaltet und modifiziert wurde, die ihre enzymatischen Eigenschaften beibehält. Andere Affinität-tag und / oder Größenausschluss-Techniken können keine aktive Enzym aus enzymatisch toten Enzym zu trennen. Es wäre für zukünftige Protokollentwicklung nützlich sein , um die Stärken der anderen Gruppen &quot;Reinigungsprotokolle kombinieren 15, 25, 26 (dh ein Mensch oder Insektenzelle expressIonen - System) mit der Stärke des Protokolls (dh Verbesserung katalytischer basierte Reinigung) weiter auf diese Methode. Obwohl dieses Protokoll derzeit spezifisch für G4R1 ist, könnte es leicht zu allen ATP-abhängige, G4-Auflösungs Proteinen angepaßt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, BLM, WRN, FANCJ, hnRNP Proteine, hPif1 und / oder ChlR1 / DDX1. Durch Veränderung gebunden die Sequenz der Nukleinsäure an die Streptavidin-Kügelchen, könnte dieses Protokoll angepasst werden zu reinigen anderen ATP-abhängigen Nukleinsäure-Enzyme, für die das Produkt der enzymatischen Reaktion ist nicht länger ein Substrat für das Enzym, einschließlich Nukleinsäure-Helikasen und Nukleasen.

G4 Strukturen sind hochstabile Nukleinsäuresekundärstrukturen, die innerhalb Guanin-reichen Regionen von DNA und RNA bilden. G4 Strukturen werden über Hoogsteen-Bindungswechselwirkungen stabilisiert und koordinative Bindung innerhalb des zentralen Hohlraums mit einwertigen Kationen (d. K + und Na +), die zu der bemerkenswerten thermischen Stabilität von G4 Strukturen 1, 2 wesentlich beitragen. Frühe Bioinformatik Studien vorgeschlagen , dass das menschliche Genom enthält&gt; 375.000 &quot;potential G4 bildenden Motive&quot; 3, 4. Neuere Studie Schätzungen deuten darauf hin , dass die Anzahl der G4 - Motive höher ist um einen Faktor von 2-5 5, während eine andere Studie 716.310 unterschiedliche Potential G4 bildenden prognostiziert 6 Sequenzen im menschlichen Genom. G4-bildende Sequenzen sind evolutionär konserviert und nicht willkürlich verteilt indas Genom. G4 - Motive sind in Gen kodierenden Regionen angereichert und nach oben von 40% der Gen - Promotoren enthalten G4 Motive 7. Interessanterweise hat der Grad der Anreicherung von G4-Motive in einem Gen demonstriert worden, um die Funktion des Gens zu suggerieren. Zum Beispiel haben proto-Onkogenen und Gene in Entwicklung beteiligt signifikant größere Anreicherung von G4 Strukturen als Tumorsuppressorgene 8, 9. Mit hoher thermischer Stabilität, eine fast allgegenwärtige Präsenz im gesamten Genom, und das Potenzial, deutlich größeren zellulären Prozesse beeinflussen, ist es wenig überraschend zu finden, dass die Zelle Enzyme zu verwalten, diese Strukturen entwickelt hat. Ein solches Enzym ist G4 Resolvase1 (G4R1; auch Rhau und DHX36 genannt), die wir als die Quelle der meisten tetra G4-DNA Auflösungs Aktivität charakterisiert in menschlichen (HeLa) Zellen 10. Seitdem hat es sich gezeigt, That G4R1 fest bindet und abwickelt katalytisch tetra und unimolekularer G4-DNA und G4-RNA mit den engsten berichteten KDs für einen G4-bindendes Protein 11, 12, 13. Zusätzlich hat die G4-Auflösungs Aktivität von G4R1 wurde in einer Vielzahl von biochemischen und zellulären Prozessen beteiligt, einschließlich telomere / Telomerase biology 11, 14, 15, 16, Transkription und Splicing 17, 18, 19, 20, Entwicklung 21, Hämatopoese 21, und der Immunregulation 22, 23. Mit einem Übergewicht der G4-Sequenzen spezifisch im gesamten Genom und die diverse zelluläre p gelegenrozesse dass G4R1 die Fähigkeit hat zu verwickelt beteiligt mit kurzem wurde, zu exprimieren und zu reinigen, effizient hochaktiven rG4R1 von äußerster Wichtigkeit ist, die biochemischen Mechanismen, und das Verhalten dieses Proteins für die Aufklärung. Hier zeigen wir eine neuartige Expression und Reinigungsschema (Figur 1) , die die Vorteile der ATP-abhängige, G4-Auflösungs Aktivität von rG4R1 effizient isolieren aktiven Enzyms führt. Dieses Schema könnte angepasst werden, um andere ATP-abhängigen, für die Nukleinsäure-Enzyme zu reinigen das Produkt der enzymatischen Reaktion ist nicht länger ein Substrat für die Bindung, wie es der Fall für G4R1.

<table><tbody><tr><td>TriEx4-DHX36 plasmid</td><td>Addgene</td><td>68368</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta2(DE3)plysS competent cells</td><td>Novagen</td><td>71403-4</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Difco Terrific Broth</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>35 &amp;micro;g/mL in bacterial plates/large cultures</td></tr><tr><td>Carbenicillin (plant cell culture tested)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3416</td><td>50 &amp;micro;g/mL in bacterial plates/large cultures</td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme (from chicken egg white)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td>1963-B</td><td>or from standard source</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td>1966</td><td>or from standard source</td></tr><tr><td>1.5 M Tris-HCl, pH 8.8</td><td></td><td></td><td>For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 6.8</td><td></td><td></td><td>For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source</td></tr><tr><td>1 M Tris-Acetate, pH 7.8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td>1981</td><td>or from standard source</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Magnesium chloride (1&amp;nbsp;M solution)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td>1665</td><td>or from standard source</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol (2-BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin hemisulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin paramagnetic beads</td><td>Promega</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8&amp;nbsp;</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td>0718</td><td>or from standard source</td></tr><tr><td>0.2 M EDTA, pH 6</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td></td><td>From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5385</td><td></td></tr><tr><td>Cobalt metal affinity beads</td><td>Clonetech</td><td>635502</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid, glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-Triphosphate (from bacterial source)</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>40% acrylamide/Bis solution (37.5:1)</td><td>Biorad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)</td></tr><tr><td>10% Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Universal Scientific Supply Co.&amp;nbsp;</td><td>1667</td><td>to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or from standard source</td></tr><tr><td>10x TBE&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11666703001</td><td>or from standard source</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>411019</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Broad Range Protein MW markers</td><td>Promega</td><td>V8491</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated Z33 oligo (&quot;Z33-Bio&quot;)</td><td>Oligos Etc</td><td></td><td>5&amp;rsquo; AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>TAMRA-Z33 oligo (&quot;Z33-TAM&quot;)</td><td>Oligos Etc</td><td></td><td>5&amp;rsquo; TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Fluor-coated TLC plate</td><td>Life Technologies</td><td>AM10110</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>30% in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Coomassie R-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27816</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Multiband UV lamp</td><td></td><td></td><td>Capable of emitting UV light at 365 nm</td></tr><tr><td>Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor)</td><td></td><td></td><td>Capable of being cooled to 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td>Capable of being cooled to 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Digital Sonfier</td><td>Branson</td><td></td><td>Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2 s ON/2 s OFF)</td></tr><tr><td>50 &amp;deg;C water bath</td><td></td><td></td><td>For formation of Z33 into quadruplex</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C incubator for bacteria</td><td></td><td></td><td>For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; transformed with TriEx4-DHX36</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C/14&amp;nbsp;&amp;deg;C shaking incubator for bacteria</td><td></td><td></td><td>For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; transformed with TriEx4-DHX36</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td></td><td></td><td>capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000)</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>PCR strip tubes</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>15 and 50 mL centrifuge tubes (polypropylene)</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (2.0 mL)</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>500 mL centrifuge bottles (polypropylene)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0500</td><td></td></tr><tr><td>Standard array of pipet tips and serological pipettes</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Gel-loading tips</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Automatic repeating pipette</td><td></td><td></td><td>For quick aliquoting of rG4R1; From standard source</td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Dry ice</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Laemlli sample buffer&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Apparatus for running large slab gels</td><td>Biorad</td><td></td><td>We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12301D</td><td>We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Filter paper and funnel</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Glass casserole dish</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Clear sheet protectors</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Scanner and associated TWAIN software</td><td></td><td></td><td>From standard source</td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td></td><td></td><td>Such as Fuji Multiguage, or equivalent</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td>Or equivalent&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

a g-quadruplex dna-affinity approach for purification of enzymatically active g4 resolvase1

Höherwertige Nukleinsäurestrukturen G-Quadruplexe (G4S, G4 Strukturen) in guaninreichen Regionen sowohl DNA als auch RNA und sind thermisch hochstabile Form genannt. Es gibt&gt; 375.000 putative G4 bildenden Sequenzen im menschlichen Genom, und sie sind in Promotorregionen, untranslatierten Regionen (UTRs) angereichert, und innerhalb der telomeren Wiederholungs. Aufgrund des Potenzials für diese Strukturen zellulärer Prozesse zu beeinflussen, wie beispielsweise Replikation und Transkription wurde die Zellenzyme entwickelt sie zu verwalten. Ein solches Enzym ist G4 Resolvase 1 (G4R1), die biochemisch wurde zusammen gekennzeichnet durch unser Labor und Nagamine et al. und zu binden , extrem eng sowohl G4-DNA und RNA-G4 (K d im Nieder pM - Bereich) gefunden. G4R1 ist die Quelle der Mehrzahl der G4-Auflösungsaktivität in Lysaten HeLa-Zelle und hat eine Rolle, da eine Rolle bei telomere Stoffwechsel, Lymphe Entwicklung, Gentranskription, Hämatopoese und Immunüberwachung spielen. Die Fähigkeit, efzient Expression und Aufreinigung katalytisch aktive G4R1 von Bedeutung ist für die Laboratorien an weiteren Einblick in die kinetische Interaktion von G4 Strukturen und G4-Lösung Enzyme zu gewinnen. Hier beschreiben wir eine detaillierte Verfahren zur Reinigung von rekombinantem G4R1 (rG4R1). Das beschriebene Verfahren beinhaltet die herkömmliche affinitätsbasierte Reinigung eines C-terminalen Histidin-markiertes Enzym in menschlichen Codon-optimierten ausgedrückt Bakterien mit der Ausnutzung der Fähigkeit von rG4R1 zu binden und G4-DNA Entspannen hochaktive Enzym in einer ATP- zu reinigen abhängige Elutionsschritt. Das Protokoll enthält außerdem ein Qualitätskontrollschritt, bei dem die enzymatische Aktivität von rG4R1 durch Untersuchung der Fähigkeit des gereinigten Enzyms gemessen wird G4-DNA zu entspannen. Außerdem wird ein Verfahren beschrieben, das für die Quantifizierung von gereinigtem rG4R1 ermöglicht. Alternative Anpassungen dieses Protokolls werden diskutiert.

Dieses Protokoll (Abbildung 1) ergibt routinemäßig fast rein, katalytisch aktive rG4R1. Als Maß der enzymatischen Aktivität wird typischerweise beobachtet , dass 50% von 0,2 pmol von TAMRA-markierten tetra G4-DNA in Monomere innerhalb der 0,2 umgewandelt wird - 0,013 uL Bereich von rG4R1 durch die G4 - Aktivitätstest getestet , wie oben (Abbildung dargelegt 2). Coomassiefärbung von gereinigtem rG4R1 zeigt eine einzelne Bande bei der erwarteten 120 kDa Größe, mit einem kleinen verunreinigende Bande bei ~ 75 kDa, die rG4R1 abgeschnitten darstellen kann, dass seine Fähigkeit, G4-DNA Perlen beibehalten hat zu binden und in einem ATP-abhängigen zu eluieren Weise (Figur 3). Die Bande von Interesse ist gegen ein Protein Standardkurve quantifiziert, und dieses Protokoll erhält typischerweise 200 &amp; mgr; l von 20-100 nM gereinigtem Enzym pro 1 l Bakterienkultur. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55496/55496fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schematische Darstellung eines Zwei-Stufen - Reinigung von G4R1. Ein 6xHis-markierte rG4R1 ist bulk-gereinigt aus E. coli - Lysaten durch erste Bindung an und Eluieren von Co 2+ Perlen konjugierter. Ein Bindungsschritt zu G4-DNA-konjugierten magnetischen Kügelchen folgt. Schließlich wird eine ATP-abhängige Elutionsschritt notwendig, relativ rein und enzymatisch aktiven rG4R1 zu erhalten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55496/55496fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55496/55496fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55496/55496fig2.jpg" /> Abbildung 2: Qualitätskontrolle G4-DNA Abwickeln Assay. Spuren 1 - 6: eine konstante Konzentration an TAMRA-markiertes tetra G4-DNA wurde für 30 min in Gegenwart von 4-fach serielle Verdünnungen von gereinigtem rG4R1 bei 37 ° C inkubiert repräsentiert 3,9 &amp; mgr; l, 0,83 &amp; mgr; l, 0,2 &amp; mgr; l, 0,05 &amp; mgr; l, 0,013 &amp; mgr; l und 0<html> 0,003 &amp; mgr; l, respectively. Spur 7: tetra G4-DNA in Abwesenheit von rG4R1. Spur 8: tetra G4-DNA, die die G4-Struktur in Monomere in Abwesenheit von rG4R1 zu reduzieren gekocht. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55496/55496fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55496/55496fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55496/55496fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die Quantifizierung von gereinigtem rG4R1 Konzentration. eine Standardkurve von Proteinkonzentrationen zu erzeugen bzw. 6, und wurden verwendet, - 500, 250, 125, 62,5, 31,3 und 15,7 ng in Bahnen 1: Breit-Bereich MW Proteinmarker wurden in den folgenden Mengen geladen. Lane 7 für 35 &amp; mgr; l rG4R1. Dies wurde insbesondere Gel quantifiziert, im Rahmen eines dreifachen Satz von Gelen, in einer durchschnittlichen Proteinkonzentration von 62 ± 22 nM Standardabweichung resultierende (SD; N = 9)..com / files / ftp_upload / 55496 / 55496fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

G4 Resolvase1 bindet an G-Quadruplex (G4) Strukturen mit dem engsten berichteten Affinität für ein G4-Bindungsprotein und stellt die Mehrheit der G4-DNA Abwickeln Aktivität in HeLa-Zellen. Wir beschreiben ein neuartiges Protokoll, das die Affinität und ATP-abhängige Abwickeln Aktivität von G4-Resolvase1 nutzt gezielt katalytisch aktive rekombinante G4R1 reinigen.

Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

a-g-quadruplex-dna-affinity-approach-for-purification-enzymatically

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.6K Aufrufe.  Wake Forest School of Medicine.  G4 Resolvase1 bindet an G-Quadruplex (G4) Strukturen mit dem engsten berichteten Affinität für ein G4-Bindungsprotein und stellt die Mehrheit der G4-DNA Abwickeln Aktivität in HeLa-Zellen. Wir beschreiben ein neuartiges Protokoll, das die Affinität und ATP-abhängige Abwickeln Aktivität von G4-Resolvase1 nutzt gezielt katalytisch aktive rekombinante G4R1 reinigen. 

Serie: A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Entwurf, Herstellung und Reinigung

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Forschung

Biochemie

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Kinetik der Verzögerungs-DNA-Synthese<em&gt; In Vitro</em&gt; Von den Bakteriophagen T7 Replikationsproteine

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Genetik

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the abundances of key metabolites to which regulatory factors respond, adjusting cellular metabolism. In recent years, a number of proteins and RNA have emerged as important regulators of virulence gene expression. For example, the CodY protein responds to levels of branched-chain amino acids and GTP and is widely conserved in low G+C Gram-positive bacteria. As a global regulator in Staphylococcus aureus, CodY controls the expression of dozens of virulence and metabolic genes. We hypothesize that S. aureus uses CodY, in part, to alter its metabolic state in an effort to adapt to nutrient-limiting conditions potentially encountered in the host environment. This manuscript describes a method for extracting and analyzing metabolites from S. aureus using liquid chromatography coupled with mass spectrometry, a protocol that was developed to test this hypothesis. The method also highlights best practices that will ensure rigor and reproducibility, such as maintaining biological steady state and constant aeration without the use of continuous chemostat cultures. Relative to the USA200 methicillin-susceptible S. aureus isolate UAMS-1 parental strain, the isogenic codY mutant exhibited significant increases in amino acids derived from aspartate (e.g., threonine and isoleucine) and decreases in their precursors (e.g., aspartate and O-acetylhomoserine). These findings correlate well with transcriptional data obtained with RNA-seq analysis: genes in these pathways were up-regulated between 10- and 800-fold in the codY null mutant. Coupling global analyses of the transcriptome and the metabolome can reveal how bacteria alter their metabolism when faced with environmental or nutritional stress, providing potential insight into the physiological changes associated with nutrient depletion experienced during infection. Such discoveries may pave the way for the development of novel anti-infectives and therapeutics.

Here we describe a protocol for the extraction of metabolites from Staphylococcus aureus and their subsequent analysis via liquid chromatography and mass spectrometry.

Ein Tandem-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierter Ansatz zur Analyse von Metabolit<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Identifizierung von G-Quadruplexen in einer DNA-Vorlage mittels chemischer Kartierung

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

Autor im Rampenlicht: Charakterisierung von DNA-G-Quadruplex durch Bis-3-Chloropiperidin-basiertes chemisches Mapping 

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

In vitro Chemische Kartierung von G-Quadruplex-DNA-Strukturen durch Bis-3-Chlorpiperidine

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...

<meta charset="utf8"></head><body>CMG-vermittelte DNA-Dewindung durch Wachstum des ssDNA-RPA-Trakts beobachtet

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Dynamik der eukaryotischen DNA-Replikation durch Einzelmolekül-Visualisierung

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1

Zusammenfassung

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Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln

Kinetik der Verzögerungs-DNA-Synthese

Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12

Ein Tandem-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierter Ansatz zur Analyse von Metabolit

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

In vitro Chemische Kartierung von G-Quadruplex-DNA-Strukturen durch Bis-3-Chlorpiperidine

In vitro Chemische Kartierung von G-Quadruplex-DNA-Strukturen durch Bis-3-Chlorpiperidine

In vitro Chemische Kartierung von G-Quadruplex-DNA-Strukturen durch Bis-3-Chlorpiperidine

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase