Name: preparation and characterization of novel hdl-mimicking nanoparticles for nerve growth factor encapsulation
Uploaded: 2017-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
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Diese Arbeit wurde von NIH R03 NS087322-01 an Dong, X.

ANMERKUNG: Die Tierstudien, die in allen Verfahren enthalten sind, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of North Texas Health Science Center genehmigt. 1. Vorbereitung von NGF-HDL-nachahmenden Nanopartikeln <ol><li> Lösen Sie die Exzipienten, Phosphatidylcholin (PC), Sphingomyelin (SM), Phosphatidylserin (PS), Cholesteryloleat (CO) und D-α-Tocopherylpolyethylenglykolsuccinat (TPGS) in Ethanol, um Stammlösungen bei 1 mg / ml zuzubereiten. HINWEIS: Die Stammlösungen wurden aliquotiert und bei -20 ° C gelagert. Das Cholesteryloleat wurde in dunklen Flaschen gelagert. Die PC-, SM-, PS- und CO-Stammlösungen waren für bis zu 6, 3, 12 und 12 Monate bei -20 ° C stabil. Die TPGS-Lösung war für mindestens 12 Monate bei -20 ° C stabil. </li><li> Mischen Sie 10 μl NGF (1 mg / ml in Wasser) mit 10 μl Protamin USP (1 mg / ml in Wasser) in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und lassen Sie es 10 min bei Raumtemperatur stehenBilden den Komplex. HINWEIS: Die NGF- und Protamin-Stammlösungen wurden aliquotiert und bei -20 ° C gelagert. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen wird für die NGF-Bestände nicht empfohlen. </li><li> Es werden 59 μl PC, 11 μl SM, 4 μl PS, 15 μl CO und 45 μl TPGS in eine Glasampulle gegeben. Das Ethanol wird unter einem sanften Stickstoffstrom für etwa 5 min vermischt und verdampft; Alle Hilfsstoffe sollten einen öligen, dünnen Film an der Unterseite der Glasampulle bilden. </li><li> Füge 1 ml ultrareines (Typ 1) Wasser in die Durchstechflasche und homogenisiere bei 9.500 U / min (8.600 xg) für 5 min bei Raumtemperatur, um die Prototyp-NPs zu bilden. </li><li> Fügen Sie den in Schritt 1.2 hergestellten Komplex zu den Prototyp-NPs hinzu und inkubieren Sie bei 37 ° C für 30 min unter Rühren unter Verwendung eines kleinen Rührstabes in der Glasampulle. <ol><li> Die NPs unter Rühren bei Raumtemperatur weitere 30 min abkühlen lassen. Danach werden 106 μl Apo AI (1,49 mg / ml) zugesetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, um das Finale zu bildenNGF HDL-Nachahmung von NPs. </li></ol></li></ol> 2. Charakterisierung von NGF-HDL-Mimik-Nanopartikeln <ol><li> Messen Sie die Partikelgröße und das Zetapotential mit einem Partikelanalysator (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verwenden Sie eine vernetzte Agarose-Gelfiltrationschromatographie-Säule, um das unbelastete NGF von den NGF-HDL-imitierenden NPs zu trennen und die Einfangwirkung des NGF zu bestimmen. <ol><li> Für die Säulenpräparation 15 ml Sepharose 4B-CL Suspension in ein 50-ml-Becherglas überführen. Die Wulstaufhängung mit einem Glasstab umrühren und etwas in eine Säule geben (30 cm Länge × 1 cm Durchmesser, mit einer Glasfritte an der Unterseite). Vorsicht tippen Sie auf die Säule, um Blasen loszuwerden. Lassen Sie das Lösungsmittel abtropfen lassen und die Perlen für ein paar Minuten absetzen. </li><li> Weiter führe die restliche Aufhängung hinzu. Spülen Sie die Innenwand der Säule, um die Perlen zu reinigen. Das Lösungsmittel abtropfen lassen, bis der Lösemittelgehalt geringfügig istBove die Oberseite der stationären Phase. Waschen und Konditionieren der Säule mit 20 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, enthaltend 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4 und 2 mM KH 2 PO 4 ). </li><li> Um die Fraktionen mit unbelastetem NGF zu bestimmen, werden 200 μl NGF-Lösung (10 μg / mL) auf die Gelfiltrationssäule (25 cm Länge x 1 cm Durchmesser) gegeben und mit 1x PBS eluiert. </li><li> Sammeln Sie insgesamt 12 Fraktionen (1 ml für jede Fraktion) und messen Sie die Konzentration von NGF in jeder Fraktion mit einem Sandwich ELISA Kit für NGF. </li><li> Erfassen Sie NGF aus den Fraktionen 6 bis 10 mit dem Sandwich ELISA Kit. Erhalten Sie ein Chromatogramm von unbelastetem NGF auf der Säule. Die Säule mit 20 ml PBS waschen. </li><li> Um die Fraktionen zu bestimmen, die NGF-HDL-imitierende NPs enthalten, beladen Sie 200 &amp; mgr; l der NPs auf die Säule und eluieren mit 1x PBS. Sammeln Sie insgesamt 12 Fraktionen (1 ml für jede Fraktion) und messen Sie die Intensität der Partikel in jeder Fraktion uSingen Sie den Partikelgrößenanalysator. Erkennung der NGF-NPs aus den Fraktionen 2 bis 4. HINWEIS: Die Intensität ist ein Parameter, der von dem Partikelanalysator gemessen wird, der angibt, wie viele Nanopartikel in der Testlösung vorhanden sein können. Je mehr NPs in Lösung existieren, desto höher ist die Intensität. Durch diesen Ansatz können wir bestätigen, dass die Spalte NGF-NPs von unbelastetem NGF trennen kann. </li><li> Um die Einfangwirkung von NGF zu messen, laden Sie 200 μl NGF HDL-nachgeahmte NPs auf die Säule und eluieren mit 1x PBS. Sammle insgesamt 12 Fraktionen (1 ml für jede Fraktion). </li><li> Messen Sie die unbelastete NGF-Konzentration von den Fraktionen 6 bis 10 mit dem Sandwich ELISA Kit. </li><li> Fügen Sie die NGF-Mengen, die von den Fraktionen 6 bis 10 gemessen wurden, zusammen als das unbelastete NGF und berechnen Sie die Einfangwirkung von NGF unter Verwendung der folgenden Gleichung. % EE = (1 - unbelastetes NGF / Gesamt-NGF in NP) x 100% Gleichung (1) </li></ol></li></ol> 3. In vitro Freisetzung von NGF HDL-Mimiking Nanopartikel <ol><li> NGF (10 μg / ml in n = 4) und NGF HDL-nachahmenden NPs (10 μg / mL; n = 4) parallel untersuchen. </li><li> Vorbehandeln von 8 Dialyse-Röhrchen (Molekulargewichts-Cutoff: 300 kDa) nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Bereiten Sie 5% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS als Freisetzungsmedium vor. Füge 30 ml Freisetzungsmedium zu einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen hinzu und erwärme es bis zu 37 ° C in einem Schüttler mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 135 U / min. Legen Sie weitere 50 ml Freisetzungsmedium in den Schüttler für den Austausch. </li><li> Fügen Sie 400 μl Freisetzungsmedium in das Dialyseschlauch hinzu und fügen Sie schnell 200 μl der getesteten Probe hinzu, um genügend Volumen für die Dialyse zu machen. </li><li> Schließen Sie den Schlauch und setzen Sie den Dialyseschlauch schnell in das Trennmedium (das Zentrifugenröhrchen). Ziehen Sie schnell 100 μl des Trennmediums aus dem äußeren Dialyseschlauch als Probe für die Zeit 0 ab. Setzen Sie die Probe sofort in -20 ° C für eine spätere Analyse ein. 100 μl frische ReLeasing-Medium in das Zentrifugenröhrchen, um die entnommene Probe zu ersetzen. Starten Sie den Timer. </li><li> Bei 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 und 72 h werden 100 μl des Trennmediums abgezogen und mit 100 μl frischem Medium ersetzt. Setzen Sie die entnommenen Proben sofort in -20 ° C für die spätere Analyse ein. </li><li> Nach 72 h alle Proben von -20 ° C herausnehmen und bei Raumtemperatur auftauen. Messen Sie die NGF-Konzentrationen der Freisetzungsproben mit dem Sandwich ELISA Kit. </li></ol> 4. Bioaktivität von NGF-HDL-nachgeahmten Nanopartikeln (Neurite Outgrowth Study) <ol><li> Kultur-PC12-Zellen in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem Pferdeserum, 5% fötalem Rinderserum, 100 μg / ml Streptomycin und 100 Einheiten / ml Penicillin. Halten Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und mit 5% CO 2 . </li><li> Wenn die Zellen ~ 60-80% Konfluenz erreichen, entfernen Sie das Kulturmedium und waschen die Zellen mit 1x PBS (ca. 2 ml pro 10 cm &lt;)Sup&gt; 2 Kulturfläche). Entfernen Sie die Waschlösung. Trypsinisieren der Zellen durch Zugabe von 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung (0,25% Trypsin und 1 mM EDTA, 0,5 ml pro 10 cm 2 Kulturoberfläche) in den Kolben und inkubieren bei 37 ° C, bis die meisten Zellen abgelöst sind. </li><li> Füge zwei Volumina Kulturmedium hinzu und spinze bei 180 xg für 5 min ab. Den Überstand entfernen und das Zellpellet in 5 ml Kulturmedium resuspendieren. Filtern Sie die Zellen durch eine 22 G, ½ Zoll Nadel, um Zellcluster zu brechen. </li><li> Die Zellen im Verhältnis 1: 3 in einen neuen Zellkulturkolben aufteilen. Nach der Inkubation über Nacht, entfernen Sie ungebundene PC12-Zellen. Lassen Sie die angehängten Zellen für weiteres Wachstum bleiben. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für 3 Passagen, um die Subkultur von PC12 auszuwählen, die eine starke Adhäsionseigenschaft aufweist. Vorbereiten einer 6-Well-Platte mit 800 &amp; mgr; l / Vertiefung des Rattenschwanzkollagen Typ I (100 &amp; mgr; g / ml). </li><li> Trypsinisieren Sie die ausgewählten PC12-Zellen wie in Schritt 4.2 beschrieben und filtrieren sie durch eine22 G, ½ Zoll Nadel, um die Zellcluster zu brechen. Zähle die Zellen mit einem Hämocytometer. Die Zellen über Nacht mit einer Dichte von 10.000 Zellen / Vertiefung in der vorbeschichteten 6-Well-Platte in Schritt 4,5 abgesaugt, um die Zellen an der Platte zu befestigen. </li><li> Verdünnen Sie freie NGF (10 μg / ml) und NGF HDL-imitierende NPs (10 μg / ml) mit dem Kulturmedium (beschrieben in Schritt 4.1), um 0,5, 1, 5, 10, 50 und 100 ng / ml-Konzentrationen herzustellen. 2 ml Medium aus jeder Vertiefung entfernen und mit 2 ml der verdünnten freien NGF- oder NGF-HDL-Mimik-NPs ersetzen. Kultur für 4 Tage. </li><li> Am Tag 4 wechseln Sie das Medium auf frisches Medium (beschrieben in Schritt 4.1), das die entsprechende Behandlung enthält und die Behandlung für weitere 3 Tage fortsetzt. </li><li> Am Tag 7, visualisieren Sie die Zellen mit einem invertierten Lichtmikroskop und Bild jedes gut an zufälligen Flecken unter 10facher Vergrößerung. </li></ol> 5. Biodistribution von NGF HDL-nachahmenden Nanopartikeln <ol><li> Verwenden Sie erwachsene BALB / c-Mäuse (männlich, 25-30 g) bis tEst die Gewebeverteilung von NGF-NPs. Gelegentlich teilen die Mäuse in drei Gruppen von 3 Mäusen pro Gruppe. Verwenden Sie eine kegelförmige Kunststoff-Rückhaltevorrichtung ( zB Decapicone), um eine Maus zurückzuhalten und den Schwanz mit Ethanol zu wischen, um die Vasodilatation und die Sichtbarkeit der Vene zu fördern. </li><li> In einer Dosis von 40 &amp; mgr; g / kg NGF werden 100 &amp; mgr; l entweder Kochsalzlösung, freie NGF oder NGF HDL-nachgeahmte NPs zu jeder Gruppe von Mäusen (3 Gruppen) durch die Schwanzvenen injiziert. Verwenden Sie eine 30 ½ G-Nadel, die an einer 1-ml-Spritze befestigt ist. </li><li> Nach 30 Minuten nach der Injektion die Mäuse mit 3% inhaliertem Isofluran (in Sauerstoff bei einer Durchflussmenge von 2 l / min) anästhesieren. Führen Sie eine Schwanz-und Zehen-Prise, um die Tiefe der Anästhesie zu bestimmen. Blut durch Herzpunktion sammeln. <ol><li> Ziehe ungefähr 1 ml Blut aus dem Herzen. Euthanisieren jede Maus durch zervikale Versetzung. </li></ol></li><li> Legen Sie die Maus Karkasse in dorsal Recumbency. Öffnen Sie den Bauch mit chirurgischen Scheren und bewegen Sie Fett und Darm beiseiteMit einem Wattestäbchen, um Leber, Milz und Niere auszusetzen. Ernten Sie diese Gewebe und spülen Sie sie in 1x PBS, um das Blut zu reinigen. </li><li> Die Blutproben sofort bei 3.400 xg und 4 ° C für 5 min zentrifugieren, um das Plasma zu erhalten. Das Plasma und das Gewebe bei -80 ° C bis zur Analyse aufbewahren. </li><li> Um die Gewebeproben zu analysieren, bewegen Sie die Proben von -80 ° C auf 4 ° C und suspendieren 100 mg Gewebeprobe in einem 10-fachen Volumen des Extraktionspuffers (0,05 M Natriumacetat, 1,0 M Natriumchlorid, 1% Triton X-100, 1% BSA, 0,2 mM Phenylmethansulfonylfluorid und 0,2 mM Benzethoniumchlorid). Bei 10.000 U / min und 4 ° C für 5 min homogenisieren. </li><li> Opfer zwei unbehandelte Mäuse, um leeres Plasma und Gewebe zu sammeln, wie in den Schritten 5.3 und 5.4 beschrieben. NGF-Standardlösungen mit leeren Plasma- oder Blindgewebe-Homogenaten vorbereiten. </li><li> Bestimmen Sie die Konzentrationen von NGF in den Plasma- und Gewebehomogenaten mit dem Sandwich-ELISA-Kit, wie oben beschrieben. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In dieser Studie zeigen wir eine einfache Methode zur Vorbereitung von HDL-Mimik-NPs für die NGF-Kapselung. Verschiedene NP-Abgabesysteme wurden untersucht, um Proteine ​​zu liefern. Derzeit umfassen viele NP-Präparate Dialyse, Lösungsmittelabscheidung und Filmhydratation. Diese Prozesse sind im Allgemeinen kompliziert und anspruchsvoll beim Scale-up. Während dieser NP-Entwicklung wurde festgestellt, dass die Lipide eine starke Haftung an der Glaswand des Behälters hatten, was zu den Schwierigkeiten bei der Hyd...

Makromoleküle wie Proteine, Peptide und Nukleinsäuren sind als vielversprechende Medikamente aufgetaucht und haben in den vergangenen Jahrzehnten erhebliche Aufmerksamkeit erlangt 1 , 2 . Aufgrund ihrer hohen Wirksamkeit und spezifischen Wirkungsweisen zeigen sie ein großes therapeutisches Potenzial für die Behandlung von Krebs, Immunerkrankungen, HIV und verwandten Bedingungen 3 , 4 . Jedoch machen physiochemische Eigenschaften, wie ihre große molekulare Größe, dreidimensionale Struktur, Oberflächenladungen und hydrophile Natur, die in vivo- Abgabe dieser Makromoleküle sehr anspruchsvoll. Dies beeinträchtigt ihre klinische Anwendung erheblich 4 . Jüngste Fortschritte in Arzneimittelabgabesystemen wie Mikropartikeln, Polymer-Nanopartikeln, Nerven, Liposomen und Lipid-NPs, überwand diese Herausforderungen und verbesserte die in vivo- Zufuhr von Makromolekülen erheblich. HoWeil, einige Nachteile in Bezug auf diese Liefergüter wurden aufgedeckt, einschließlich niedrige Drogenbelastung Kapazität, niedrige Einschluss Effizienz, kurze Halbwertszeit, Verlust der Bioaktivität und unerwünschte Nebenwirkungen 5 , 6 , 7 , 8 . Effektive Trägersysteme bleiben ein Forschungsgebiet. Darüber hinaus ist die Entwicklung von analytischen Methoden zur Charakterisierung von Arzneimittel-geladenen NPs für Makromoleküle schwieriger als für kleine Moleküle. High-Density-Lipoprotein (HDL) ist ein natürlicher NP, der aus einem Lipidkern besteht, der mit Apolipoproteinen und einer Phospholipidmonoschicht beschichtet ist. Endogene HDL spielt eine wichtige Rolle beim Transport von Lipiden, Proteinen und Nukleinsäuren durch ihre Wechselwirkung mit Zielrezeptoren wie SR-BI, ABCAI und ABCG1. Es wurde als Vehikel für die Lieferung von verschiedenen therapeutischen Mitteln untersucht 9, 10 , 11 , 12 . Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um HDL-mimicking NPs vorzubereiten. Dialyse ist ein beliebter Ansatz. Bei diesem Verfahren werden NPs durch Hydratisierung eines Lipidfilms unter Verwendung von Natriumcholatlösung gebildet. Das Salz wird dann durch eine 2-tägige Dialyse mit drei Puffern 13 entfernt . Sonessionsverfahren herstellen NPs durch Beschallung einer Lipidmischung für 60 min unter einer Heizbedingung; Die NPs werden durch Gelchromatographie weiter gereinigt. Mikrofluidik erzeugt NPs über eine mikrofluidische Vorrichtung, die Phospholipide und Apolipoprotein AI (Apo AI) Lösungen durch die Herstellung von Mikrovortices in einem Fokussierungsmuster 15 vermischt. Klar, diese Methoden können zeitraubend, hart und schwierig für industrielle Scale-up. In diesem Artikel stellen wir die Vorbereitung und Charakterisierung von neuartigen HDL-mimicking NPs für Nerven vorWachstumsfaktor (NGF) Verkapselung. NGF ist ein Disulfid-verknüpftes Polypeptid-Homodimer, das zwei 13,6-kDa-Polypeptidmonomere enthält. Ein neuartiges Verfahren zur Herstellung der NPs durch Homogenisierung, gefolgt von der Verkapselung von NGF in die NPs, wurde entwickelt. Die NGF-HDL-imitierenden NPs wurden für Partikelgröße, Größenverteilung, Zetapotential und in vitro Freisetzung charakterisiert. Ihre Bioaktivität wurde für das Neuritenwachstum in PC12-Zellen untersucht. Die Biodistribution von NGF-HDL-imitierenden NPs wurde mit der von freiem NGF nach intravenöser Injektion bei Mäusen verglichen.

<table><tbody><tr><td>Recombinant Human Beta-NGF</td><td>Creative Biomart</td><td>NGF-05H</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Phosphatidylcholine (PC)</td><td>Avanti</td><td>131601P</td><td>95%, Egg, Chicken</td></tr><tr><td>Sphingomyelin (SM)</td><td>Avanti</td><td>860062P</td><td>Brain, Porcine</td></tr><tr><td>Phosphatidylserine (PS)</td><td>Avanti</td><td>840032P</td><td>Brain, Porcine</td></tr><tr><td>Cholesteryl oleate (CO)</td><td>Sigma</td><td>C9253</td><td></td></tr><tr><td>D-&amp;alpha;-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS)</td><td>BASF</td><td>9002-96-4</td><td>Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate</td></tr><tr><td>Protamine sulfate</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>meets USP testing specifications</td></tr><tr><td>Apolipoprotein A1, Human plasma</td><td>Athens Research &amp;amp; Technology</td><td>16-16-120101</td><td>1 mg in 671 &amp;micro;L 10 mM NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;HCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, pH 7.4</td></tr><tr><td>Sepharose 4B-CL</td><td>Sigma</td><td>CL4B200</td><td>Cross-linked agarose,&amp;nbsp; gel filtration chromatography column filling material</td></tr><tr><td>Sandwich ELISA Kit for NGF</td><td>R&amp;amp;D system</td><td>DY008</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>SH30096.02</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>PC12 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1721</td><td></td></tr><tr><td>Rat tail collagen type I</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>31414</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Benzethonium chloride</td><td>Sigma</td><td>B8879</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer</td><td>Tekmar</td><td>T 25-S1</td><td></td></tr><tr><td>Delsa Nano HC particle analyzer</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Delsa Nano HC</td><td></td></tr><tr><td>Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>G235036</td><td>Molecule Cutoff 300 kDa</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendoff</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Polytron homogenizer</td><td>Kinematica</td><td>PT 1200C</td><td></td></tr><tr><td>DecapiCone</td><td>&amp;nbsp;Braintree Scientific Inc.</td><td>DC-M200</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation and characterization of novel hdl-mimicking nanoparticles for nerve growth factor encapsulation

Das Ziel dieses Artikels ist es, Präparations- und Charakterisierungsmethoden für Nervenwachstumsfaktor (NGF) -belastete, hochdichte, lipoprotein (HDL) -Mimiking-Nanopartikel (NPs) einzuführen. HDLs sind endogene NPs und wurden als Vehikel für die Lieferung von therapeutischen Mitteln untersucht. Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um HDL-mimicking NPs vorzubereiten. Allerdings sind sie in der Regel kompliziert, zeitaufwendig und schwierig für die industrielle Scale-up. In dieser Studie wurde eine einstufige Homogenisierung verwendet, um die Hilfsstoffe zu mischen und die Prototyp-NPs zu bilden. NGF ist ein wasserlösliches Protein von 26 kDa. Um die Verkapselung von NGF in die Lipidumgebung von HDL-imitierenden NPs zu erleichtern, wurde Protamin USP verwendet, um einen Ionenpaarkomplex mit NGF zu bilden, um die Ladungen auf der NGF-Oberfläche zu neutralisieren. Der NGF / Protamin-Komplex wurde dann in die Prototyp-NPs eingeführt. Apolipoprotein AI wurde schließlich auf die Oberfläche der NPs aufgetragen. NGF HDL-imitieren NPs zeigten bevorzugte Eigenschaften im BegriffS Partikelgröße, Größenverteilung, Einfangwirkung, In-vitro- Freisetzung, Bioaktivität und Biodistribution. Mit dem sorgfältigen Design und der Erforschung der Homogenisierung in HDL-imitierenden NPs wurde das Verfahren stark vereinfacht und die NPs wurden skalierbar gemacht. Darüber hinaus wurden verschiedene Herausforderungen wie die Trennung von unbelastetem NGF von den NPs, die Durchführung zuverlässiger in vitro- Freisetzungsuntersuchungen und die Messung der Bioaktivität der NPs überwunden.

Das Engineering-Schema von HDL-imitierenden, α-Tocopherol-beschichteten NGF-NPs, die durch eine Ionenpaar-Strategie hergestellt wurden, ist in 1 gezeigt . Um die Oberflächenladungen von NGF zu neutralisieren, wurde Protamin USP als Ionenpaarmittel verwendet, um einen Komplex mit NGF zu bilden. Um die Bioaktivität zu schützen, wurden Prototyp-HDL-imitierende NPs entwickelt, zuerst mit Homogenisierung; Dann wurde der NGF / Protamin-Komplex in die Prototyp-NPs eingekaps...

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Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Eine einfache Homogenisierung wurde verwendet, um neuartige, hochdichte, lipoproteinimimierende Nanopartikel herzustellen, um den Nervenwachstumsfaktor einzukapseln. Herausforderungen, detaillierte Protokolle für die Nanopartikelpräparation, in vitro Charakterisierung und in vivo Studien sind in diesem Artikel beschrieben.

Vorbereitung und Charakterisierung von neuartigen HDL-imitierenden Nanopartikeln für die Nervenwachstumsfaktorverkapselung

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

preparation-characterization-novel-hdl-mimicking-nanoparticles-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.3K Aufrufe.  University of North Texas Health Science Center.  Eine einfache Homogenisierung wurde verwendet, um neuartige, hochdichte, lipoproteinimimierende Nanopartikel herzustellen, um den Nervenwachstumsfaktor einzukapseln. Herausforderungen, detaillierte Protokolle für die Nanopartikelpräparation, in vitro Charakterisierung und in vivo Studien sind in diesem Artikel beschrieben. 

Serie: Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1&#945; (Stromal cell-derived factor-1&#945;), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1&#945;-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1&#945; is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1&#945;, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1&#945; from the nanoparticles.

Herstellung und Charakterisierung von SDF-1α-Chitosan-Nanopartikel Dextransulfat

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

Forschung

Chemie

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Elektro Growth Factor Releasing Mikrosphären in Fasergerüste

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Biotechnik

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Gezielte Plasma Membrane Lieferung eines Hydrophobic Transport Encapsulated in einem Liquid Crystal Nanoparticle Träger

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. Nanodisks are organized as a disk-shaped lipid bilayer whose perimeter is circumscribed by the scaffold protein, usually a member of the exchangeable apolipoprotein family. Numerous hydrophobic bioactive agents have been efficiently solubilized in nanodisks by their integration into the hydrophobic milieu of the particle&#39;s lipid bilayer, yielding a largely homogenous population of particles in the range of 10-20 nm in diameter. The formulation of nanodisks requires a precise ratio of individual components, an appropriate sequential addition of each component, followed by bath sonication of the formulation mixture. The amphipathic scaffold protein spontaneously contacts and reorganizes the dispersed bilayer forming lipid/bioactive agent mixture to form a discrete, homogeneous population of nanodisk&#160;particles. During this process, the reaction mixture transitions from an opaque, turbid appearance to a clarified sample that, when fully optimized, yields no precipitate upon centrifugation. Characterization studies involve the determination of bioactive agent solubilization efficiency, electron microscopy, gel filtration chromatography, ultraviolet visible (UV/Vis) absorbance spectroscopy, and/or fluorescence spectroscopy. This is normally followed by an investigation of biological activity using cultured cells or mice. In the case of nanodisks harboring an antibiotic (i.e., the macrolide polyene antibiotic amphotericin B), their ability to inhibit the growth of yeast or fungi as a function of concentration or time can be measured. The relative ease of formulation, versatility with respect to component parts, nanoscale particle size, inherent stability, and aqueous solubility permits myriad in vitro and in vivo applications of nanodisk technology. In the present article, we describe a general methodology to formulate and characterize nanodisks containing amphotericin&#160;B as the hydrophobic bioactive agent.

Here, we describe the production and characterization of bioactive agents containing nanodisks. Amphotericin B nanodisks are taken as an example to describe the protocol in a stepwise manner.

Formulierung und Charakterisierung bioaktiver Wirkstoffe, die Nanoscheiben enthalten

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

Biochemie

<meta charset="utf8"></head><body>Eisenoxid-Nanopartikel für die bildgestützte Therapieverabreichung beim murinen Glioblastom

Nanoparticle Delivery of an Oligonucleotide Payload in a Glioblastoma Multiforme Animal Model

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive form of primary brain malignancy for which there is no cure. The blood-brain barrier is a significant hurdle in the delivery of therapies to GBM. Reported here is an image-guided, iron oxide-based therapeutic delivery nano platform capable of bypassing this physiological barrier by virtue of size and accumulating in the tumor region, delivering its payload. This 25 nm nano platform consists of crosslinked dextran-coated iron oxide nanoparticles labeled with Cy5.5 fluorescent dye and containing antisense oligonucleotide as a payload. The magnetic iron oxide core enables tracking of the nanoparticles through in vivo magnetic resonance imaging, while Cy5.5 dye allows tracking by optical imaging. This report details the monitoring of the accumulation of this nanoparticle platform (termed MN-anti-miR10b) in orthotopically implanted glioblastoma tumors following intravenous injection. In addition, it provides insight into the in vivo delivery of RNA oligonucleotides, a problem that has hampered the translation of RNA therapeutics into the clinic.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Innovative Krebstherapien mit Eisenoxid-Nanopartikeln zur Behandlung von Glioblastomen

The blood-brain barrier is a significant hurdle in the delivery of therapies for glioblastoma, a disease for which there is no cure. Here, we report an in vivo image-guided iron oxide therapeutic nano platform that can bypass this physiological barrier by virtue of size and accumulate in the tumor.

Nanopartikel-Verabreichung einer Oligonukleotid-Nutzlast in einem Glioblastom-Multiforme-Tiermodell

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive form of primary brain malignancy for which there is no cure. The blood-brain barrier is a ...

Krebsforschung

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive properties of in vitro transcribed (IVT) mRNA. With the help of IVT mRNA, the de novo synthesis of a desired protein can be induced without changing the physiological state of the target cell. Moreover, protein biosynthesis can be precisely controlled due to the transient effect of IVT mRNA.
For the efficient transfection of cells, nanoliposomes (NLps) may represent a safe and efficient delivery vehicle for therapeutic mRNA. This study describes a protocol to generate safe and efficient cationic NLps consisting of DC-cholesterol and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) as a delivery vector for IVT mRNA. NLps having a defined size, a homogeneous distribution, and a high complexation capacity, and can be produced using the dry-film method. Moreover, we present different test systems to analyze their complexation and transfection efficacies using synthetic enhanced green fluorescent protein (eGFP) mRNA, as well as their effect on cell viability. Overall, the presented protocol provides an effective and safe approach for mRNA complexation, which may advance and improve the administration of therapeutic mRNA.

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Here we describe a protocol for the generation of cationic nanoliposomes, which is based on the dry-film method and can be used for the safe and efficient delivery of in vitro transcribed messenger RNA.

Generation von kationischen Nanoliposomes für die effiziente Bereitstellung von In-vitro- transkribiert Boten-RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

Gestaltung von porösem Silizium Filme als Träger von Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Aufnahme von neuen Lipid-beschichteten Nanopartikeln mit Falcarindiol von humanen mesenchymalen Stammzellen

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Vorbereitung und Charakterisierung von neuartigen HDL-imitierenden Nanopartikeln für die Nervenwachstumsfaktorverkapselung

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Herstellung und Charakterisierung von SDF-1α-Chitosan-Nanopartikel Dextransulfat

Elektro Growth Factor Releasing Mikrosphären in Fasergerüste

Gezielte Plasma Membrane Lieferung eines Hydrophobic Transport Encapsulated in einem Liquid Crystal Nanoparticle Träger

Formulierung und Charakterisierung bioaktiver Wirkstoffe, die Nanoscheiben enthalten

Nanopartikel-Verabreichung einer Oligonukleotid-Nutzlast in einem Glioblastom-Multiforme-Tiermodell

Nanopartikel-Verabreichung einer Oligonukleotid-Nutzlast in einem Glioblastom-Multiforme-Tiermodell

Nanopartikel-Verabreichung einer Oligonukleotid-Nutzlast in einem Glioblastom-Multiforme-Tiermodell

Generation von kationischen Nanoliposomes für die effiziente Bereitstellung von In-vitro- transkribiert Boten-RNA

Gestaltung von porösem Silizium Filme als Träger von Nerve Growth Factor

Aufnahme von neuen Lipid-beschichteten Nanopartikeln mit Falcarindiol von humanen mesenchymalen Stammzellen