Die Studie wurde unterstützt durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie (Projekt am meisten 105-2221-E-400-001) und den National Health Research Institutes (Projekt BN-105-PP-10), Taiwan.

der institutionellen Animal Care und Use Committee des National Health Research Institutes in Taiwan genehmigt alle tierischen Protokolle.
 1. Induktion von diabetischen Modell in männlichen Erwachsenen Sprague - Dawley (SD) Ratten <ol><li>Ratte essen Pellets aus dem Käfig entfernen, um schnell männlichen SD-Ratten (300-350 g) für 6 h vor der STZ Induktion.</li>
	<li>Vorbereiten Natriumcitrat Puffer (0,1 M, pH 4,5).
	<ol><li>Auflösen 1,05 g Zitronensäure Monohydrat (C 6 H 8 O 7 · H 2 O; Mol WT 210.14) in 50 mL destilliertem Wasser um eine 0.1 M Zitronensäure-Lösung machen.</li>
		<li>Auflösen 1,47 g Trinatrium Citrat Dihydrat (C 8 H 5 O 7 Na 3 · 2 H 2 O; Mol WT 294.12) in 50 mL destilliertem Wasser um eine 0,1 M Natriumcitrat Lösung machen.</li>
		<li>Fügen Sie 25 mL Zitronensäurelösung 25 mL Natriumcitrat Lösung. Überwachen den Natrium-Citrat Puffer pH-Wert (pH 4,5) mit dem pH-Meter. 
		Hinweis: Der Puffer erfolgt isotonische durch Zugabe einer entsprechenden Menge von Natriumcitrat Lösung 0,1 M.</li>
	</ol></li> <li>Auflösen STZ in 0,1 M Natriumcitrat Puffer um 50 mg/mL STZ Lösung erzielen. 
	Hinweis: Die STZ-Lösung ist lichtempfindlich, daher die STZ-Lösung mit Alu-Folie abdecken und innerhalb von 15-20 min.</li>
	<li>Ziehen die 50 mg/kg STZ-Lösung in eine 1 mL Insulin oder Tuberkulin-Spritze mit 26 - 28-Gauge Nadel reinigen der Injektionsstelle mit einem Ethanol-Pad und intraperitoneale injizieren die STZ-Lösung in der unteren rechten Quadranten des Abdomens zur Vermeidung von Schäden Bauchorgane. </li> <li>Liefern Ratten mit 10 % Saccharose-Wasser als die einzige Wasserquelle für 48 h nach der Injektion der STZ Hypoglykämie zu verhindern.</li></ol>
 2. Bestätigung der Diabetes bei STZ-induzierte Ratten <ol><li>Monitor Fasten Plasma Glukosekonzentration aller Ratten injiziert durch STZ post 72 h mit einem Blutzuckermessgerät.
	<ol><li>Schnell die STZ-induzierte diabetischen Ratten für 15 h vor der Messung das Fasten Blut Glukoseniveau.</li>
		<li>Die Ratten in einem Beutel Zurückhaltung zügeln und setzen die Schwänzen zur Blutentnahme während der Blut-Glukose-Messungen.</li>
		<li>Verwenden eine Blutlanzetten, stechen die Schwanzspitze, einen kleinen Tropfen Blut zu erhalten. Legen Sie den Blutstropfen auf einen Blutzucker-Teststreifen. Aufzeichnen der Fastende Plasma Glukoseniveaus. 
		Hinweis: Das Blutzuckermessgerät erkennt und zeigt den Blutzuckerspiegel in Einheiten von mg/dL. Die Ratten mit Fasten Blutzuckerspiegel unter 150 mg/dL nach 2 Wochen der STZ-Induktion auszuschließen.</li>
	</ol></li></ol> 3. Bewertung der diabetischen Neuropathie bei diabetischen Ratten <ol><li>Beurteilung der mechanischen Allodynie mit elektronischen von Frey.
	<ol><li>Gewöhnen die STZ-induzierte diabetische Ratten in einem Käfig auf einem 1 cm Durchmesser Metallgewebe Boden für 30 min vor der Bewertung der Hind Pfote Rückzug Antwort.</li>
		<li>Verwenden eine elektronische von Frey-Sonde mit starrer Spitze (0,8 mm Durchmesser) für manuell Druck auf die plantar Oberfläche der Hinterpfote der Ratten, und allmählich den Druck erhöhen, bis eine Pfote Rückzug Reaktion gesehen wird.</li>
		<li>Den Druck, der auf dem System und wiederholen Sie die Messung 5 Mal pro Ratte mit einer 30 s-Intervall zwischen den einzelnen Messungen aufzeichnen.</li>
	</ol></li> <li>Die Hitze-Hyperalgesie mit einer Heizplatte zu beurteilen.
	<ol><li>Gewöhnen die STZ-induzierte diabetischen Ratten auf der Heizplatte (24 ± 0,5 ° C) für 10 min vor der Bewertung der Schmerzen Antwort.</li>
		<li>Entfernen und setzen Sie die Ratten wieder in ihren Käfigen nach Gewöhnung, die Kochplatte erhitzen und pflegen die Heizplatte &#39; s Temperatur bei 55 ± 0,5 ° C.</li>
		<li>Legen Sie die Ratte auf der beheizten Herdplatte während gleichzeitig Timer starten.</li>
		<li>Wenn die Ratte unterschiedliche Verhaltensweisen zeigt, wie lecken der hinteren Pfote oder ungewöhnlich flimmernden Hirschkuh Pfote, stoppen Sie die Zeitmessung und Rückzug Latenz aufnehmen. 
		Hinweis: Wenn eine Ratte nicht unterschiedliche Verhaltensweisen nach 20 ausdrückt s (20 s-Cut-off-Zeit), den heißen Platte Test beenden und entfernen Sie die Ratte aus der heißen Platte.</li>
	</ol></li></ol> 4. In Vivo Nerve Conduction Blockade mit der HIFU-Wandler Hinweis: die in-Vivo-Experiment startet am 5. Woche nach 50 mg/kg STZ Injektion.
<ol><li>Perform Tier Verfahren vor der Blockade von CMAPs mit HIFU-Beschallung.
	<ol><li>Die chirurgischen Werkzeuge (Skalpell, Schere, Pinzette und Glas Haken) im Autoklav vor der Operation sterilisieren.</li>
		<li>Betäuben die Ratten mit intraperitonealer Injektion von Tiletamin/Zolazepam Gemisch (40 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) oder über Inhalation von 1,75 % Isofluran über Isofluran Vaporizer. Legen Sie die Ratten auf ein Heizkissen auf die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.</li>
		<li>Positionieren Sie die Ratten für Chirurgie im ventralen liegen. Anwendung der Augensalbe. Erweitern Sie das Bein der Ratte und Kneifen der plantaren Oberfläche des Fußes mit den Fingernägeln zu prüfen, die Tiefe der Narkose. Wenn die Ratten Rückzug Antworten zeigen, gelten zusätzliche Anästhesie.</li>
		<li>Entfernen Haare aus dem Oberschenkel und hinten die Ratten mit einer elektrischen Haarschneidemaschine zu senken. Wenden Sie flüssiges Jod mit sauberen Gaze an der Operationsstelle und kreisförmig bewegen Sie die Gaze, die außen an der Operationsstelle. Verwenden Sie eine Alkohol-Pad auf um der flüssigen Jod mit der gleichen Kreisbewegung zu wischen. Dieses Experiment ist auf der Website Links und rechts OP durchgeführt. Wiederholen Sie den Vorgang auf der anderen Operationsstelle beim Durchführen des nächste Schrittdes des Verfahrens.</li>
		<li>Verwenden eine sterile chirurgische Schere oder Skalpell einen Einschnitt der Haut am dorsalen Oberschenkel zu machen. Verwenden Sie stumpfe chirurgische Schere sorgfältig trennen das Gewebe unter der Haut und schützen die Haut mit Haut Haken. Femur innerhalb der Muskeln sichtbar werden.</li>
		<li>Verwenden Sie die Schere, um die Muskeln, die parallel zum Femur sorgfältig zu trennen, bis die Mitte des Oberschenkels Ischias-Nervenfasern, die in den Muskeln eingebettet sind sichtbar sind. Sorgfältig einen Glas Haken verwenden, um die Mitte des Oberschenkels Ischiasnerv aus dem umliegenden Bindegewebe und Muskulatur trennen.</li>
	</ol></li> <li>Positionieren Sie den Ischiasnerv in der fokalen HIFU-Zone mit einer maßgeschneiderten Nerv Fixateur ( Abbildung 1 und Abbildung 3). 
	Hinweis: Die maßgeschneiderte Nerv Fixateur besteht aus 3 Komponenten ( Abbildung 3). Alle Komponenten bestehen aus durchsichtigen Polymethylmethacrylat (PMMA). Das Außengewinde der oberen Struktur der Komponente I ist 2,5 mm groß und M10XP0.7 ( Abb. 4A). Der zentrale Brunnen ist ein Durchmesser von 4,0 mm Loch durch Komponente ich. Die untere Öffnung des Brunnens wird durch ein Blatt von Klebeband abgedichtet. Der Durchmesser des Schlitzes ist 1,2 mm und der Abstand zwischen der Zentralebene des Schlitzes und die obere Fläche der Komponente I ist 3,1 mm. Komponente II besteht aus einem Grundkörper, vier Beine und die Bodenstruktur ( Abbildung 4 b). Das Innengewinde der Bodenstruktur ist 2,5 mm groß und M10XP0.7 auf das Außengewinde der Komponente passen ich. Der Durchmesser der zentralen Bohrung ist identisch mit dem zentralen Brunnen Komponente ich. Die Abmessungen des Hauptteils sind 32 mm Durchmesser und 5.4 mm Dicke. Vier Beine sind symmetrisch bereitgestellt. Zwei identische kurze Beine sind für Ausrichtung und zwei gleich lange Beine arbeiten zum Einhängen auf Komponente III. Der Außendurchmesser und die Höhe der Komponente III sind 41 bis 9,2 mm. Das Innengewinde ist M36XP1.0 und die Durchgangsbohrung ist 27,5 mm Durchmesser (< starke Klasse = "Xfig"> Abbildung 4). Der Kegel ist eine hohle Kegel mit der oberen Öffnung von 84 mm Durchmesser und die untere Öffnung von 27,5 mm Durchmesser. Die Höhe beträgt 57,5 mm ( Abb. 5A).
	<ol><li>Vor dem Experiment, maßgefertigte Acryl Nerv Fixateur in Bleichmittel-Lösung für 30-60 min, gefolgt von einweichen in sterilem Wasser einweichen.</li>
		<li>Mit einem Glas Haken heben Sie vorsichtig den Nerv und steckte sie in den Schlitz der Komponente I.</li>
		<li>Schraubenkomponente II an Komponente I. füllen die zentrale Komponente gut ich mit Ringer &#39; s Lösung für Ultraschall Ausbreitung und Nerven Erhalt.</li>
		<li>Schraube Komponente III, der HIFU-Gehäuse-Kegel. Dock-Komponente III mit Bauteil II durch die vier Beine des Bauteil II. 
		Hinweis: Der geometrischen Mitte der drei Komponenten und der Wandler ausgerichtet sind. Der Abstand zwischen den Nerv und der Wandler ist die Brennweite, sorgt der Nerv im Inneren der HIFU Fokuszone.</li>
	</ol></li> <li>Fügen Sie ein paar von Akupunkturnadeln in die Entstehung der Ischiasnerv und das andere Paar in den Gastrocnemius Muskel. Schließen Sie jedes Paar von Nadeln an das Erfassungssystem Elektrophysiologie durch einen elektrischen Koaxialkabel ( Abbildung 1). 
	Hinweis: An einem Ende des Kabels sind zwei Krokodilklemmen, zwei Nadeln separat und am anderen Ende des Kabels clip ist ein BNC-Stecker, das System zu verknüpfen. Die Paare von Akupunkturnadeln Arbeit als anregende Elektroden an den Ischiasnerv und die Aufnahme Elektroden an den Gastrocnemius Muskel.
	<ol><li>Die Sampling-Rate und die Bandbreite der Elektrophysiologie-Erfassungssystem auf 50 kHz und 70 Hz - 3 kHz, "bzw." festgelegt. Anwenden einer supra-maximale Impulse mit einer Pulsbreite von 0,1 ms zu den stimulierenden Elektroden am Ursprung des Nervus ischiadicus.</li>
		<li>Die CMAPs von den Aufnahme-Elektroden aufnehmen und verstärken die CMAPs mit eingebautem Verstärker in der Elektrophysiologie Erfassungssystem. 
		Hinweis: Verwenden den eingebauten Verstärker in der Elektrophysiologie-Erfassungssystem CMAPs von den Aufnahme-Elektroden mit Elektrophysiologie-Erfassungssystem zu verstärken die Nervensignale.</li>
	</ol></li> <li>Einen kommerziellen 2,68 MHz-HIFU-Wandler verwenden, um die CMAPs bei diabetischen neuropathischen Ratten unterdrücken. 
	Hinweis: Die Spezifikationen des Wandlers werden wie folgt beschrieben: ein Single-Element kugelförmigen Schale mit Öffnungsdurchmesser von 6 cm und 5 cm Brennweite und ein Ellipsoid Fokuszone von 4 mm in der Tiefe und 0,8 mm in der Breite in das freie Feld.
	<ol><li>Untertauchen der sphärischen Kegel, der HIFU-Wandler und den Kegel in den Tank zu decken mit entgastem Wasser gefüllt. Die HIFU-Wandler in den kugelförmigen Konus und befestigen Sie die Kegel-Abdeckung, um die obere Öffnung des Kegels sphärische durch 6 Schrauben ( Abbildung 5 b). Nach Luftblasen in den kugelförmigen Kegel natürlich aufgrund der niedrigen Dichte Blasen im Vergleich mit Wasser vertrieben werden, verschließen Sie die Front-End-Öffnung des Kegels mit einem transparenten 0,03 mm dicken Band. Schraubenkomponente III auf den kugelförmigen Kegel.</li>
		<li>Herausnehmen der HIFU-Wandler mit den sphärischen Kegel und Komponente III aus dem entgastem Wassertank. 
		Hinweis: In der Studie verwendeten Umkehr-Osmose-Wasser ist das Wasser durch den Prozess der Umkehrosmose gereinigt. Die Umkehr-Osmose-Wasser wird gekocht, um das Gas zu vertreiben. Nach dem Abkühlen entgastem Wasser erhält man in einem einzelnen geschlossenen Tank.</li>
	</ol></li> <li>Komponente legte ich in den Raum zwischen den Nerv und Muskel sorgfältig, und positionieren Sie die Nerven in den Spalt der Komponente I. durchführen Schritte 4.2.3 und 4.2.4 um sicherzustellen, dass der Nerv im Inneren der Fokuszone die HIFU ist ( Abbildung 3A < / starke >).</li>
	<li>Link einen Funktionsgenerator und ein Radiofrequenz-Endstufe. Verbinden Sie die Endstufe mit der HIFU-Wandler für die Generation der HIFU-Strahl. Manuell einstellen der Ausgangsspannung der Funktionsgenerator, der HIFU-Wandler über die Endstufe. Manuell schalten Sie der Funktionsgenerator, sobald die HIFU-Belichtung Zeit abgelaufen ist. Zeit mit Hilfe eines Timers beobachten. 
	Hinweis: Die Intensität und die Energie der HIFU-Strahl in dieser Studie verwendeten sind 2.810 W/cm 2 84 J/mm 2, bzw..</li>
	<li>Liefern gleichzeitig den Reiz über die Elektrophysiologie-Erfassungssystem (Schritt 4.3) und HIFU Strahl über HIFU-System (Schritt 4.6) an den Ischiasnerv während der Aufnahme die CMAPs. Schrittweise Erhöhung die HIFU-Exposition auf den Ischiasnerv von 3 s, 5 s bis 8 s bis Abnahme oder Hemmung der Amplitude des CMAPs beobachtet wird.
	<ol><li>Rekord CMAPs einmal pro Sekunde während der Entbindung von der HIFU-Strahl. Nach der Feststellung der Änderung der Amplitude der CMAPs, die HIFU-Anlage abschalten und manuell klicken Sie auf das Aufnahmesymbol auf die Elektrophysiologie Datenerfassungs-Software zum Datensatz CMAPs alle 2 min in den frühen 10 min alle 5 min in den aufeinander folgenden 30 min und alle 10 min in der letzten phase bis die Aufnahmedauer 2 h. erreicht</li>
	</ol></li> <li>Separate Komponente II und III des Nervs Fixateur ( Abbildung 3), die HIFU-Wandler von der Einschnitt-Website zu entfernen. Separate Komponente II und ich den gesicherten Ischiasnerv freizugeben. Naht der Operationsstelle diabetischen Ratten durch 4-0 Chromsäure Catgut Nähte nach der Aufnahme die CMAPs. Gelten Sie flüssiges Jod an der Operationsstelle um Infektionen zu vermeiden.
	<ol><li>Die Käfige auf das Heizkissen und die Ratten in ihren Käfigen zu erholen, vor der Rückgabe an die Tierstation. Die Ratten mit Ibuprofen im Trinkwasser für 3 Tage oder intraperitoneale Injektion von Buprenorphin (0,05 - 0,1 mg/kg) zur Verfügung zu stellen.</li>
	</ol></li> <li>Fügen Sie anregende und Aufnahme Elektroden in das Herkunftsland der Ischiasnerv und die Gastrocnemius Muskeln der narkotisierten diabetischen neuropathischen Ratten, wie in den Schritten 4.1.2 und 4.3 auf 7, 14 und 28 Tagen nach der ersten HIFU-Ultraschall beschrieben. Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1, 4.3.2.
	<ol><li>Die Käfige auf das Heizkissen und ermöglichen die Ratten in ihren Käfigen zu erholen, bevor die Käfige mit der Tierstation.</li>
	</ol></li> <li>Einschläfern die Ratten nach dem Experiment. Legen Sie die Ratte in eine Kohlendioxid-Kammer. Warten Sie ca. 5 min. für die Ratten zu atmen aufhören. Stellen Sie sicher, dass das Herz aufgehört hat zu schlagen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Abuaisha, B. B., Costanzi, J. B., Boulton, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acupuncture+for+the+treatment+of+chronic+painful+peripheral+diabetic+neuropathy:+A+long-term+study.">Acupuncture for the treatment of chronic painful peripheral diabetic neuropathy: A long-term study.</a> Diabetes Res Clin Pract. 39 (2), 115-121 (1998).</li><li>Hamza, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percutaneous+electrical+nerve+stimulation:+A+novel+analgesic+therapy+for+diabetic+neuropathic+pain.">Percutaneous electrical nerve stimulation: A novel analgesic therapy for diabetic neuropathic pain.</a> Diabetes Care. 23 (3), 365-370 (2000).</li><li>Ballantine, H. T., Bell, E., Manlapaz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+problems+in+the+neurologic+applications+of+focused+ultrasound.">Progress and problems in the neurologic applications of focused ultrasound.</a> J Neurosurg. 17, 858-876 (1960).</li><li>Foley, J. L., Little, J. W., Vaezy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided+high-intensity+focused+ultrasound+for+conduction+block+of+peripheral+nerves.">Image-guided high-intensity focused ultrasound for conduction block of peripheral nerves.</a> Ann Biomed Eng. 35 (1), 109-119 (2007).</li><li>Lee, Y. F., Lin, C. C., Cheng, J. S., Chen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-intensity+focused+ultrasound+attenuates+neural+responses+of+sciatic+nerves+isolated+from+normal+or+neuropathic+rats.">High-intensity focused ultrasound attenuates neural responses of sciatic nerves isolated from normal or neuropathic rats.</a> Ultrasound Med Biol. 41 (1), 132-142 (2015).</li><li>Young, R. R., Henneman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+block+of+nerve+conduction+by+ultrasound.">Reversible block of nerve conduction by ultrasound.</a> Arch Neurol. 4, 83-89 (1961).</li><li>Lele, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+focused+ultrasonic+radiation+on+peripheral+nerve,+with+observations+on+local+heating.">Effects of focused ultrasonic radiation on peripheral nerve, with observations on local heating.</a> Exp Neurol. 8 (1), 47-83 (1963).</li><li>Hong, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+nerve+conduction+block+in+patients+with+poly-+neuropathy+after+ultrasound+thermotherapy+at+therapeutic+dosage.">Reversible nerve conduction block in patients with poly- neuropathy after ultrasound thermotherapy at therapeutic dosage.</a> Arch Phys Med Rehabil. 72 (2), 132-137 (1991).</li><li>Okada, A., Morita, Y., Fukunishi, H., Takeichi, K., Murakami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+magnetic+resonance-guided+focused+ultrasound+treatment+of+uterine+fibroids+in+a+large+Japanese+population:+impact+of+the+learning+curve+on+patient+outcome.">Non-invasive magnetic resonance-guided focused ultrasound treatment of uterine fibroids in a large Japanese population: impact of the learning curve on patient outcome.</a> Ultrasound Obstet Gynecol. 34 (5), 579-583 (2009).</li><li>Huisman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+consensus+on+use+of+focused+ultrasound+for+painful+bone+metastases:+current+status+and+future+directions.">International consensus on use of focused ultrasound for painful bone metastases: current status and future directions.</a> Int J Hyperthermia. 31 (3), 251-259 (2015).</li><li>Dickinson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-term+Outcomes+after+Whole-gland+High-intensity+Focused+Ultrasound+for+the+Treatment+of+Nonmetastatic+Prostate+Cancer+from+a+Multicentre+Registry+Cohort.">Medium-term Outcomes after Whole-gland High-intensity Focused Ultrasound for the Treatment of Nonmetastatic Prostate Cancer from a Multicentre Registry Cohort.</a> Eur Urol. 70 (4), 668-674 (2016).</li><li>Foley, J. L., Little, J. W., Vaezy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+high-intensity+focused+ultrasound+on+nerve+conduction.">Effects of high-intensity focused ultrasound on nerve conduction.</a> Muscle Nerve. 37 (2), 241-250 (2008).</li><li>Lee, Y. F., Lin, C. C., Cheng, J. S., Chen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+conduction+block+in+diabetic+rats+using+high-intensity+focused+ultrasound+for+analgesic+applications.">Nerve conduction block in diabetic rats using high-intensity focused ultrasound for analgesic applications.</a> Br J Anaesth. 114 (5), 840-846 (2015).</li><li>Donoff, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+regeneration:+basic+and+applied+aspects.">Nerve regeneration: basic and applied aspects.</a> Crit Rev Oral Biol Med. 6 (1), 18-24 (1995).</li><li>Fawcett, J. W., Keynes, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+regeneration.">Peripheral nerve regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).</li><li>Nightingale, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropathic+pain+market.">The neuropathic pain market.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 101-102 (2012).</li><li>Lipton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-pulse+transcranial+magnetic+stimulation+for+acute+treatment+of+migraine+with+aura:+a+randomised,+double-blind,+parallel-group,+sham-controlled+trial.">Single-pulse transcranial magnetic stimulation for acute treatment of migraine with aura: a randomised, double-blind, parallel-group, sham-controlled trial.</a> Lancet Neurol. 9 (4), 373-380 (2010).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Teil- und vorübergehenden Unterdrückung von Action potentials der neuropathischen Nerven von diabetischen Ratten in Vivo und sofortige auftreten die Sperrwirkung nach der HIFU-Behandlung, die beide beobachtet wurden. Die 28-Tage-Follow-up-Studie auf CMAPs gezeigt, dass eine sichere Blockade der Nervenleitung am eine angemessene HIFU-Belichtung durchgeführt werden kann. Infolgedessen bieten das obige Protokoll der HIFU-Behandlung eine alternative Lösung für die reversible Wärmeleitung Block des Ischias-Nerv...

Orale Medikamente, Akupunktur1und elektrische Nerven Stimulation2 für die Behandlung der schmerzhaften diabetischen Polyneuropathie verwendet worden. Allerdings behindern die Nebenwirkungen der oralen Medikamenten, invasive Betrieb von Akupunktur und elektrische Nervenstimulation die therapeutische Wirksamkeit und Einhaltung des Patienten. Ultraschall-Block der peripheren Nerven in Tiermodellen untersucht worden ist, für Jahrzehnte3,4,5. Die Durchführung von in-vitro- Ischias Nerven von der großen grünen Frosch war reversibel gehemmt, nach der Behandlung von 10-20 Impulse von Ultraschall Belichtung für 0,4 - 1,0 s6. Ein Faktor, Nervenleitung zu blockieren ist die Temperaturerhöhung induziert durch Ultraschall-7. Für Patienten mit Polyneuropathie erklang die Unterdrückung der zusammengesetzten Muskel Aktionspotentiale (CMAPs) in der peroneus geringer Intensität Ultraschall für 2 min8ausgesetzt. Die vollständige Genesung war innerhalb von 5 Minuten.
Vor kurzem der Food and Drug Administration der USA HIFU als eine nicht-invasive Behandlung für uterine faserartige Tumoren9, Palliations Schmerzen der Knochen Metastasen10und Prostatakrebs11genehmigt. Eine HIFU-Wandler stößt akustische Balken außerhalb des Körpers und der Balken in verschiedenen Gewebe Medien übertragen und konvergieren auf den Ziel-Tumor im Mittelpunkt. Der Fokuszone ist sofort gebildet, um lokalisierte Auswirkungen auf Ziel Tumoren zu erzeugen, ohne das umliegende Gewebe zu beschädigen. HIFU wurde auch angewendet, um Nervenleitgeschwindigkeit hemmen oder Nerv Denervation in in Vivo Experimente von normalen Sprague-Dawley (SD) Ratten12verursachen. Darüber hinaus wurden die kurz- und langfristigen Auswirkungen der HIFU auf neuropathischen Nerven untersuchten13. Bisherige Ergebnisse gezeigt, dass die reversible oder dauerhafte Block von sensorischen Nervenleitgeschwindigkeit durch HIFU mit geeigneten Parametern erreicht werden könnte. Neben schmerzstillende Anwendungen könnte HIFU als Werkzeug verwendet werden, um den relativen Beitrag des peripheren und zentralen Komponenten Nerv Wärmeleitung Blockade für Grundlagenforschung der Neurologie und Entwicklung von Schmerzmitteln zu untersuchen. Daher ist eine HIFU blockierende Technologie-Plattform speziell für periphere Nerven in Tiermodellen erforderlich. Der Zweck dieses Artikels ist, die Verfahren für die ganz oder teilweise Sperrung der Aktionspotentiale der peripheren Nerven bei diabetischen neuropathischen Ratten durch HIFU demonstrieren. Diabetischen Ratten Modelle und Beurteilung der peripheren neuropathischen Symptome wurden eingerichtet. Eine HIFU-Plattform und experimentelle Prozesse spezifisch für die Behandlung von Ratte Ischias Nerven werden vorgestellt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="965">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">streptozotocin</td>
			<td style="width:315px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">85882</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">citric acid monohydrate&#160;</td>
			<td style="width:315px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trisodium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:315px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glucose meters</td>
			<td>Roche Accu-Check Active</td>
			<td>GC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">electronic von Frey device</td>
			<td>IITC Life Science</td>
			<td>2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hot plate</td>
			<td>IITC Life Science</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biopac MP36 acquisition system</td>
			<td>Biopac Systems, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HIFU transducer</td>
			<td>Sonic Concepts</td>
			<td>H108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">function generator</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>33250A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">power amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation</td>
			<td>1040L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Rats&#160;</td>
			<td style="width:315px;">Biolasco taiwan</td>
			<td style="width:119px;">Sprague-Dawley</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Puralube vet ointment</td>
			<td style="width:315px;">Dechra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">isoflurane vaporizer</td>
			<td style="width:315px;">Parkland Scientific</td>
			<td style="width:119px;">V3000PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Isoflurance</td>
			<td style="width:315px;">Attane</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Restraint bag (Decapicones)</td>
			<td style="width:315px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DC 200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ultrasonic tool for nerve conduction block in diabetic rat models

Wärmeleitung Nervenblockade mit einer hohen Intensität fokussierten Ultraschall (HIFU) wurde vor kurzem im normalen und diabetischen Tiermodell durchgeführt. HIFU kann reversibel die Leitung der peripheren Nerven blockieren, ohne Beschädigung der Nerven während der Verwendung eines entsprechenden Ultraschall-Parameters. Temporäre und teilweise Block von Aktionspotentialen der Nerven zeigt, dass die HIFU hat das Potenzial, eine nützliche klinische Behandlung zur Schmerzlinderung. Diese Arbeit zeigt die Verfahren für die Unterdrückung der Aktionspotentiale der neuropathischen Nerven in diabetischen Ratten in Vivo eine HIFU-Wandler verwenden. Der erste Schritt ist es, Erwachsene männlichen diabetische neuropathische Ratten durch die Streptozocin (STZ) Injektion zu generieren. Der zweite Schritt ist, die diabetische Neuropathie bei diabetischen Ratten STZ-induzierte durch eine elektronische von Frey-Sonde und einer heißen Platte zu bewerten. Der letzte Schritt ist es, Rekord in Vivo extrazellulären Aktionspotentialen des Nervus HIFU Beschallung ausgesetzt. Die hier gezeigten Methode kann das Studium der analgetische Ultraschallanwendungen profitieren.

Die in-Vivo -Studie zeigte, dass mit einer HIFU-Dosis von 3 s-Beschallung mit einer Intensität von 2.810 W/cm2, die CMAPs wurden um 20 % der Grundlinie unterdrückt, aber sie waren nach 30 min (Abbildung 2A, Diamanten) vollständig erholt und waren fast Konstante in der Frist von 28 Tagen (Abb. 2 b, Diamanten). Für die 5 s-HIFU-Belichtung mit der gleichen Intensität die CMAPs sank auf 65,4 % (9,5 %) der Bas...

Watch this Scientific Journal Video about An Ultrasonic Tool for Nerve Conduction Block in Diabetic Rat Models at JoVE.com

An Ultrasonic Tool for Nerve Conduction Block in Diabetic Rat Models

Dieses Werk stellt die Methodik der Anwendung hoher Intensität fokussierten Ultraschall um die Aktionspotentiale der diabetischen neuropathischen Nerven zu blockieren.

Ein Ultraschall Werkzeug für die Nervenleitung blockieren in diabetischen Ratten Modelle

Nerve conduction block with a high intensity-focused ultrasound (HIFU) transducer has been performed in normal and diabetic animal models recently. HIFU ...

an-ultrasonic-tool-for-nerve-conduction-block-in-diabetic-rat-models

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K Aufrufe.  National Health Research Institutes. Dieses Werk stellt die Methodik der Anwendung hoher Intensität fokussierten Ultraschall um die Aktionspotentiale der diabetischen neuropathischen Nerven zu blockieren.

Serie: An Ultrasonic Tool for Nerve Conduction Block in Diabetic Rat Models

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Verfahren für Dezellularisierung von Rattenlebern in einer oszillierenden Druck Perfusionsvorrichtung

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Forschung

Biotechnik

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Performance-testing Platform for a Conduction Micropump with an FR-4 Copper-clad Electrode Plate

Here, a conduction micropump with symmetric planar electrode pairs prepared on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) is fabricated. It is used to investigate the influence of chamber dimensions on the performance of a conduction micropump and to determine the reliability of the conduction pump when acetone is used as the working fluid. A testing platform is set up to evaluate conduction micropump performance under different conditions. When the chamber height is 0.2 mm, the pump pressure reaches its peak value.

This paper presents a protocol for the fabrication of a conduction micropump using symmetric planar electrodes on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) to test the influence of chamber dimensions on the performance of a conduction micropump.

Leistungstests Plattform für eine Wärmeleitung Mikropumpe mit einem FR-4 kupferummantelte Elektrodenplatte

Here, a conduction micropump with symmetric planar electrode pairs prepared on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) is ...

An Efficient and Reproducible Protocol for Distraction Osteogenesis in a Rat Model Leading to a Functional Regenerated Femur

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) is a surgical technique leading to bone regeneration after an osteotomy. The osteotomized extremities are moved away from each other by gradual distraction to reach the desired elongation. This procedure is widely used in humans for lower and upper limb lengthening, treatment after a bone nonunion, or the regeneration of a bone defect following surgery for bone tumor excision, as well as in maxillofacial reconstruction. Only a few studies clearly demonstrate the efficiency of their protocol in obtaining a functional regenerated bone, i.e., bone that will support physiological weight-bearing without fracture after removal of the external fixator. Moreover, protocols for DO vary and reproducibility is limited by lack of information, making comparison between studies difficult. The aim of this study was to develop a reproducible protocol comprising an appropriate external fixator design for rat limb lengthening, with a detailed surgical technique that permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

This study describes a reproducible and detailed protocol using a newly developed external fixator for distraction osteogenesis (DO) in a femoral rat model which permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

Eine effiziente und reproduzierbare Protokoll für Ablenkung Osteogenesis in einem Rattenmodell führt zu einer funktionalen regenerierten Femur

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Eine neuartige Operationstechnik als Grundlage für In Vivo teilweise Leber Engineering in der Ratte

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Eine multilayer mikrofluidische Plattform für die Leitung einer längeren zellfreien Genexpression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Fabrication of the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) in the Adult Rat

Recent advances in neuroprosthetics have enabled those living with extremity loss to reproduce many functions native to the absent extremity, and this is often accomplished through integration with the peripheral nervous system. Unfortunately, methods currently employed are often associated with significant tissue damage which prevents prolonged use. Additionally, these devices often lack any meaningful degree of sensory feedback as their complex construction dampens any vibrations or other sensations a user may have previously depended on when using more simple prosthetics. The composite regenerative peripheral nerve interface (C-RPNI) was developed as a stable, biologic construct with the ability to amplify efferent motor nerve signals while providing simultaneous afferent sensory feedback. The C-RPNI consists of a segment of free dermal and muscle graft secured around a target mixed sensorimotor nerve, with preferential motor nerve reinnervation of the muscle graft and sensory nerve reinnervation of the dermal graft. In rats, this construct has demonstrated the generation of compound muscle action potentials (CMAPs), amplifying the target nerve&#39;s signal from the micro- to milli-volt level, with signal to noise ratios averaging approximately 30-50. Stimulation of the dermal component of the construct generates compound sensory nerve action potentials (CSNAPs) at the proximal nerve. As such, this construct has promising future utility towards the realization of the ideal, intuitive prosthetic.

Fabrication of the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface C-RPNI in the Adult Rat

The following manuscript describes a novel method for developing a biologic, closed loop neural feedback system termed the composite regenerative peripheral nerve interface (C-RPNI). This construct has the ability to integrate with peripheral nerves to amplify efferent motor signals while simultaneously providing afferent sensory feedback.

Herstellung der Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) in der Erwachsenenratte

Recent advances in neuroprosthetics have enabled those living with extremity loss to reproduce many functions native to the absent extremity, and this is ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These issues represent drawbacks in workflows that can ultimately result in irreproducibility of research findings. Manual-based workflows are further limiting the advancement and widespread adoption of viscous materials, such as hydrogels used for biomedical applications. These challenges can be overcome by using automated workflows with standardized mixing processes to increase reproducibility. In this study, we present step-by-step instructions to use an open source protocol designer, to operate an open source workstation, and to identify reproducible mixtures. Specifically, the open source protocol designer guides the user through the experimental parameter selection and generates a ready-to-use protocol code to operate the workstation. This workstation is optimized for pipetting of viscous materials to enable automated and highly reliable handling by the integration of temperature docks for thermoresponsive materials, positive displacement pipettes for viscous materials, and an optional tip touch dock to remove excess material from the pipette tip. The validation and verification of mixtures are performed by a fast and inexpensive absorbance measurement of Orange G. This protocol presents results to obtain 80% (v/v) glycerol mixtures, a dilution series for gelatin methacryloyl (GelMA), and double network hydrogels of 5% (w/v) GelMA and 2% (w/v) alginate. A troubleshooting guide is included to support users with protocol adoption. The described workflow can be broadly applied to a number of viscous materials to generate user-defined concentrations in an automated fashion.

This protocol serves as a comprehensive tutorial for standardized and reproducible mixing of viscous materials with a novel open source automation technology. Detailed instructions are provided on the operation of a newly developed open source workstation, the usage of an open source protocol designer, and the validation and verification to identify reproducible mixtures.

Eine Open-Source-Technologieplattform zur automatisierten und standardisierten Herstellung von Hydrogel-basierten 3D-Kulturmodellen

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...