Name: murine short axis ventricular heart slices for electrophysiological studies
Uploaded: 2017-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
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Wir erkennen die Unterstützung der Workshops und der Tierfazilität des Instituts für Neurophysiologie an. Diese Arbeit wurde von der Walter und Marga Boll- Stiftung, Köln Fortune und der Deutschen Stiftung für Herzforschung unterstützt.

Die Tierhaltung muss den Richtlinien des örtlichen Tierschutzausschusses und der Richtlinie 2010/63 / EU des Europäischen Parlaments entsprechen. 1. Lösungen vorbereiten <ol><li> Die Lösung von Tyrode ohne Ca 2+ (Zusammensetzung in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, Glucose 10, HEPES 5, 2,3-Butandionmonoxim (BDM) 30. pH-Wert auf 7,4 einstellen Mit NaOH bei 4 ° C. </li><li> Die Lösung von Tyrode mit Ca 2+ (Zusammensetzung in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, Glucose 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0,9. PH-Wert auf 7,4 mit NaOH bei 4 ° C einstellen. </li><li> 4% niedrigschmelzende Agarose vorbereiten: 0,6 g Schmelzklebstoff in 15 ml Tyrode-Lösung ohne Ca 2+ geben . Die Mischung in einem Mikrowellenofen zweimal bei 750 W für 10-15 s erhitzen, bis die Agarose aufgelöst ist. Halten Sie die Lösung bei einer konstanten Temperatur von 37 &amp;# 176, C und rühren kontinuierlich. </li><li> Halten Sie Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) ohne Serum bei 37 ° C mit Carbogen (5% CO 2 , 95% O 2 ) geblasen. </li></ol> 2. Bereiten Sie das Mikrotom vor <ol><li> Schalte das Mikrotom ein. </li><li> Füllen Sie die äußere Mikrotomkammer mit Eis. </li><li> Füllen Sie die innere Mikrotomkammer mit eiskalter Tyrode-Lösung ohne Ca 2+ und kontinuierlich die Lösung mit 100% O 2 an . </li><li> Legen Sie eine Stahlklinge in den Messerhalter des Mikrotoms. </li></ol> 3. Maus Herzisolation <ol><li> 2500 U Heparin subkutan injizieren Warte 15 min. </li><li> Das Tier durch zervikale Versetzung opfern </li><li> Öffne die truhe durch sternotomie. </li><li> Sorgfältig das Perikard mit einer kleinen Schere und einer Pinzette # 5 sezieren. </li><li> Setzen Sie eine Kanüle in die aufsteigende Aorta ein und benennen Sie die Koronararterien in situ mit eiskaltem TyrodeLösung ohne Ca 2+ bis das übrige Blut entfernt wird. </li><li> Vorspeisen Sie das Herz mit einer Pinzette und einer Schere und überträgt das Herz in eiskaltes Tyrode-Lösung ohne Ca 2+ . </li><li> Trennen Sie die Vorhöfe von den Ventrikeln mit einem Skalpell oder einer Schere. </li></ol> 4. Einbettung der Ventrikel in 4% niedrigschmelzende Agarose <ol><li> Legen Sie die Ventrikel mit der Spitze nach oben in die Agarose-Form (Abbildung 1 ). Legen Sie den Stift in die Mitte der Form in die linke Kammerkammer. </li><li> Füllen Sie die Form mit 4% niedrigschmelzender Agarose bei 37 ° C, bis das Herz vollständig bedeckt ist. </li><li> Legen Sie die Form auf Eis für eine schnellere Aushärtung der Agarose, die das Schwimmen des Gewebes verhindert. </li><li> Entfernen Sie den Agaroseblock, der die Ventrikel enthält, aus der Form mit einem Skalpell. </li><li> Drehen Sie den Block umgedreht und füllen Sie die ventrikulären Kammern und die Lücke auf der Rückseite des Agarose-Blocks, die iS durch den Stift der Molte, mit 4% niedrigschmelzender Agarose unter Verwendung einer Spritze mit einer 20 G-Nadel. </li><li> Trimmen Sie den Agaroseblock mit einem Skalpell, um einen flachen Boden des Blocks und die aufrechte Position des Herzscheitels zu erreichen. </li></ol> 5. Das ventrikuläre Gewebe schneiden <ol><li> Fixieren Sie den Block auf dem Probenhalter des Mikrotoms mit einem Tropfen Cyanacrylat-Leim. Gesicht der Herzschärfe nach oben. </li><li> Legen Sie den Probenhalter in die innere Probenkammer des Mikrotoms, die mit eiskaltem Tiroler ohne Ca 2+ gefüllt ist. Den Agaroseblock vollständig mit der Tyrode-Lösung abdecken. </li><li> Kleine Achsenscheiben in einer Dicke von 150-400 μm vorbereiten, abhängig von der weiteren Anwendung (bei scharfen Elektrodenaufnahmen 150-200 μm), die Vibrationsfrequenz der Klinge bei 60-70 Hz halten und die Klinge so langsam wie möglich nach vorne bewegen . </li><li> Verwenden Sie eine feine Bürste, um die verbleibende Agarose vorsichtig aus den Scheiben zu entfernen. </li><li> Sanft transfR Scheiben mit einer Pasteurpipette in die Tyrode-Lösung mit 0,9 mM Ca 2+ belüftet mit 100% O 2 und lagern sie für mindestens 30 min auf Eis, um sich aus dem Schneidvorgang zu erholen. </li><li> Danach 30 Minuten in DMEM bei 37 ° C aufbewahren, mit Carbogen belüftet, BDM vor der weiteren Verwendung abwaschen. </li></ol> 6. Vorbereitung der Sharp Electrode Setup <ol><li> Zum Vorheizen alle elektrischen Geräte 30 min einschalten, bevor die Aufnahmen beginnen. </li><li> Setzen Sie eine 3 cm Zellkulturschale auf die Heizplatte, die auf dem invertierten Mikroskop platziert ist. </li><li> Legen Sie die maßgeschneiderte Ringelektrode (Abbildung 2 ) in die Schale und verbinden Sie die Erdungsdrähte des Vorverstärkers und der Stimulationselektrode. </li><li> Verbinden Sie die flexiblen Rohre des Perfusionssystems mit der Schale. </li><li> Füllen Sie das Reservoir des Perfusionssystems mit DMEM, belüftet mit Carbogen. </li><li> Schalte die Perfusionspumpe ein und setze die Perfusion raTe bis 2-3 mL / min. </li><li> Stellen Sie die Temperatur von DMEM in der Schale auf 37 ° C ein, indem Sie den Durchlauferhitzer und die Heizplatte regeln. </li></ol> 7. Aktion Potenzielle Aufnahmen <ol><li> Legen Sie eine ventrikuläre Scheibe in die DMEM gefüllte Schale. </li><li> Überprüfen Sie die strukturelle Integrität und Lebensfähigkeit (auf der Grundlage der kontraktilen Funktion) des Gewebes mit dem invertierten Mikroskop. </li><li> Füllen Sie eine Aufzeichnungsglaselektrode mit 3 M KCL. </li><li> Füllen Sie eine Stimulationselektrode mit DMEM. </li><li> Legen Sie die Aufzeichnungselektrode und die Stimulationselektrode auf die Elektrodenhalter. </li><li> Legen Sie die Stimulationselektrode sorgfältig auf die Scheibe und schalten Sie den elektrischen Stimulator ein. Beginnen Sie mit einer Stimulationsfrequenz von 1-2 Hz. </li><li> Bewegen Sie die Aufzeichnungselektrode mit dem Mikromanipulator über die vorgesehene Aufnahmeposition. </li><li> Langsam die Aufzeichnungselektrode absenken, bis die Spitze das Gewebe berührt. </li><li> Tragen Sie einen kurzen rechteckigen elektrischen Puls durch dieAufzeichnungselektrode, um die Zellmembran zu durchdringen. </li><li> Setzen Sie die Aufzeichnungselektrode sorgfältig ein, bis ein stabiles Signal gewährleistet ist. </li><li> Starten Sie die Aufnahme von Aktionspotentialen. </li></ol>

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	<li>Yamamoto, C., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activities+in+thin+sections+from+the+mammalian+brain+maintained+in+chemically-defined+media+in+vitro.">Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro.</a> J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).</li><li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording.">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).</li><li>Ad Graaf, I., Groothuis, G. 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A robust model to study ventricular isometric contractions.</a> Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+slices+of+adult+mouse+hearts--a+new+multicellular+in+vitro+model+for+electrophysiological+studies.">Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies.</a> Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+maturation+and+integration+of+murine+fetal+cardiomyocytes+after+transplantation.">Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation.</a> Circ. Res. 101, 484-492 (2007).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+the+electrophysiological+maturation+and+integration+of+transplanted+cardiomyocytes.">Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+persistence+and+electrical+integration+of+transplanted+fetal+cardiomyocytes+from+different+developmental+stages.">Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages.</a> Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+integration+and+action+potential+properties+of+transplanted+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).</li><li>Verrecchia, F., Herve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+blockade+of+gap+junctional+communication+by+2,3-butanedione+monoxime+in+rat+cardiac+myocytes.">Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes.</a> Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+2,3-butanedione+monoxime+(BDM)+on+Na(+)/Ca(2+)+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes.">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).</li><li>Fleischmann, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+subunit+composition+of+the+G+protein-activated+inward-rectifier+potassium+channel+during+cardiac+development.">Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development.</a> J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).</li><li>Peinkofer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Early+Embryonic+to+Adult+Stage:+Comparative+Study+of+Action+Potentials+of+Native+and+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu erklären.

Ventrikuläre Scheiben ermöglichen elektrophysiologische, pharmakologische und mechanische Untersuchungen mit einer konservierten in vivoähnlichen Gewebestruktur und einem direkten Zugang der Messtechnik zu allen Regionen des Herzens. Physiologische Wirkungspotentialeigenschaften wurden in embryonalen, neonatalen und erwachsenen Scheiben 9 , 10 , 11 nachgewiesen. Die Vitalität der Scheiben, mit Ausnahme der Oberflä...

Dünngewebescheiben wurden in der Grundwissenschaft häufig verwendet, da Yamamot und Mcllwain 1966 zeigten, dass die elektrische Aktivität von Hirnschnitten in vitro 1 aufrechterhalten wird . Seither wurden elektrophysiologische und pharmakologische Studien an Scheiben aus Gehirn 2 , Leber 3 , Lunge 4 und Myokardgewebe 5 , 6 , 7 durchgeführt. Erste Patch-Clamp-Aufnahmen in ventrikulären Scheiben aus neonatalen Rattenherzen wurden im Jahre 1990 beschrieben 8 , aber diese Technik fiel für einige Zeit in Vergessenheit. Mehr als ein Jahrzehnt später, unsere Gruppe eine neue Methode zur Vorbereitung murine embryonalen 9 , neonatale 10 und erwachsenen 11 Herz-Scheiben. Diese lebensfähigen Gewebeschnitte können für akute Experimente (erwachsene Scheibe) verwendet werdenS kann für mehrere Stunden kultiviert werden) oder kurzfristige Kulturversuche (embryonale und neonatale Scheiben können für einige Tage kultiviert werden). Die Scheiben zeigen in vivo wie elektrophysiologische Eigenschaften und eine homogene Anregungsspanne, wie sie durch scharfe Elektrodenwirkungspotentiale und Mikroelektrodenanordnungen aufgezeichnet wird 11 . Aufgrund ihrer &quot;zweidimensionalen&quot; Morphologie erlauben sie den direkten Zugang von Aufzeichnungselektroden zu allen Bereichen des Ventrikels, was sie zu einem interessanten Werkzeug für elektrophysiologische Untersuchungen macht und im Vergleich zu Langendorff-perfundierten Herzen ganz neue experimentelle Möglichkeiten aufwirft. Arzneimittelreaktion der Scheiben auf Ionenkanalblocker wie Verapamil (L-Typ Ca 2+ -Kanalblocker), Lidocain (Na + -Kanalblocker), 4-Aminopyridin (unselektivspannungsabhängiger K + -Kanalblocker) und Linopirdin (KCNQ K + -Kanal-Blocker) 9 , 11 </suP&gt; entsprach den bekannten Wirkungen auf dissoziierten Kardiomyozyten. Isometrische Kraftmessungen zeigten eine positive Kraftfrequenzbeziehung und drängten eine intakte kontraktile Funktion 10 . Diese Ergebnisse zeigten, dass murine ventrikuläre Scheiben als in vitro Gewebemodell für physiologische und pharmakologische Studien geeignet sind. Darüber hinaus haben sich die ventrikulären Scheiben der Empfängerherzen in Kombination mit scharfen Elektrodenaufnahmen als sehr hilfreiches Werkzeug erwiesen, um die elektrische und mechanische Integration sowie die Reifung der transplantierten fetalen 12 , 13 , 14 und der Stammzellen-abgeleiteten 15 Kardiomyozyten zu charakterisieren. Zusammenfassend sind ventrikuläre Scheiben ein wertvolles und gut etabliertes multizellulares Gewebemodell und sollten als komplementär zu dissoziierten Kardiomyozyten und Langendorff-perfundierten Herzen betrachtet werdenIn der Herz-Kreislauf-Forschung mit dem großen Vorteil der Bereitstellung einer in vivoähnlichen Gewebestruktur (im Gegensatz zu dissoziierten Zellen) sowie direkten Zugang von Messtechniken wie scharfe Elektrodenaufnahmen zu allen Regionen des Herzens (im Gegensatz zu ganzen Herzpräparaten).

<table><tbody><tr><td>Leica VT 1000s</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td></td><td>Microtome with vibrating blade.</td></tr><tr><td>Stainless Steel Blades</td><td>Campden Instruments, Loughborough, England</td><td>7550-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>Z627992</td><td></td></tr><tr><td>Fine brush, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; size 6 (4/32&quot;)</td><td>VWR, International, Radnor, USA</td><td>149-2125</td><td></td></tr><tr><td>Preparation table</td><td></td><td></td><td>self made</td></tr><tr><td>Molt for embedding ventricles in agarose</td><td></td><td></td><td>self made</td></tr><tr><td>1 mL Syringe</td><td>Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 3/4`` Needles</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>20 G 11/2`` Needles</td><td>4657519</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small scissor</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen gas (medical grade O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Linde, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbogen gas (95 % O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5 % CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Linde, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Henkel, D&amp;uuml;sseldorf, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low-melt Agarose</td><td>Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL</td><td>Ratiopharm, Ulm, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX</td><td>ThermoScientific, Waltham, USA</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>SEC-10LX Amplifier</td><td>npi electronic GmbH, Tamm, Germany</td><td>SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>EPC 9</td><td>HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low magnification Micromanipulator</td><td>Narashige, Tokyo, Japan</td><td>Nm-3</td><td></td></tr><tr><td>High magnification, three-axis micromanipulator</td><td>Narashige, Tokyo, Japan</td><td>MHW-3</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic perfusion pump</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>2-channel temperature controller</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany</td><td>TCO02</td><td></td></tr><tr><td>Square pulse stimulator</td><td>Natus Europe GmbH, Planegg, Germany</td><td>Grass SD9</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>1B150F-1</td><td></td></tr></tbody></table>

murine short axis ventricular heart slices for electrophysiological studies

Murine Kardiomyozyten wurden weitgehend für In-vitro- Studien der Herzphysiologie und neue therapeutische Strategien verwendet. Allerdings sind multizelluläre Präparate von dissoziierten Kardiomyozyten nicht repräsentativ für die komplexe in vivo- Struktur von Kardiomyozyten, Nicht-Myozyten und extrazellulärer Matrix, die sowohl mechanische als auch elektrophysiologische Eigenschaften des Herzens beeinflusst. Hier beschreiben wir eine Technik zur Vorbereitung lebensfähiger ventrikulärer Scheiben von erwachsenen Mausherzen mit einer konservierten in vivoähnlichen Gewebestruktur und zeigen ihre Eignung für elektrophysiologische Aufnahmen. Nach der Exzision des Herzens werden Ventrikel von den Vorhöfen abgetrennt, mit einer Ca 2+ -freien Lösung, die 2,3-Butandionmonoxim enthält, perfundiert und in einen 4% niederschmelzenden Agaroseblock eingebettet. Der Block wird auf ein Mikrotom mit einer Vibrationsklinge gelegt und Gewebeschnitte mit einer Dicke von 150-400 μm werden vorbereitet, wobei die Vibration frei bleibtQuency der Klinge bei 60-70 Hz und bewegt die Klinge so langsam wie möglich nach vorne. Die Dicke der Scheiben hängt von der weiteren Anwendung ab. Die Scheiben werden in eiskalter Tyrode-Lösung mit 0,9 mM Ca 2+ und 2,3-Butandionmonoxim (BDM) für 30 min gelagert. Danach werden die Scheiben für 30 min auf 37 ° C DMEM übertragen, um das BDM zu waschen. Scheiben können für elektrophysiologische Untersuchungen mit scharfen Elektroden oder Mikroelektroden-Arrays verwendet werden, um Kraftmessungen zu analysieren, um die kontraktile Funktion zu analysieren oder die Wechselwirkung von transplantierten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten und Wirtsgewebe zu untersuchen. Für scharfe Elektrodenaufnahmen wird eine Scheibe in eine 3 cm Zellkulturschale auf der Heizplatte eines invertierten Mikroskops gegeben. Die Scheibe wird mit einer unipolaren Elektrode stimuliert und intrazelluläre Aktionspotentiale von Kardiomyozyten innerhalb der Scheibe werden mit einer scharfen Glaselektrode aufgezeichnet.

Myokardinfarkt führt zu einem nahezu irreversiblen Verlust von Kardiomyozyten. Zell-Ersatz-Therapie mit Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten für exogene Herzregeneration ist ein vielversprechender therapeutischer Ansatz. Die elektrische Integration und Reifung der transplantierten Zellen ist entscheidend für die Sicherheit und Effizienz der Zellersatztherapie. Zur Beurteilung der Integration und Reifung wurden die von in...

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Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Hier beschreiben wir die Herstellung von lebensfähigen ventrikulären Scheiben von erwachsenen Mäusen und deren Verwendung für scharfe Elektroden-Aktionspotentialaufnahmen. Diese multizellulären Präparate bieten eine konservierte in vivoähnliche Gewebestruktur, die sie zu einem wertvollen Modell für elektrophysiologische und pharmakologische Studien in vitro macht .

Murine Kurze Axis Ventrikuläre Herzscheiben für elektrophysiologische Studien

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

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Medicine

7.3K Aufrufe.  University of Cologne.  Hier beschreiben wir die Herstellung von lebensfähigen ventrikulären Scheiben von erwachsenen Mäusen und deren Verwendung für scharfe Elektroden-Aktionspotentialaufnahmen. Diese multizellulären Präparate bieten eine konservierte in vivoähnliche Gewebestruktur, die sie zu einem wertvollen Modell für elektrophysiologische und pharmakologische Studien in vitro macht . 

Serie: Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Forschung

Biotechnik

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

Optische Bildgebung von isolierten ventrikulären Myozyten

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

Präklinische Kardiale Elektrophysiologie Bewertung durch Dual Voltage und Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and electrophysiological phenotype in the atria. That encourages us to utilize a genetically-engineered mouse model to elucidate the mechanism of AF. However, it is difficult to evaluate the electrophysiological properties in murine atria due to their small size. This protocol describes the electrophysiological evaluation of atria using an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution in Langendorff perfused murine hearts. The optical mapping system is assembled with dual high-speed complementary metal oxide semiconductor cameras and high magnification objective lenses, to detect the fluorescence of a voltage-sensitive dye and Ca2+ indicator. To focus on the assessment of murine atria, optical mapping is performed with an area of 2 mm &#215; 2 mm or 10 mm x 10 mm, with a 100 &#215; 100 resolution (20 &#181;m/pixel or 100 &#181;m/pixel) and sampling rate of up to 10 kHz (0.1 ms) at maximum. A 1-French size quadripolar electrode pacing catheter is placed into the right atrium through the superior vena cava avoiding any mechanical damage to the atrium, and pacing stimulation is delivered through the catheter. An electrophysiological study is performed with programmed stimulation including constant pacing, burst pacing, and up to triple extrastimuli pacing. Under a spontaneous or pacing rhythm, the optical mapping recorded the action potential duration, activation map, conduction velocity, and Ca2+ transient individually in the right and left atria. In addition, the programmed stimulation also determines the inducibility of atrial tachyarrhythmias. Precise activation mapping is performed to identify the propagation of the excitation in the atrium during an induced atrial tachyarrhythmia. Optical mapping with a specialized setting enables a thorough electrophysiological evaluation of the atrium in murine pathological models.

This protocol describes the electrophysiological evaluation of murine atria utilizing an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution, including dual recordings of the membrane voltage and Ca2+ transient under programmed stimulation through a specialized electrode catheter.

Elektrophysiologische Bewertung der murinen Atria mit hochauflösenden optischen Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Medizin

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolierung und Kv Kanal Recordings in Murine atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Biologie

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to larger animals. Yet, larger mammals are better suited for translational research questions related to normal cardiac physiology, pathophysiology, and preclinical testing of therapeutic agents. To overcome the technical barriers associated with employing a larger animal model in cardiac research, we describe an approach to measure physiological parameters in an isolated, Langendorff-perfused piglet heart. This approach combines two powerful experimental tools to evaluate the state of the heart: electrophysiology (EP) study and simultaneous optical mapping of transmembrane voltage and intracellular calcium using parameter sensitive dyes (RH237, Rhod2-AM). The described methodologies are well suited for translational studies investigating the cardiac conduction system, alterations in action potential morphology, calcium handling, excitation-contraction coupling and the incidence of cardiac alternans or arrhythmias.

The objective of this study was to establish a method for investigating cardiac dynamics using a translational animal model. The described experimental approach incorporates dual-emission optocardiography in conjunction with an electrophysiological study to assess electrical activity in an isolated, intact porcine heart model.

Optokardiographie und Elektrophysiologie Studien an Ex Vivo Langendorff-perfundierten Herzen

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or bradycardia. Reliable identification of cardiac pacemaking defects requires the measurement of intrinsic heart rates by largely preventing the influence of the autonomic nervous system, which can mask rate deficits. Traditional methods to analyze intrinsic cardiac pacemaker function include drug-induced autonomic blockade to measure in vivo heart rates, isolated heart recordings to measure intrinsic heart rates, and sinoatrial strip or single-cell patch-clamp recordings of sinoatrial pacemaker cells to measure spontaneous action potential firing rates. However, these more traditional techniques can be technically challenging and difficult to perform. Here, we present a new methodology to measure intrinsic cardiac firing rate by performing microelectrode array (MEA) recordings of whole-mount sinoatrial node preparations from mice. MEAs are composed of multiple microelectrodes arranged in a grid-like pattern for recording in vitro extracellular field potentials. The method described herein has the combined advantage of being relatively faster, simpler, and more precise than previous approaches for recording intrinsic heart rates, while also allowing easy pharmacological interrogation.

This protocol aims to describe a new methodology to measure intrinsic cardiac firing rate using microelectrode array recording of the whole sinoatrial node tissue to identify pacemaking defects in mice. Pharmacological agents can also be introduced in this method to study their effects on intrinsic pacemaking.

Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung der Sinoatrialknoten-Feuerrate zur Identifizierung intrinsischer Herzschrittmacherfehler bei Mäusen

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

Isolierung menschlicher ventrikulärer Kardiomyozyten aus Vibratome-Cut Myokardscheiben

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Generation of Porcine Ventricular Slices: A Vibratome-based Technique to Prepare Ultra-thin Slices of Pig Heart Tissue

Source: Ou, Q. et. al., <a href="https://www.jove.com/v/60913">Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video demonstrates a vibratome-based procedure to generate viable, ultra-thin sections of pig heart. The prepared tissue slices can be cultured and used as model systems for pharmacological testing.

Erzeugung ventrikulärer Schweineschnitte: Eine Vibratom-basierte Technik zur Herstellung ultradünner Scheiben von Schweineherzgewebe

Source: Ou, Q. et. al., Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (2020)
This video demonstrates a vibratome-based ...