Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Epigenetik und TET2 vermittelt 5-Methylcytosin-Demethylierung Feld eine solche Analyse der Aktivität der normalen und klinischen TET2-Mutationen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass natives TET2 in einem einzigen Schritt gereinigt werden kann, und seine Aktivität kann in Bezug auf die Bildung aller drei Produkte analysiert werden. Mehrere Absolventen werden das Verfahren demonstrieren.
Die Proteinreinigung wird von Chayan Bhattacharya, dem TET2-Assay von Aninda Sundary Dey und der LC-MS/MS-Analyse von Navid Ayon durchgeführt. Für die bakterielle Transformation fügen Sie einen Mikroliter rekombinanten pDEST 14 Zielexpressionsvektor, der nicht markierte menschliche TET2-Dioxygenase enthält, 100 Mikroliter chemisch kompetenter E.coli BL21 DE3-Zellen in einer 1,7-Milliliter-Röhre hinzu. Nach einer Inkubation auf Eis für mindestens 15 Minuten, Hitze schockieren die Mischung bei 42 Grad Celsius für 30 Sekunden in einem Wasserbad.
Unmittelbar nach einem Hitzeschock die Zellen für mindestens zwei Minuten wieder auf Eis legen. Fügen Sie danach 250 Mikroliter superoptimale Brühe mit Katabolitenrepression in die Zellen ein. Inkubieren Sie die Bakterienzellen für eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einem Shaker.
Nach der Inkubation die Zellen durch Zentrifugieren des Rohres bei 9.000-facher Schwerkraft für eine Minute nach unten drehen. 70% des Überstandes durch Pipetten entsorgen und das Pellet in den verbleibenden Medien auflösen. Die Zellsuspension auf einer Lirua-Brühe-Agarplatte mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin verteilen.
Inkubieren Sie die Platte für 16 Stunden bei 37 Grad Celsius. Wählen Sie eine isolierte Kolonie aus und impfen Sie sie in 10 Milliliter LB-Ampicillin-Medien. Inkubieren Sie die Röhre bei 37 Grad Celsius in einem Shaker über Nacht.
Danach verwenden Sie 100 Mikroliter Bakterienkultur, um 100 Milliliter LB-Ampicillinmedien als Primärkultur zu impfen. Inkubieren Sie die Röhre bei 37 Grad Celsius in einem Shaker über Nacht. Am nächsten Tag impfen Sie 15 Kolben, die jeweils 600 Milliliter LB-Ampicillinmedien mit sechs Millilitern Primärkultur pro Kolben enthalten.
Inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius auf einem Shaker bei 180 U/min. Um die Dichte der Bakterienkultur zu überprüfen, messen Sie ihre optische Dichte mit 600 Nanometern oder OD600 mit einem Spektralphotometer. Nachdem die Kultur bei OD600 eine Dichte von 0,8 erreicht hat, induzieren Sie die Expression von TET2-Protein mit 300 Mikrolitern eines Molaren IPTG in jedem Kolben und wachsen Sie die Kultur für weitere 16 Stunden bei 17 Grad Celsius.
Nach der Inkubation die Bakterienkultur auf Zentrifugenflaschen übertragen. Zentrifuge die Bakterienkultur, die das TET2-Enzym bei 5, 250-facher Schwerkraft für 45 Minuten ausdrückt. Verwenden Sie das bakterielle Pellet für die TET2-Reinigung.
Arbeiten Auf Eis oder bei vier Grad Celsius, setzen Sie das bakterielle Pellet in 100 Milliliter 50-Millimolar MES Puffer, pH sechs. Nehmen Sie dann fünf Milliliter der Zellsuspension und bringen Sie sie mit dem Puffer auf 45 Milliliter. Sonicate die Federung für fünf mal 30 Sekunden bei Leistung 20, mit 60-Sekunden-Kühlintervallen.
Drehen Sie das Lysat bei 5, 250-fache Schwerkraft für 45 Minuten. Sammeln Sie den Überstand, der das lösliche TET2-Enzym enthält, und leiten Sie ihn durch 0,45 Mikron-Filter, bevor Sie auf ein FPLC-System geladen werden. Packen Sie 30 Milliliter eines starken Kationenaustauschharzes in eine FPLC-Säule.
Mit einem FPLC-System die Säule mit 10 Bettvolumen Waschpuffer bei konstanter Durchflussrate von 0,3 Millilitern pro Minute ausdemieren. Das geklärte Lysat auf die vorausgeglichene Säule legen und mit ca. 10 Bettvolumen Waschpuffer waschen, bis der Durchfluss klar wird. Elute TET2 mit einem 0 bis 10%gradienten vom Waschpuffer zum Elutionspuffer in 15 Bettvolumen, gefolgt von einem Haltepunkt bei 10%Elutionspuffer für zwei Bettvolumina.
Sammeln Sie 100 Mikroliter Proben von Zelllysat vor und nach dem Laden der Spalte, zusammen mit allen Elutionsfraktionen, und analysieren Sie auf 10%auflösendes SDS-PAGE-Gel. Die Fraktionen, die TET2-Protein enthalten, zu bündeln und das Protein gefrieren. Dann lösen Sie das Enzym in 10 Milliliter Wasser auf und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius.
Führen Sie alle Demethylierungsreaktionen in Dreifachlizierung mit drei Mikrogramm Substrat durch. Fügen Sie 100 Mikrogramm gereinigtes TET2-Enzym zu 50 Mikrolitern des gesamten Reaktionspuffers hinzu. Nach einer Stunde Inkubation bei 37 Grad, löschen Sie die TET2 katalysierte Oxidationsreaktionen mit fünf Mikroliter 500-Millimolar EDTA.
Um Proben für die Analyse vorzubereiten, trennen Sie die DNA von der TET2-Reaktionsmischung, indem Sie zunächst 100 Mikroliter Oligo-Bindungspuffer zu 55 Mikroliter nadierter Reaktion hinzufügen. Danach 400 Mikroliter 100% Ethanol in das Gemisch geben. Diese Mischung durch eine Oligo-Bindungsspalte passieren.
Nach dem Waschen der gebundenen DNA mit 750 Mikroliter Waschpuffer, elute die DNA in 20 Mikroliter Wasser. Verdauen Sie nun die isolierte DNA mit zwei Einheiten DNase I und 60 Einheiten S1-Nuklease bei 37 Grad Celsius für 12 Stunden, um einzelne Nukleosidmonophosphate zu produzieren. Nach der Verdauung zwei Einheiten kalbendarmer alkalischer Phosphatase in die Proben geben.
Inkubieren Sie für eine Zugabe 12 Stunden bei 37 Grad Celsius, um die terminalen Phosphatgruppen aus den Nukleosidmonophosphaten zu entfernen und die Nukleoside zu erhalten. Bereiten Sie eine 100-Mikromolar-Stammlösung aller modifizierten Cytosin-Nukleoside und der normalen DNA-Basen in HPLC-Wasser für die Entwicklung der LC-MS/MS-Methode vor. Optimieren Sie die nukleosidabhängigen MS/MS-Parameter, indem Sie Im erweiterten MS-Scanmodus Nachspiellösungen nacheinander in das Massenspektrometer mit einer Durchflussrate von 10 Mikrolitern pro Minute einfließen lassen.
Mehrere Parameter können mit der automatisierten quantitativen Optimierungsfunktion der Software für jedes DNA-Nukleosid optimiert werden. Optimieren Sie an dieser Stelle die verbleibenden Parameter für jedes DNA-Nukleosid mit der manuellen quantitativen Optimierungsfunktion der Software im Strömungsinjektionsanalysemodus. Optimieren Sie nun quellenabhängige MS/MS-Parameter, indem Sie 10 Mikroliter Der Stammlösung mit einem Gradienten mit 25 % Lösungsmittel B bei einer Durchflussrate von 0,3 Milliliter pro Minute injizieren.
Um alle acht DNA-Nukleoside zu trennen, führen Sie eine Flüssigchromatographie durch, wie im Textprotokoll auf einer C18-Säule beschrieben. Schließlich können Sie alle Nukleoside mit der LC-MS/MS-Methode in Standardkurven erkennen und quantifizieren. Da die katalytische Domäne von TET2 im Vergleich zu den meisten einheimischen E.coli-Proteinen einen relativ hohen isoelektrischen Punkt aufweist, wurde ein effizienter Reinigungsprozess unter Verwendung einer Kationenaustauschchromatographie entwickelt.
Diese Reinigung ergab mehr als 90% reines TET2-Enzym in einem einzigen Schritt. Um verschiedene Desoxycytidinderivate und die vier natürlichen DNA-Basen nach der tet2-enzymatischen Reaktion zu trennen und zu quantifizieren, wurde ein empfindlicher LC-MS/MS-basierter Assay optimiert. Standardkurven wurden mit seriellen Verdünnungen eines Gemischs gezeichnet, das alle Nukleoside enthält.
Die Ergebnisse der Flüssigchromatographie MS/MS-Methode werden hier gezeigt. Das Verfahren ermöglicht die Trennung und Quantifizierung der vier normalen DNA-Basen sowie der vier modifizierten Cytosinbasen. In diesem experimentellen Verfahren beschreiben wir das Klonen von nicht markierten menschlichen TET2-Dioxynase-Katalytisch-Domänen mit standortspezifischer Rekombinationstechnik und einer ausreichenden Expression in einem Zielvektor in E.Coli.
Wir reinigten effizient unmarkiertes TET2-Enzym unter Verwendung der Kationenaustauschchromatographie, um in einem einzigen Schritt eine Reinheit von mehr als 90 % zu erzielen. Darüber hinaus haben wir eine neuartige Flüssigchromatographie-Methode entwickelt, um die vier normalen DNA-Basen und die vier modifizierten Cytosinbasen zu trennen. Um die acht Nukleoside aus TET2-Katalysereaktionen zu quantifizieren, haben wir unsere verbesserte Flüssigchromatographie-Methode mit der Tandem-Massenspektrometrie gekoppelt.
Der empfindliche LC-MS/MS-Assay wurde dann verwendet, um die Aktivität des rekombinanten nicht markierten menschlichen TET2-Enzyms zu bestimmen. Der hier beschriebene Ansatz wird die Bewertung von Wildtyp und mutierter TET2-Dioxygenase erheblich verbessern.
