Diese Arbeit wurde teilweise durch einen NIH Pathway to Independence Award (gewähren GM 099.893) und Fakultät Startfonds SRB, sowie ein Forschungsprojekt Grant (gewähren GM 042219) gefördert. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Interpretation, oder die Entscheidung, die Arbeit zur Publikation einzureichen.

1. Herstellung von Pufferlösungen <ol><li> Bereiten phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; pH 7,4) durch eine Stammlösung von 10 × PBS auf eine Endkonzentration von 1x mit Reinstwasser verdünnt wird (destilliertem und entionisiertem) Wasser. </li><li> Bereiten Abschrecken Lösung durch Kombination von 2 ml Acetonitril, 2 ml Methanol, 1 ml ultrareinem H 2 O und 19 ul (0,1 mM Endkonzentration) Ameisensäure. </li><li> Bereiten LC-MS Lösungsmittel A durch Zugabe von Ameisensäure (0,2% [v / v] Endkonzentration) zu Reinstwasser. </li><li> Bereiten LC-MS Lösungsmittel B durch Zugabe von Ameisensäure (0,2% [v / v] Endkonzentration) zu Acetonitril. HINWEIS: Alle Lösungen sollten mit den höchsten reinen Reagenzien zur Verfügung (in der Regel HOCHLEISTUNGSFLÜSSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE grade) hergestellt werden. Die Lösungen sollten vor jedem Experiment frisch hergestellt werden und auf Eis gelagert vor der Verwendung. </li></ol> 2. Etablierung von Steady-state S. aureus Wachstum <ol><li> Streak S. aureus Stämme von Interesse für die Isolierung auf tryptischen Soja - Agar (TSA) aus einem gefrorenen Glycerolstammlösung. Inkubieren bei 37 ° C für 16-24 h. </li><li> Beimpfen von 4 ml tryptischer Sojabrühe (TSB) oder ein anderes geeignetes Medium in sterilen Glas Inkubationsröhrchen mit einzelnen Kolonien jedes Stammes. Inkubieren geneigt (~ 70 ° Winkel) mit einer Drehung bei 60 Umdrehungen pro Minute (rpm) bei 37 ° C für 16-20 h. HINWEIS: Über Nacht Kulturen sind anfällig für Sauerstoff-Gradienten, wenn Standardverfahren, einschließlich der in Schritt 2.2 beschrieben, die zelluläre Physiologie beeinflussen. So beschäftigen wir eine Mehrfachstrategie zurück-Verdünnung biologischen eingeschwungenen Zustand (siehe Schritte 2,4-3,2, unten) zu gewährleisten. </li><li> Verwenden eines Spektrophotometers die optische Dichte der Kulturen aus dem Schritt 2.2 bei 600 nm (OD 600) zu messen. Verwenden steriles Medium als optische Referenz (leer). Man verdünnt diese Zellen zu einer OD 600 von 0,05 in 50 ml sterilen TSB - Medium (vorgewärmt auf 37 ° C) in separaten, 250 mL DeLong Flaschen. </li><li> IncuBeize der Kulturen bei 37 ° C in einem Wasserbad bei 280 Umdrehungen pro Minute unter Schütteln. </li><li> Alle 30 min, nehmen OD 600 Messungen; wie die optischen Dichten zu erhöhen, kann es notwendig werden, die Kulturen mit TSB zu verdünnen, so dass sie innerhalb des linearen Absorptionsbereich des Spektrometers bleiben. </li><li> Wenn Kulturen aus Schritt 2.5 eine OD 600 von ~ 0,8-1,0 erreichen, Subkultur sie in 50 ml 37 ° C auf TSB einen OD600 von 0,01-0,05 und wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5. </li></ol> 3. Probenentnahme-Setup <ol><li> Bereiten Sie die ein Bett aus zerkleinerten Trockeneis in einem geeigneten Gefäß (zB Glasschale, Eisbehälter oder Kühler). </li><li> Da die optischen Dichten der Kulturen die gewünschte Erntepunkt nähern, 1 ml der für ≥5 min Lösung auf eine 35 mm Petrischale und unbehandeltem Vorkühl- auf Trockeneis abgeschreckt. HINWEIS: Der „gewünschte Erntepunkt“ wird in Abhängigkeit von experimentellen Zielen variiert. Zum Beispiel war, wenn man m untersuchenetabolites während der aeroben Wachstums Kennzahlen dieses Zustands umfassen Acetat Ausscheidung und Wieder Assimilation des Acetats in der post-exponentiellen Wachstumsphase 32, 33. Im allgemeinen sollte dieser Punkt in einem bestimmten Wachstumsstadium (zB exponentielle Phase). Die spezifischen OD 600 Werte mit dieser Stufe verbunden ist, kann zwischen verschiedenen Bakterienstämme und Wachstumsmedien variieren. </li><li> Legen Sie eine Edelstahlfilter Fritte (vorgekühlte bis -20 ° C) in einem Gummi-Stopper und legt es auf einem Vakuumkolben mit einem Hausvakuum oder eine Vakuumpumpe befestigt. </li><li> Anwenden des Vakuums und legen eine gemischte Celluloseester-Membran (0,22 um Porengrße) oben. HINWEIS: Es ist wichtig, einen Filter mit einem Durchmesser gleich demjenigen der Fritte zu verwenden und richtig, diese Filter zu zentrieren, um sicherzustellen, dass die Probe durch die Filter gezogen wird und nicht über den Rand. Benetzen der Membran mit eiskaltem, sterilen H 2 O kann helfenmit der Membran zu positionieren. </li></ol> 4. Probenernte <ol><li> Bei einer OD 600 von ~ 0,4-0,5, verwenden eine serologische Pipette 13 ml der Kultur aus dem Kolben zu entfernen und die Probe auf die Filter anzuwenden. </li><li> Nachdem die gesamte Probe gefiltert wurde sofort abwaschen den Filter mit ≥5 mL eiskaltem PBS-Medium-assoziierte Metaboliten abzuwaschen. </li><li> Trennen des Vakuums und mit einem Paar von sterilen Pinzette den Filter von der Fritte zu entfernen. Invertieren des Filters (Zellseite nach unten) in den vorgekühlten Quenchlösung. HINWEIS: Es ist wichtig , die obigen Schritte schnell (dh innerhalb von Sekunden) und so schnell auszuführen , wie die Flüssigkeit der schnelle Abschreckung der Zellen zu gewährleisten , wurde entfernt, verhaften metabolische Aktivität. </li><li> Inkubieren Sie die Filter in dem Quench-Lösung auf Trockeneis für ≥20 min. </li><li> Unter Verwendung einer sterilen Pinzette, invertieren die Filter (Zellseite nach oben) in die Petrischale und einer Mikropipette verwenden, um die Zellen zum Abspülen von ter Membran in die Quench-Lösung. </li><li> die Zellen in Quenchlösung erneut suspendiert und dann überträgt die Zellsuspension auf ein sterilen 2 ml schlagfesten Röhrchen mit ~ 100 &amp; mgr; L von 0,1 mm Siliciumdioxidperlen. Speicher dieses auf Trockeneis oder bei -80 ° C. </li></ol> 5. Metabolit Extraction <ol><li> Auftau-Proben auf nasses Eis und die Zellen in einem Homogenisator mit vier Bursts 30 s bei 6.000 Umdrehungen pro Minute, wobei 2 min Kühlperioden auf Trockeneis zwischen den Zyklen stören. </li><li> Klärung die Lysate 15 Minuten in einer vorgekühlten, gekühlten Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit (dh 18.213 xg bei ≤4 ° C). </li><li> Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes Reaktionsgefäß. </li><li> Unter Verwendung einer Mikropipette, übertragen einen kleinen Teil der Probe auf ein Mikrozentrifugenröhrchen für die Quantifizierung von Restpeptidgehalt in Schritt 6; Speichern der Rest bei -80 ° C. HINWEIS: Das Volumen der reservierten Probe variiert, abhängig von dem BCA-Assay in Schritt 6.1. DiesProbe sollte auf nassem Eis für die sofortige Analyse oder gefroren bei -80 ° C gelagert werden. </li></ol> 6. Bicinchoninsäure (BCA) Assay <ol><li> Durchführen eine BCA-Assay, wie durch den Hersteller empfohlen Kit, unter Verwendung von Proben aus dem Schritt 5.4 die Restpeptidkonzentration für jede Probe zu bestimmen. </li></ol> 7. LC-MS <ol><li> Mischen Sie 75 &amp; mgr; l von S. aureus - Extrakt mit 75 &amp; mgr; L LC-MS Lösungsmittel B, hergestellt in Schritt 1.4. </li><li> Vortex zu mischen und Spin bei 13.000 × g für 5 min. </li><li> Man gibt 100 &amp; mgr; l Überstand in eine Flüssigchromatographie (LC) und die Kappe Phiole es. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Probe eingefangen werden. </li><li> Legen Sie die LC - Fläschchen auf die LC-MS - Autosampler und bearbeiten Sie die laufende Liste in der Software „Offline - Worklist - Editor.“ <ol><li> Füllen Sie den &quot;Sample Namen&quot; (zB Wildtyp-1), &quot;Sample Position&quot; (zB P1-A1), &quot;Method&quot; (zB Formic Acid-negativ Methode) und &quot;Data File&quot; (zB Wildtyp-1) Spalten. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Speichern Vorrat“ -Taste. Öffnen Sie die „Mass Spectrometry Data Acquisition Workstation“ Software und geben Sie den zuvor gespeicherten Arbeitsliste. Klicken Sie auf den „Start Vorrat Run“, um die kontinuierliche LC-MS-Messung zu starten. </li></ol></li><li> Trennen Sie die Proben auf einer Säule, verknüpfen Sie die Spalte mit einer Flugzeit (TOF) Spektrometer und koppelt den TOF-Spektrometer mit dem LC-System. Verwenden einer mobilen Phase Gradient wie folgt: 0-2 min, 85% Lösungsmittel B; 3-5 min, 80% Lösungsmittel B; 6-7 min, 75% Lösungsmittel B; 8-9 min, 70% Lösungsmittel B; 10-11.1 min, 50% Lösungsmittel B; 11,1-14 min, 20% Lösungsmittel B; und 14,1 bis 24 min, 5% Lösungsmittel B; am Ende mit einem 10 min Wieder Äquilibrierungsperiode mit 85% Lösungsmittel B und einer Fließgeschwindigkeit von 0,4 ml min -1. </li><li> Unter Verwendung einer isokratischen Pumpe infundieren eine Referenzmasse Lösung mit dem Durchlauf für den gleichzeitigen Massenachse Kalibrierung zu ermöglichen. HINWEIS: Dieser Schrittbasiert auf dem Standard-Handbuch TOF-Spektrometer. <ol><li> Verwenden, um die Mischung aus Essigsäure D4 und Hexakis (1H, 1H, 3H-Tetrafluorpropoxy) Phosphazin als Referenzmasse Lösung auszuführen, um die Echtzeit-Kalibrierung. Verwenden Sie die isokratische Pumpe mit einer Fließgeschwindigkeit von 2,5 ml min -1 für die Infusion. </li></ol></li></ol> 8. Batch-Korrektur von Ion Counts <ol><li> Bezeichnen jede Probe als Referenzprobe für die Chargenkorrektur zu dienen (zB Wildtyp, replizieren 1). </li><li> Berechnen Sie die Summe der Ionenzählungen für alle Metaboliten innerhalb der Referenzprobe. Wiederholen Sie diese Berechnung für alle Proben. </li><li> Unterteilen der Gesamtionenzahl jeder Probe durch die Gesamtionenzahl der Referenzprobe ein Verhältnis zu erzeugen. </li><li> Unterteile die Ionenzahl für jeden Metaboliten in einer Probe durch das Proben- / Bezugsverhältnis eine chargen korrigierten Ionenzahl für jeden Metaboliten zu erhalten. </li></ol> 9. Peptid Normalisierungs <ol><li> Divide chargen korrigierte Ionen Zählwerte für jede in Schritt 8 durch die Peptidkonzentration mit dem BCA-Assay in Schritt 6 erhaltenen Probe bestimmt einen normalisierten Wert für jeden Metaboliten zu ergeben. HINWEIS: Die normalisiert, batch-batch korrigierten Ionenzählungen für jeden Metaboliten in Schritt 9.1 kann direkt zwischen Stämmen und einem statistischen Analyse (zB einem Mann-Whitney U - Test) verglichen werden. Alternativ bekannt, dass ein Metabolit unverändert entweder durch die Behandlung oder genetischen Hintergrund sein kann als Normalisierungseinrichtung verwendet werden, um Veränderungen zu erkennen, durch Zersetzung Metaboliten. Die Aufnahme einer bekannte Menge an L-Norvalin oder gluraric Säure in dem Extraktionspuffer kann verwendet werden für den Verlust während der Probenverarbeitung 34 zu korrigieren. </li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Alle kleinen Molekül-Metaboliten werden in zentralen Stoffwechselwege miteinander über ihren gemeinsamen Ursprung verbunden. Während des exponentiellen Wachstums sind Bakterienzellen in biologischen und metabolischen eingeschwungenen Zustand eine Momentaufnahme des physiologischen Zustands unter spezifischen Bedingungen bereitzustellen. CodY überwacht Nährstoff Hinlänglichkeit durch zu ILV und GTP reagieren. Als ILV und GTP - Pools Tropfen, wahrscheinlich CodY Aktivität progressiv verringert, um die Expression vo...

Bakterielle Krankheitserreger müssen mit vielen Herausforderungen in der Host-Umgebung kämpfen. Neben dem direkten Angriff von Immunzellen, sondert der Wirt auch Nährstoffe wichtig für bakterielle Überleben und die Replikation zu erzeugen Ernährungs Immunität 1, 2. Um diese feindlichen Umgebungen zu überleben, zu implementieren bakteriellen Erregern Virulenzfaktoren. Einige dieser Faktoren lassen sich die Bakterien die Immunantwort zu entziehen; Andere Faktoren sind Verdauungsenzyme, wie Hyaluronidase, Thermonuklease und Lipase sezerniert wird , die die Bakterien ermöglichen, fehlende Nährstoffe nachzufüllen von Gewebe stammenden Bestandteile 3, 4, 5 raubend. Tatsächlich Bakterien Regulierungssysteme entwickelt haben, die den physiologischen Zustand der Zelle zur Produktion von Virulenz - Faktoren binden 6, 7, <s<html> up class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9, 10. Eine wachsende Zahl von Hinweisen deutet auf CodY als entscheidender Regulator verbindet Stoffwechsel und Virulenz. Obwohl ersten 11 in Bacillus subtilis als Repressor des Dipeptids Permease (dpp) Gen entdeckt, wird CodY jetzt bekannt , um fast alle niedrigen G + C Gram-positive Bakterien , 12, 13 hergestellt werden und reguliert Dutzende von Genen in Kohlenstoff beteiligt und Stickstoffmetabolismus 14, 15, 16, 17, 18, 19. In pathogene Spezies, die Expression einiger der wichtigsten Virulenzgene 20, 21 CodY auch steuert,. ef &quot;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 CodY wird als ein DNA-bindendes Protein , das durch zwei Klassen von Liganden aktiviert: verzweigtkettigen Aminosäuren (BCAA, Isoleucin, Leucin und Valin [ILV]) und GTP . Wenn diese Nährstoffe reichlich vorhanden sind, reprimiert CodY (oder in einigen Fällen stimuliert) Transkription. Da diese Nährstoffe begrenzt werden, so wird CodY Aktivität progressiv verringert wird, in einer abgestuften Transkriptionsreaktion führt, daß erneut Routen durch verschiedene Stoffwechselwege Vorläufern zentralen Stoffwechsel verbunden 28, 29, 30. Tandem - Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (LC-MS) ist ein leistungsfähiges Verfahren , das genau identifizieren und quantifizieren , kann kleinmolekulare intrazelluläre Stoffwechselprodukte 31. Wenn mit umschrift gepaartriptome Analyse (zB RNA-Seq), dieser analytische Workflow kann Einblick in die physiologischen Veränderungen liefern , die in Reaktion auf Umwelt- oder Ernährungs Stress auftreten. Hier stellen wir ein Verfahren zur Extraktion von Metaboliten Staphylococcus aureus - Zellen und die anschließende Analyse mittels LC-MS. Dieser Ansatz wird verwendet, um die pleiotropen Wirkungen von CodY auf S. aureus Physiologie zu demonstrieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="933">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Material/Equipmenta</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">DeLong Culture Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:167px;">Belco</td>
			<td>2510-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sidearm Flask, 500 ml</td>
			<td style="width:167px;">Pyrex</td>
			<td style="width:163px;">5340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">3-hole Rubber Stopper, #7</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">14-131E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Stainless Steel Filter holder/frit</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td>89428-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Petri Dish, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">430588</td>
			<td>Not tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mixed cellulose ester membrane, 0.22 &#956;m pore size</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>GSWP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Impact-resistant tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:163px;">1420-9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Silica Beads, 0.1 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biospec Products Inc</td>
			<td>11079101Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td style="width:167px;">Bertin Instruments</td>
			<td style="width:163px;">EQ03119-200-RD000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:163px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Cogent Diamond hydride type C column</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">70000-15P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G6230B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Quat Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4204A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Bin Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4220A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Valve Drive, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1107A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Isocratic Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1310B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">TCC, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1316C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sampler, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4226A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Thermostat, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1330B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Chemical</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Difco Agar, Granulated</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">214530</td>
			<td>Solid media contains 1.5% [w/v] agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X</td>
			<td style="width:167px;">Ambion</td>
			<td style="width:163px;">AM9624</td>
			<td>Dilute fresh to 1X with ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A955-500</td>
			<td>Optima LC-MS</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Methanol</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A456-500</td>
			<td>Optima LC-MS; toxic</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">94318</td>
			<td>For mass spectrometry, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">MassHunter</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G3337AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Bacterial Strain</td>
			<td style="width:167px;">Species</td>
			<td style="width:163px;">Strain</td>
			<td>Genotype</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:363px;">SRB 337</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:363px;">SRB 372</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>&#916;codY::erm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:933px;">aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus

In dem Bemühen, bakterielle Pathogene zu vereiteln, begrenzen Wirte oft die Verfügbarkeit von Nährstoffen an dem Ort der Infektion. Diese Einschränkung kann die Häufigkeit von Schlüsselmetaboliten ändern, auf die regulatorischen Faktoren reagieren, den Zellstoffwechsel einstellen. In den letzten Jahren sind eine Reihe von Proteinen und RNA als wichtige Regulatoren der Genexpression Virulenz entstanden. Beispielsweise reagiert das CodY Protein auf ein Niveau von verzweigtkettigen Aminosäuren und GTP und ist in niedrigen G + C Gram-positiven Bakterien weitgehend konserviert. Als globaler Regulator in Staphylococcus aureus, steuert CodY die Expression von Dutzenden von Virulenz und metabolischen Gene. Wir vermuten , dass S. aureus verwendet CodY, teilweise seinen metabolischen Zustand in dem Bemühen , zu verändern , um Nährstoff einschränkenden Bedingungen möglicherweise begegneten in der Host - Umgebung anzupassen. Diese Handschrift beschreibt ein Verfahren zur Extraktion und Analyse von Metaboliten aus S. aureus unter Verwendung von Flüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometry, ein Protokoll, das entwickelt wurde, um diese Hypothese zu testen. Das Verfahren zeigt auch Best Practices, die Strenge und Reproduzierbarkeit gewährleisten, wie biologischen eingeschwungenen Zustand und konstante Belüftung ohne die Verwendung von kontinuierlichen Chemostatkulturen beibehalten wird. Relativ zu dem USA200 Methicillin-empfindlicher S. aureus UAMS-1 parentalen Stamm zu isolieren, zeigte die isogene Mutante codY signifikante Anstiege in Aminosäuren aus Aspartat abgeleitet (zB Threonin und Isoleucin) und nimmt in ihren Vorläufern (zB Aspartat und O - Acetylhomoserin ). Diese Ergebnisse korrelieren gut mit Transkriptions Daten mit RNA-Seq - Analyse erhalten: Gene in diesen Bahnen hochreguliert zwischen 10- und 800-fach in der codY Nullmutante waren. Die Kopplung globale Analysen der Transkriptom und Metabolom kann zeigen, wie Bakterien ihren Stoffwechsel verändern, wenn sie mit Umwelt- oder Ernährungs Stress konfrontiert, potenziellen Einblicks in die phys Bereitstellungiologische Veränderungen im Zusammenhang mit Nährstoffverarmung während der Infektion erfahren. Solche Entdeckungen können den Weg für die Entwicklung neuartiger Antiinfektiva und Therapeutika ebnen.

Wir haben während der in - vitro - Wachstum in einem reichen komplexen Medium intrazellulären Stoffwechselprodukt- Pools in S. aureus analysiert. Als Beweis für das Prinzip, verglichen wir Metabolitprofilen zwischen dem Methicillin-empfindlicher S. aureus Osteomyelitis isoliert UAMS-1 (Wildtyp [WT]) und einen isogenen Stamm , der den global Transkriptionsregulator CodY (Δ codY) 26 fehlt. Steady-state, exponentielle ...

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A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Extraktion von Metaboliten von Staphylococcus aureus und deren anschließenden Analyse mittels Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie.

Ein Tandem-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierter Ansatz zur Analyse von Metabolit<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

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Biochemistry

10.0K Aufrufe.  Georgetown University.  Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Extraktion von Metaboliten von Staphylococcus aureus und deren anschließenden Analyse mittels Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie. 

Serie: A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Eine leichte und effiziente Ansatz für die Produktion von Reversible Disulfid Vernetzte Mizellen

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Forschung

Biochemie

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, we developed IDBac&#8212;a low-cost and high-throughput matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) bioinformatics pipeline. IDBac software is designed for non-experts, is freely available, and capable of analyzing a few to thousands of bacterial colonies. Here, we present procedures for the preparation of bacterial colonies for MALDI-TOF MS analysis, MS instrument operation, and data processing and visualization in IDBac. In particular, we instruct users how to cluster bacteria into dendrograms based on protein MS fingerprints and interactively create Metabolite Association Networks (MANs) from specialized metabolite data.

IDBac is an open-source mass spectrometry-based bioinformatics pipeline that integrates data from both intact protein and specialized metabolite spectra, collected on cell material scraped from bacterial colonies. The pipeline allows researchers to rapidly organize hundreds to thousands of bacterial colonies into putative taxonomic groups, and further differentiate them based on specialized metabolite production.

Verwendung der Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline zur Analyse von mikrobiellen Protein- und Spezialisierten Metabolitendaten

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Ein anpassbarer Ansatz für die enzymatische Produktion und Reinigung von Diterpenoid Naturprodukten

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of biological membranes, energy storage and production, cellular signaling, vesicular transport of proteins, organelle biogenesis, and regulated cell death. Because the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a unicellular eukaryote amenable to thorough molecular analyses, its use as a model organism helped uncover mechanisms linking lipid metabolism and intracellular transport to complex biological processes within eukaryotic cells. The availability of a versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of major classes of lipids within a yeast cell is crucial for getting deep insights into these mechanisms. Here we present a protocol to use liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of major cellular lipids of S. cerevisiae. The LC-MS/MS method described is versatile and robust. It enables the identification and quantification of numerous species (including different isobaric or isomeric forms) within each of the 10 lipid classes. This method is sensitive and allows identification and quantitation of some lipid species at concentrations as low as 0.2 pmol/&#181;L. The method has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. The use of alternative mobile phase additives for electrospray ionization mass spectrometry in this method can increase the efficiency of ionization for some lipid species and can be therefore used to improve their identification and quantitation.

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry to identify and quantify major cellular lipids in Saccharomyces cerevisiae. The described method for a quantitative assessment of major lipid classes within a yeast cell is versatile, robust, and sensitive.

Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management of product yield and quality. Metabolomics data provides a read-out of these interactions at a given moment in time and is informative of an organism&#39;s biochemical status. Further, individual metabolites or panels of metabolites can be used as precise biomarkers for yield and quality prediction and management. The plant metabolome is predicted to contain thousands of small molecules with varied physicochemical properties that provide an opportunity for a biochemical insight into physiological traits and biomarker discovery. To exploit this, a key aim for metabolomics researchers is to capture as much of the physicochemical diversity as possible within a single analysis. Here we present a liquid chromatography-mass spectrometry-based untargeted metabolomics method for the analysis of field-grown wheat grain. The method uses the liquid chromatograph quaternary solvent manager to introduce a third mobile phase and combines a traditional reversed-phase gradient with a lipid-amenable gradient. Grain preparation, metabolite extraction, instrumental analysis and data processing workflows are described in detail. Good mass accuracy and signal reproducibility were observed, and the method yielded approximately 500 biologically relevant features per ionization mode. Further, significantly different metabolite and lipid feature signals between wheat varieties were determined.

A method for the untargeted analysis of wheat grain metabolites and lipids is presented. The protocol includes an acetonitrile metabolite extraction method and reversed phase liquid chromatography-mass spectrometry methodology, with acquisition in positive and negative electrospray ionization modes.

Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Ein Tandem-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierter Ansatz zur Analyse von Metabolit

Zusammenfassung

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