Name: protein-trna agarose gel retardation assays for the analysis of the n6-threonylcarbamoyladenosine tcda function
Uploaded: 2017-06-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function at JoVE.com

MCV ist Mitglied des CIB Intramural Programms &quot;Molecular Machines for Better Life&quot; (MACBET). Die Forschungsergebnisse, die zu diesen Ergebnissen führten, wurden vom spanischen Instituto de Salud Carlos III (PI12 / 01667 bis MCV), dem spanischen Ministerio de Economía y Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R und SAF2015-72961-EXP bis MCV) gefördert ), Die Regionalregierung von Madrid (S2010 / BD-2316 bis MCV) und die Europäische Kommission (Rahmenprogramm 7 (RP7)) Projekt ComplexINC (Vertrag Nr. 279039 bis MCV). Die Förderer hatten keine Rolle in Studienentwurf, Datenerfassung und -analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts.

Achtung: Vor dem Gebrauch alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) beachten. Mehrere der in diesem Protokoll verwendeten Chemikalien sind toxisch und korrosiv. Verwenden Sie geeignete Praktiken bei der Durchführung der Extraktion von tRNA mit Phenol, einschließlich der Verwendung einer Dunstabzugshaube und persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Laborkittel, Volllängenhosen, Schuhspitzen, etc. ). Dieses Protokoll verwendet einen nicht-toxischen Nukleinsäure-Fleck. Die Verwendung von alternativen Flecken kann zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen und die spezialisierte Entsorgung des Färbemittels erfordern, wenn sie toxisch und / oder krebserregend sind ( z . B. Ethidiumbromid). 1. Vorbereitung des Agarosegels <ol><li> 2 g Agarose wiegen und zu einer Glasflasche geben, um ein 2% iges w / v Agarosegel zuzubereiten. </li><li> Füge 100 ml von 1 × tris-borat-ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (TBE) laufenden Puffer zu der agarosehaltigen Flasche hinzu. Schmelzen durch Erhitzen in einer Mikrowelle. In 30 s Intervallen, swirl die Inhalte zu mischenGut und wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist. Lassen Sie die Agarose-Lösung auf ca. 50-60 ° C abkühlen. </li><li> Tape die offenen Kanten eines Gel-Tray, um eine Form zu schaffen, legen Sie einen geeigneten Kamm, um die Brunnen zu schaffen und die geschmolzene Agarose in sie zu werfen. Vermeiden Sie die Blasenbildung und lassen Sie sie bei Raumtemperatur erstarren. </li><li> Nach dem Erstarren legen Sie den Gelträger in eine Elektrophoreseeinheit und füllen ihn mit TBE-Puffer, bis das Gel vollständig bedeckt ist. </li></ol> 2. Vorbereitung der tRNA <ol><li> Express-tRNA (UUU) in E. coli <ol><li> Am Morgen wird ein mit dem Expressionsvektor pET23d-EcUUU 2 transformiertes Fläschchen mit gefrorenem E. coli BL21 (DE3) verwendet, das das für E. coli tRNA (UUU) kodierende Gen enthält, um eine salzarme Luria Brühe (LB) Platte, ergänzt mit 100 μg / ml Ampicillin. Umkehren Sie die Platte und legen Sie sie in einen 37 ° C Inkubator, bis Kolonien erscheinen (spät nachtOon) </li><li> Inokulieren einer gut gewachsenen Einzelkolonie in 5 ml LB plus 100 μg / ml Ampicillin und wachsen über Nacht bei 220 U / min bei 37 ° C. </li><li> Am nächsten Morgen pellet man die Zellen (6.500 xg für 10 min bei 4 ° C), ersetzen Sie das Medium mit 5 mL frischem LB plus 100 μg / mL Ampicillin und resuspend. Verwenden Sie diese Suspension, um 200 ml LB plus 100 μg / ml Ampicillin zu inokulieren. Für 5 h bei 220 U / min bei 37 ° C wachsen. </li><li> Wenn die optische Dichte der Kultur bei 590 nm (OD 590 ) 0,6 - 0,8 erreicht hat, füge 1 mM IPTG zur Kultur hinzu, um die Expression des tRNA (UUU) -Gens auszulösen. Inkubieren bei 37 ° C für 3 h. </li><li> Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugieren der Kultur bei 6.500 xg für 10 min bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Lyse und Extraktion <ol><li> Das Zellpellet wird in 5 ml Lysepuffer (0,3 M Natriumacetat, 10 mM EDTA) resuspendiert. Von diesem Zeitpunkt an benutzten autoklavierte Puffer und halten alle tRNA-haltigen Proben bei 4 ° C, um t zu verhindernRNA-Abbau </li><li> Füge 1 Volumen Säurephenol (pH 4,3) zum resuspendierten Zellpellet in der Dunstabzugshaube hinzu. Mischen für 1 min durch Inversion, um die Zellen zu lysieren und bei 10.000 xg (10 min, 4 ° C) zu zentrifugieren. </li><li> Sammeln Sie die obere wässrige Phase, die die lösliche tRNA (UUU) (und kleinere Konzentrationen der anderen tRNA-Pools) enthält, unter Verwendung einer Pipette, wobei darauf geachtet wird, dass die organische (untere) Phase nicht abgesaugt wird. Verwerfen Sie die untere Schicht und das Pellet, das aus der organischen Phase und Zelltrümmer besteht, in einen geeigneten Behälter. </li><li> Ausfällen der tRNA durch gründliches Mischen der löslichen (wässrigen) Phase mit 2,5 Vol .-% 100% V / V Ethanol durch Inversion für 1 h bei 4 ° C. Die Mischung wird bei 15.000 xg (30 min, 4 ° C) zentrifugiert. </li><li> Den Überstand sorgfältig dekantieren und das tRNA-reiche Pellet in 4 mL Gelfiltrationspuffer (20 mM Natriumphosphat oder Kaliumphosphat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA) resuspendieren. Führen Sie 5 μl des resuspendierten tRNA-Pools auf einem 2% w / v Agarosegel. HINWEIS:Gute Qualität tRNA erscheint als Einzelband (Molekulargröße zwischen 50-100 bp). </li></ol></li><li> Reinigung von tRNA (UUU) <ol><li> Nach der üblichen chromatographischen Praxis 12 beladen die resuspendierte tRNA (UUU) auf eine hochauflösende präparative Gelfiltrationssäule (Abmessungen: 16 x 600 mm, Bettvolumen: 120 mL, Auflösungsbereich: 1.000-70.000 Da), die zuvor im Gelfiltrationspuffer äquilibriert wurden (Mobile Phase). Stellen Sie den Durchfluss auf 1 mL / min ein, um die Proben zu eluieren. HINWEIS: Der tRNA (UUU) Peak eluiert etwa bei 75,5 ml. Typischerweise kann eine Ausbeute von 0,5-1,0 mg / l tRNA der Kultur erhalten werden. </li><li> Analysieren Sie die Proben bei repräsentativen Elutionsvolumina durch Elektrophorese von 5 - 10 &amp; mgr; l jeder Probe auf einem 2% w / v Agarosegel. </li></ol></li></ol> 3. Probenvorbereitung <ol><li> Express und Reinigung von TcdA nach López-Estepa et al . 2 HINWEIS: Bis zu 250 μMTcdA kann für die Studie verwendet werden. </li><li> Die entsprechende Menge an TcdA gemäß Tabelle 1 in gut markierte 1,5 mL Zentrifugenröhrchen pipettieren. Zugabe von 1,6 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) (Endkonzentration) und sanftes Mischen mit einer Pipette. Schließen Sie den Deckel und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> 10 μM Adenosintriphosphat (ATP) und 50 mM MgCl 2 (Endkonzentrationen) zugeben. Mit einer Pipette vermischen und die Mischung 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> Fügen Sie gereinigte tRNA (UUU) (Abschnitt 2.3) gemäß Tabelle 1 hinzu , mischen mit einer Pipette und inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Füge phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) bis zu 100 μl Endvolumen hinzu. Mischen Sie richtig und fügen Sie Glycerin zu einer Endkonzentration von 10% v / v hinzu. </li><li> Vortexen Sie die Probe und drehen Sie kurz den Inhalt des Röhrchens (10.000 xg, 1 min, 4 ° C). </li></ol> 4. Gel Loading und Elektrophorese Entwicklung<ol><li> Legen Sie die Elektrophoreseeinheit in eine mit Crushed Ice gefüllte Schale, um die Kammer bei 4 ° C während des Elektrophoreselaufs zu halten. </li><li> Sorgfältig pipettieren Sie 5 μl jeder Probe in die entsprechende Vertiefung. Füge einen geeigneten DNA-Größenmarker hinzu. </li><li> Stecken Sie die Elektroden in die entsprechenden Steckplätze des Netzteils. Schalten Sie das Netzteil ein und stellen Sie die Spannung auf 100 V und führen Sie das Gel für 90 min. </li></ol> 5. Gel-Färbung zur Beobachtung der tRNA-Protein-Wechselwirkung <ol><li> Die Färbelösung durch Mischen von 50 ml TBE mit 1x eines geeigneten DNA-Flecks zubereiten. Vermeiden Sie es, die Färbelösung dem Sonnenlicht auszusetzen, indem Sie den Färbebehälter mit Aluminiumfolie abdecken. HINWEIS: DNA-Flecken werden in der Regel als 10.000 oder 20.000x konzentrierte Bestände gelagert. </li><li> Nach 90 min Elektrophorese entfernen Sie das Gel vorsichtig aus dem Tablett und legen es in einen Behälter mit Färbelösung. Legen Sie es auf eine Wippe bei niedriger Schaukelgeschwindigkeit bei RaumtemperaturUre für 30 min. </li><li> Entfernen Sie das Agarosegel aus dem Färbebehälter, klopfen Sie es sorgfältig auf ein Stück Zellstoffgewebe oder Filterpapier, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und legen Sie es direkt auf einen Transilluminator. Schalte das UV-Licht ein, um Bänder mit tRNA zu visualisieren. Nehmen Sie ein Foto von dem Gel. </li><li> Proteinfärbung (optional). <ol><li> Die DNA-Färbelösung sicher (nach Sicherheitsverfahren) verwerfen und mit 50 ml Coomassie Brilliant Blue (CBB) -Lösung ersetzen. Legen Sie das Tablett auf eine Wippe bei Raumtemperatur und Fleck über Nacht (&gt; 12 h). Die CBB-Färbelösung verwerfen und mit 50 mL PBS ersetzen, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Für 1 h auf einer Wippe entschuldigen. </li></ol></li><li> Visualisierung von Protein enthaltenden tRNA-Komplexen unter einem leichten Transilluminator und fotografieren das Gel, um mit dem tRNA-UV-Gelbild zu vergleichen. </li></ol>

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	<li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+retardation+assay.">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li><li>L&#243;pez-Estepa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+and+small-angle+X-ray+analysis+of+CsdL/TcdA+reveal+a+new+tRNA+binding+motif+in+the+MoeB/E1+superfamily.">The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily.</a> Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).</li><li>Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cyclic+form+of+N6-threonylcarbamoyladenosine+as+a+widely+distributed+tRNA+hypermodification.">A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification.</a> Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).</li><li>Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+protein-protein+interactions+within+the+Cysteine+Sulfinate+Desulfinase+Fe-S+cluster+biogenesis+system.">Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system.</a> J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).</li><li>Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+heteromeric+CsdA-CsdE+cysteine+desulfurase,+assisting+Fe-S+cluster+biogenesis+in+Escherichia+coli.">Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).</li><li>Fried, M. G., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+studies+of+the+cyclic+AMP+receptor+protein-DNA+interaction.">Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction.</a> J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).</li><li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions:+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system.">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assays+for+RNA-protein+complexes.">Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).</li><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift.">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li><li>Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+mobility+shift+assays+to+detect+protein-RNA+interactions.">Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions.</a> Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).</li><li>Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+agarose+gel+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+quantitating+protein:+RNA+interactions.">Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions.</a> Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).</li><li>Hagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-filtration+chromatography.">Gel-filtration chromatography.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der hierin beschriebene Protein-tRNA-Agarose-Gel-Retardierungs-Assay kann auf eine Anzahl von Weisen modifiziert werden. Zuerst kann der Prozentsatz der Agarose im Gel reduziert werden, um die Trennung und Visualisierung von Protein-tRNA-Komplexen signifikant größer zu machen als die hier analysierte (120 kDa). Zweitens, wenn das Zielprotein thermolabile ist, müssen zusätzliche Vorkehrungen getroffen werden, um sicherzustellen, dass die Temperatur unterhalb der maximal akzeptablen Temperatur gehalten wird, indem die...

<html> Der Gel-Retardierungs-Assay 1 (auch bekannt als elektrophoretischer Mobilitätsverschiebungs-Assay, EMSA) ist ein elektrophoretisches Verfahren zur Untersuchung und Charakterisierung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen. Es erlaubt die Analyse von Protein-DNA sowie Protein-RNA-Wechselwirkungen und insbesondere Wechselwirkungen zwischen tRNA und tRNA-bindenden Proteinen unter Verwendung von entweder gereinigten Komponenten oder komplexen Mischungen von Proteinen ( zB Zelllysaten) oder Nukleinsäuren ( zB tRNA Pools). Wir haben Gel-Retardierungs-Assays zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen gereinigter tRNA (UUU) und TcdA, einer N 6- Threonylcarbamoyladenosin (t 6 A) -Dehydratase, die die an A37 in der Anticodon-Stammschleife (ASL) gebundene Threonylcarbamoyl-Seitenkette cyclisiert, Von tRNAs zu cyclischen t 6 (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA ist auch bekannt als CsdL 3 ,F &quot;&gt; 4. Das tcdA / csdL- Gen bildet mit den csdA- und csdE- Genen 5 einen Cluster, der die Cystein-Desulfurase und den Schwefelakzeptor des Cysteinsulfinase-Desulfinats (CSD-Systems) codiert und die TcdA-Funktion in vivo 3 aufrechterhalten muss. Der Grundgedanke der Gel-Retardierungs-Assays besteht darin, dass während der freien Nukleinsäuremoleküle aufgrund ihrer großen negativen Ladung schnell an die Vorderseite von Acrylamid- oder Agarosegelen wandern, wird die elektrophoretische Beweglichkeit von Proteinkomplexen derselben Nukleinsäuren drastisch reduziert. Die Verminderung der Mobilität wird als &quot;Verschiebung&quot; in den Nukleinsäure-Protein-Komplexen visualisiert, die als diskrete Banden aufgelöst werden. Positiv geladene und größere Nukleinsäure-Protein-Komplex zeigen eine größere Verschiebung oder Verminderung der Mobilität auf einem Gel. Da die Ladungsneutralisierung des Komplexes ein universelles Phänomen istFür Protein-Nukleinsäure-Komplexe kann der Gel-Retardierungs-Assay auf eine breite Palette von Komplexen und Nukleinsäure-Typen angewendet werden. Die Methode ist einfach, preiswert und kann in Laboratorien mit minimaler Ausrüstung durchgeführt werden. Es erfordert nur geringe Mengen an Proteinen und tRNA. Dies ist ein Vorteil gegenüber alternativen biophysikalischen Techniken, die in der Regel größere Probenmengen verbrauchen. Der Gel-Retardierungs-Assay wurde weithin für die Untersuchung von Transkriptionsfaktoren verwendet. Der Assay wurde verwendet, um die Bindungskinetik, die Stärke und die Spezifität der Transkriptionsfaktoren für viele verschiedene DNA-Sequenzen zu analysieren. Es war tatsächlich auf diesem Gebiet, dass die EMSA erstmals 6 , 7 entwickelt wurde . Gel-Retardierungs-Assays mit RNA 8 , 9 , 10 , 11 und tRNA-Moleküle wurden auch in der Ribosomenforschung eingesetztUnd zu analysieren, wie wir hier tun, die Enzyme, die tRNA-Nukleoside nachtranskriptional modifizieren. Viele verschiedene Parameter beeinflussen das Ergebnis eines Gel-Retardierungs-Assays wie Temperatur, Qualität der Protein- und tRNA-Probe und die Stärke der Bindung. Eine sorgfältige Planung und Durchführung des Experiments ist entscheidend für die Interpretation der Ergebnisse der freien Nukleinsäure und der Protein-gebundenen Spezies. Hier nutzten wir das für tRNA (UUU) kodierende synthetische Gen, das in einen Expressionsvektor kloniert wurde, dessen Promotor die Shine-Dalgarno-Ribosomenbindungsstelle fehlt, was zur Synthese großer Mengen der tRNA 2 führt . Dieses detaillierte Protokoll soll einen klaren Leitfaden für die Durchführung von tRNA-Gel-Retardierungsexperimenten liefern, während gemeinsame Fehler vermieden werden.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21(DE3)</td><td>Novagen</td><td>70235</td><td>DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction.</td></tr><tr><td>pET23d</td><td>Novagen</td><td>69748-3</td><td>pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter.</td></tr><tr><td>LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated</td><td>Melford</td><td>GL1703</td><td>Conventional LB Broth, High Salt, can also be used.</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10419313</td><td></td></tr><tr><td>Incubator Shaker (Thermostated)</td><td>NBS</td><td>Excella E24&amp;nbsp;</td><td>Any shaker incubator with temperature control can be used.</td></tr><tr><td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), &gt;=99%</td><td>Acros Organics</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate, anhydrous, &gt;99%</td><td>Melford</td><td>B4017</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, &gt;99%</td><td>Acros Organics</td><td>AC327205000</td><td>Harmful if inhaled.</td></tr><tr><td>Centrifuge (refrigerated)</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (refrigerated) rotor</td><td>Eppendorf</td><td>5430/5430P</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>RC5C</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge rotor</td><td>Sorvall</td><td>SLA-3000</td><td></td></tr><tr><td>Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 &amp;plusmn; 0.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive</td></tr><tr><td>Ethanol absolute for analysis, 100% v/v</td><td>Merck Millipore</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, &gt;=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>48,730,250</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 75&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl]</td><td>Melford</td><td>T1513</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Melford</td><td>B0503</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Haier</td><td>HDA-2070M</td><td></td></tr><tr><td>TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td>Corrosive to metals and skin.</td></tr><tr><td>ATP [Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, &gt;=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;), anhydrous, &gt;=98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl), &gt;99%</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl), &gt;99%</td><td>Melford</td><td>P0515</td><td></td></tr><tr><td>NZYDNA Ladder VI</td><td>NZYtech</td><td>MB8901</td><td></td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Consort</td><td>EV261</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis unit</td><td>Real Laboratory</td><td>RELSMINI10</td><td></td></tr><tr><td>Real Safe nucleic acid staining</td><td>Real Laboratory</td><td>RBMSAFE</td><td>20,000X stock</td></tr><tr><td>UV Transilluminator (G:Box/EF)</td><td>Syngene</td><td>2216498</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Rocker (Gyro-Rocker)</td><td>Stuart</td><td>SSL3</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Vortex&amp;nbsp;</td><td>Fisher brand</td><td>13214789</td><td></td></tr></tbody></table>

protein-trna agarose gel retardation assays for the analysis of the n6-threonylcarbamoyladenosine tcda function

Wir zeigen Methoden zur Expression und Reinigung von tRNA (UUU) in Escherichia coli und die Analyse durch Gelretardierungsassays der Bindung von tRNA (UUU) an TcdA, eine N 6 -Dreonylcarbamoyladenosin (t 6 A) Dehydratase, die das Threonylcarbamoyl cyclisiert Seitenkette an A37 in der Anticodon-Stammschleife (ASL) von tRNAs an cyclische t 6 A (ct 6 A) gebunden. Die Transkription des für tRNA (UUU) kodierenden synthetischen Gens wird in E. coli mit 1 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert und die tRNA enthaltenden Zellen werden nach der Induktion von 24 h geerntet. Die RNA-Fraktion wird unter Verwendung des Säurephenol-Extraktionsverfahrens gereinigt. Die reine tRNA wird durch eine Gelfiltrationschromatographie erhalten, die die kleineren tRNA-Moleküle effizient von größeren intakten oder fragmentierten Nukleinsäuren trennt. Um die TcdA-Bindung an tRNA (UUU) zu analysieren, wird TcdA mit tRNA (UUU) gemischt und auf einem nativen Agarosegel bei 4 ° C abgetrennt.Die freie tRNA (UUU) wandert schneller, während die TcdA-tRNA (UUU) -Komplexe einer Mobilitätsverzögerung unterliegen, die bei der Färbung des Gels beobachtet werden kann. Wir zeigen, dass TcdA ein tRNA (UUU) -Bindungsenzym ist. Dieser Gel-Retardierungs-Assay kann verwendet werden, um TcdA-Mutanten und die Wirkungen von Additiven und anderen Proteinen auf die Bindung zu untersuchen.

Große Mengen an tRNA (UUU) können durch Expression des tRNA-Gens in E. coli unter der Kontrolle eines stark induzierbaren T7-Promotors erhalten werden. Die exprimierte tRNA (UUU) akkumuliert im Cytoplasma und ist über den Pool von natürlich reichlich vorhandenen tRNAs angereichert. Ein zweistufiger Reinigungsprozess, der aus einem Einfang / Extraktionsschritt und einem Gelfiltrations- / Polierschritt bestand, wurde verwendet, um eine eTA-Klasse-tRNA zu erhalten. Der Einfang ...

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Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Ein Protokoll wird für die Produktion von tRNA (UUU) und die Analyse von tRNA (UUU) im Komplex mit dem Enzym TcdA durch Agarose-Gel-Retardierungs-Assays vorgestellt.

Protein-tRNA-Agarose-Gel-Retardations-Assays für die Analyse der<em&gt; N.</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosin TcdA-Funktion

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

protein-trna-agarose-gel-retardation-assays-for-analysis-n6

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

9.8K Aufrufe.  Spanish National Research Council (CSIC).  Ein Protokoll wird für die Produktion von tRNA (UUU) und die Analyse von tRNA (UUU) im Komplex mit dem Enzym TcdA durch Agarose-Gel-Retardierungs-Assays vorgestellt. 

Serie: Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

Vorbereitung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Verwendung eines aktivitätsbasierte Sonde für<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Säure Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Forschung

Biochemie

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of the three most common causes of death from parasitic disease. The agent of amebiasis is the amoeba parasite Entamoeba histolytica that exists under two stages: the infective cyst found in food or water and the invasive trophozoite living in the intestine. The clinical manifestations of amebiasis range from being asymptomatic to colitis, dysentery or liver abscesses. E. histolytica is one of the rare unicellular parasite with 5-methylcytosine (5mC) in its genome. 1, 2 It contains a single DNA methyltransferase, Ehmeth, that belongs to the Dnmt2 family. 2 A role for Dnmt2 in the control of repetitive elements has been established in E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 and Drosophila. 6 Our recent work has shown that Ehmeth methylates tRNAAsp, and this finding indicates that this enzyme has a dual DNA/tRNAAsp methyltransferase activity. 7 This observation is in agreement with the dual activity that has been reported for D. discoideum and D. melanogaster. 8 The functional significance of the DNA/tRNA specificity of Dnmt2 enzymes is still unknown. To address this question, a method to determine the tRNA methyltransferase activity of Dnmt2 proteins was established. In this video, we describe a straightforward approach to prepare an adequate tRNA substrate for Dnmt2 and a method to measure its tRNA methyltransferase activity.

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

This protocol describes the preparation of a synthetic tRNA substrate for the Entamoeba histolytica DNA/tRNA methyltransferase 2 (Dnmt2) homolog Ehmeth and the measure of its methyltransferase activity. This experimental approach can be used for investigating the activity of other Dnmt2 proteins.

In-vitro-tRNA Methylierungs-Assay mit der Entamoeba histolytica DNA und tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

Immunologie und Infektion

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase activity. Although TERT is named as a reverse transcriptase, structural and phylogenetic analyses of TERT demonstrate that TERT is a member of right-handed polymerases, and relates to viral RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) as well as viral reverse transcriptase. We firstly identified RdRP activity of human TERT that generates complementary RNA stand to a template non-coding RNA and contributes to RNA silencing in cancer cells. To analyze this non-canonical enzymatic activity, we developed RdRP assay with recombinant TERT in 2009, thereafter established in vitro RdRP assay for endogenous TERT. In this manuscript, we describe the latter method. Briefly, TERT immune complexes are isolated from cells, and incubated with template RNA and rNTPs including radioactive rNTP for RdRP reaction. To eliminate single-stranded RNA, reaction products are treated with RNase I, and the final products are analyzed with polyacrylamide gel electrophoresis. Radiolabeled RdRP products can be detected by autoradiography after overnight exposure.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) synthesizes not only telomeric DNA but also double-stranded RNA through RNA-dependent RNA polymerase activity. Here, we describe a newly established assay to detect RNA-dependent RNA polymerase activity of endogenous TERT.

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Genetik

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these epigenetic marks is accomplished by sequential oxidation by ten-eleven translocation dioxygenases (TET1-3), followed by the thymine-DNA glycosylase-dependent base excision repair. Inactivation of the TET2 gene due to genetic mutations or by other epigenetic mechanisms is associated with a poor prognosis in patients with diverse cancers, especially hematopoietic malignancies. Here, we describe an efficient single step purification of enzymatically active untagged human TET2 dioxygenase using cation exchange chromatography. We further provide a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) approach that can separate and quantify the four normal DNA bases (A, T, G, and C), as well as the four modified cytosine bases (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, and 5-carboxyl). This assay can be used to evaluate the activity of wild type and mutant TET2 dioxygenases.

Here, we present a protocol for an efficient single step purification of the active untagged human ten-eleven translocation-2 (TET2) 5-methylcytosine dioxygenase using ion-exchange chromatography and its assay using a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)-based approach.

Effiziente Reinigung und LC-MS/MS-basierten Assay-Entwicklung für zehn-elf Translokation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Ein In vitro- Test zur Erkennung der tRNA-Isopentenyl-Transferase-Aktivität

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

Antikörperfreier Assay für rna-Methyltransferase-Aktivitätsanalyse

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Enzymatic Assay zur Transcription Hemmung durch Gallium (III) und H messen<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorphenyl) Corrole

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Biotechnik

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapsid Glühen-vermittelte Elektrophorese (NAME) Assay ermöglicht die schnelle Identifizierung von HIV-1-Inhibitoren Nucleocapsid

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

CD-Spektroskopie zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

Protein-tRNA-Agarose-Gel-Retardations-Assays für die Analyse der

Zusammenfassung

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