Es gibt mehr als 100 verschiedene Modifikationen der RNA, von denen zwei Drittel Methylierungen sind. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur sensiblen und genauen Analyse der RNA-Methylierungs-Schreiberaktivität. Diese einfach zu bedienende Technik ermöglicht es uns, methylierte RNA ohne den Einsatz von Antikörpern zu quantifizieren und zu visualisieren, die häufig anfällig für Artefakte sind.
Das Verfahren demonstriert Samantha Shelton, eine Studentin aus meinem Labor. Um dieses Verfahren zu beginnen, richten Sie den 100-Mikroliter-RNA-Methyltransferase-Assay in einer 1,5-Milliliter-Röhre auf Eis ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Wirbeln Sie das Rohr gründlich zu mischen, und Zentrifuge bei 200 mal g für fünf Sekunden, um die Lösung an der Unterseite des Rohres zu sammeln.
Inkubieren Sie die Röhre bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Reinigen Sie dann die Reaktion mithilfe der Spaltenreinigung, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Flüssigkeitsszintillationsanzahl durchzuführen, richten Sie das Szintillations-Zählgestell mit einer Durchstechflasche pro Probe, einer Durchstechflasche für eine Hintergrundmessung und einer Durchstechflasche für den Wischtest ein.
Füllen Sie die Durchstechflaschen mit fünf Milliliterszuptupationszähllösung. Fügen Sie 10 Mikroliter jeder eluierten radioaktiven RNA-Probe in eine Durchstechflasche. Ziehen Sie den Deckel fest und mischen Sie ihn sanft.
Um die Wischtest-Fläschchen vorzubereiten, reiben Sie Baumwollabstriche gründlich auf alle Oberflächen und Geräte, die während des Verfahrens verwendet werden. Fügen Sie diese Tupfer zu den Fläschchen mit Szintillationslösung gefüllt, und ziehen Sie den Deckel. Um die Proben auf dem Szintillationszähler auszuführen, öffnen Sie die Zählerhaube, legen Sie das Rack in die Maschine ein und schließen Sie die Haube.
Wählen Sie Count Single Rack. Wählen Sie Benutzerprogramm auswählen aus. Wählen oder erstellen Sie ein Programm, das Tritium für 60 Sekunden misst, und drücken Sie Count Rack.
Wiederholen Sie die Szintillationsanzahl dreimal. Danach ein Harnstoff-denaturierendes Polyacrylamid-Gel, wie im Textprotokoll beschrieben, vorbereiten und erneut ausführen. Übertragen Sie 20 Mikroliter radioaktives RNA-Material in eine neue 1,5-Milliliter-Röhre mit 20 Mikroliter2X-Gel-Ladepuffer.
Nach der Vorbereitung der Leiter, inkubieren Sie die Proben bei 70 Grad Celsius für 15 Minuten. Waschen Sie die Brunnen des Gels noch einmal unmittelbar vor dem Probenladen durch Pipettierpuffer aus den Geltanks hinunter in die Brunnen des Gels. Dann 20 Mikroliter der vorbereiteten Leiter, 20 Mikroliter der Proben und 20 Mikroliter 1X Gel-Ladepuffer in die Bahnen des Gels laden.
Führen Sie das Gel bei 100 Volt für 60 bis 180 Minuten, abhängig vom Polyacrylamid-Prozentsatz. Sobald das Gel fertig ist, entfernen Sie das Gel aus der Kassette und legen Sie es in eine Box mit 50 Milliliter 1X TBE Puffer mit fünf Mikroliter ultraempfindlichen Nukleinsäure-Gel-Färbung. Inkubieren Sie auf einer Wippe für fünf Minuten, um die RNA zu färben.
Nehmen Sie danach das Gel vorsichtig aus der Box und legen Sie es auf den UV-Transilluminator des Gelbildgebungssystems mit den Brunnen nach oben und der Leiter auf der linken Seite. Fokussieren Sie die Kamera auf das Gel, schalten Sie das UV-Licht ein und nehmen Sie ein Bild des Gels auf. Deaktivieren Sie dann die UV-Bestrahlung, und speichern Sie das Bild als TIFF-Datei.
Legen Sie das Gel wieder in die Box, entfernen Sie den TBE und fixieren Sie das Gel mit 50 Milliliter Befestigungslösung auf einer Wippe bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Als nächstes bewegen Sie das Gel vorsichtig in eine frische Blackbox mit 25 Millilitern der autoradiographischen Verbesserungslösung. 30 Minuten lang auf die Wippe bei Raumtemperatur inkubieren.
Heben Sie das Gel vorsichtig an und legen Sie es mit den Brunnen nach oben und der Leiter auf der rechten Seite nach unten auf eine Plastikfolie. Legen Sie zwei Blätter Chromatographiepapier auf die Rückseite des Gels, und drehen Sie den gesamten Stapel. Den Geltrockner auf 80 Grad Celsius vorheizen.
Bewegen Sie die Kunststoffabdeckung auf dem Geltrockner zurück. Legen Sie den gesamten Stapel unter die Kunststoffabdeckung und bewegen Sie die Kunststoffabdeckung wieder nach unten, um eine Dichtung zu erstellen. Trocknen Sie das Gel bei 80 Grad Celsius für eine Stunde.
Schalten Sie dann den Geltrockner aus, und entfernen Sie den Stapel vorsichtig. Entfernen Sie das Wickel- und zweites Chromatographiepapier. Das restliche Chromatographiepapier mit dem getrockneten Gel in einer Autoradiogrammkassette aufkleben.
Fügen Sie in einem dunklen Raum ein Blatt Autoradiographiefilm hinzu. Bewahren Sie die Kassette bei negativen 80 Grad Celsius auf und entwickeln Sie den Film zur richtigen Zeit, abhängig von der Signalintensität. Sobald der Film entwickelt ist, legen Sie ihn auf die Kassette und verwenden Sie einen Labormarker, um die vier Kanten des Gels, jeden Brunnen, und die Position der XC- und BB-Farbstoffe sorgfältig zu markieren.
Scannen Sie den Film mit einer Auflösung von 300 oder 600 Pixeln pro Zoll, und speichern Sie das Bild als TIFF-Datei. In dieser Studie wird ein antikörperfreier Test zur Analyse der RNA-Methyltransferase-Aktivität gezeigt. Ein typischer Lauf aus einer In-vitro-Transkriptionsreaktion mit der T7-RNA-Polymerase der 7SK-Kleinkern-RNA zeigt relativ kurze und hochstrukturierte RNA.
Es gibt mehrere unerwünschte Bänder, sowohl kürzer als auch länger als 7SK, wahrscheinlich aufgrund zufälliger Transkriptionsinitiierungs- oder Beendigungsereignisse. Aus diesem Grund ist die Gelreinigung nach der In-vitro-Transkriptionsreaktion wichtig, um eine saubere RNA-Probe zu erhalten. An diesem Punkt kann die RNA von Interesse durch ihre Position relativ zur Leiter identifiziert und durch Gelreinigung gereinigt werden.
Hier wird ein repräsentativer RNA-Methyltransferase-Assay mit der unteren Grenze der empfohlenen RNA- und Proteinkonzentrationen gezeigt. Dieser Test ermöglicht sowohl quantitative Ergebnisse aus den Szintillationszahlen als auch qualitative Ergebnisse aus dem Autoradiogramm. Hierbei zeigt sich, dass eine methylatierte RNA-Methyltransferase auch U6 methylieren kann. Darüber hinaus hemmt die Bindung des Histones H4 an MePCE, wie kürzlich für 7SK gezeigt, auch die U6-Methylierung.
Dies kann sowohl in der Szintillationsanzahl als auch im Autoradiogramm beobachtet werden, was die Robustheit dieses Protokolls zeigt. RNA ist anfällig für Degradation, also stellen Sie bitte sicher, RNase-freie Reagenzien zu verwenden und alle Oberflächen und Geräte gründlich zu reinigen. Die radioaktiv markierte RNA, die aus diesem Methyltransferase-Assay gewonnen wird, kann beispielsweise direkt zur Beurteilung der RNA-Demethylase-Aktivität oder der RNA-Bindungsaktivität durch elektrophoretische Mobilitätsverschiebungs-Assay verwendet werden.
Diese Methode ermöglicht es Forschern, die Wirkung verschiedener Faktoren auf die RNA-Methyltransferase-Aktivität zu testen, einschließlich Punktmutationen und Behandlungen mit kleinen Molekülinhibitoren. Bei dieser Methode wird radioaktives Material verwendet, also achten Sie darauf, die entsprechende PSA zu tragen, und seien Sie vorsichtig bei der Handhabung und Entsorgung radioaktiver Stoffe.
