Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus der Europäischen Gemeinschaft [RP7-Menschen-2011-IAPP Projekt 285827 (EPIXCHANGE)].

Alle experimentelle Protokolle wurden von der Ethikkommission der Universität von Ferrara für Tier-Experimente und das italienische Gesundheitsministerium genehmigt. Die Ankunft (Animal Research: Berichterstattung In Vivo Experimente11) Richtlinien befolgt wurden.
1. Vorbereitung des Quarz-Nadeln
<ol><li>Reinigen Sie und sterilisieren Sie die Quarz-Kapillaren (siehe Tabelle der Materialien), indem man sie für 5 min in destilliertem Wasser, 5 min in Ethanol 99 % und 5 min in Diethylether.</li>
	<li>Lassen Sie die Kapillaren unter der Haube für mindestens 1 h bis sie vollständig trocknen lassen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Nadeln mit einem Laser Abzieher nach Parametern, die die Produktion von einer ausreichend langen, ausreichend dünnen Nadel, je nach den individuellen Bedürfnissen zu ermöglichen. Hinweis: Wir verwenden einen Laser-Puller (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie ein zwei Zeilen Programm zum ziehen. Die erste Zeile verwendet high-Power, der größte Scan Länge (Filamente Wert entspricht) und keine Zugkraft. Diese Kombination von Parametern führt zum Schmelzen des größten Teils der Kapillare mit die niedrigsten Ausschubgeschwindigkeit, so dass für die Gestaltung einer langen Nadel mit großen inneren/äußeren Größe und Schaft reduziert. Auf diese Weise bewahrt die Nadel eine hohe mechanische Festigkeit und breit Innendurchmesser, die im Laufe der Stammzellen oder Viruspartikel ohne zu verstopfen kann. Geschwindigkeit und Verzögerung von dieser Programmzeile sollte die Kapillarleitung stoppen, bevor die Spitze zu klein und lang, fehlen die erforderlichen mechanischen und Formcharakteristik wird. Die zweite Zeile des Programms ziehen wird automatisch ausgeführt, sobald die Quarz abkühlt (5 s). Parameter der macht, Filament und Zugkraft sind funktionell, schneiden Sie einen Tipp mit der kürzesten möglichen Spitzenlänge und steilen Schaft, die Trennung der beiden Nadeln mit einem Tipp-Bruch zu vermeiden. Routinemäßig, mit unserem Equipment verwenden wir Folgendes: (a) Linie 1 = Power 990, Filament 5, Geschwindigkeit 130, Verzögerung 110, ziehen 0; (b) Linie 2 = Power 970, Filament 3, Geschwindigkeit 0 Verzögerung 70, 0 zu ziehen.</li>
	<li>Setzen Sie die Nadeln in einer Petrischale mit Ethanol 70 % zuvor gereinigt.<ol>
<li>Bedecken Sie die Schüssel mit einem Kunststoff Paraffin-Film.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geschnitten Sie die Kapillaren an der Mikro-Sezierer.<ol>
<li>Lassen Sie bei der Inbetriebnahme der Laser führen einen Selbstkalibrierung Prozess um zu überprüfen, Kraft und Energie geliefert. Legen Sie die Bearbeitungsparameter. Hinweis: Wir verwenden eine Mikro-Sezierer (siehe Tabelle der Materialien) und die folgenden Parameter: laser macht Pulsenergie (63 µJ), Laser Strahldurchmesser von 20 % der maximalen Öffnung (maximale Blende: 1,0 µm), und Schnittgeschwindigkeit von 10 % der maximalen Geschwindigkeit (maximal Geschwindigkeit: 30 µm/s).</li>
		<li>Fest fixieren Sie die Nadel auf den Mikroskoptisch und positionieren Sie seine Spitze in der Mitte des Bildschirms.</li>
		<li>Klicken Sie in der Menüleiste auf das Bleistift-Symbol und verwenden Sie, um ein Zeichen für das Laserschneiden der Nadel ziehen. Hinweis: Der Schnitt sollte in einem Winkel von ca. 45° in Bezug auf die Nadel Oberfläche sein.</li>
		<li>Wählen Sie auf der Seite Bar-Funktion die Flagge enthält die "START CUT"-Schaltfläche, um den Laser auf die vorher markierte Stelle schneiden lassen.</li>
		<li>Bei Bedarf schneiden Sie Seite Fehlerzustand durch Wiederholung in 1.5.2-3 beschriebenen Verfahren; Es gibt keine Notwendigkeit, die Nadel (Abbildung 1) neu zu positionieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach dem Schneiden Sie, Reinigung.<ol>
<li>Verbinden Sie die Nadel auf eine leere Pumpe durch ein Kunststoffrohr.</li>
		<li>Schalten Sie die Pumpe ein und legen Sie manuell die Vorlauf-Rate mit mäßiger Geschwindigkeit (3 µL/min).</li>
		<li>Aspirieren das 99 % Ethanol zuerst und dann das destillierte Wasser Verunreinigungen durch Schneiden zu entfernen.</li>
		<li>Aspirieren Sie die 99 % Ethanol wieder um die Trocknung zu erleichtern. Hinweis: Jeder Schritt sollte mindestens 3 min dauern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Speichern Sie die Nadeln in einer richtig bedeckten Petrischale bis zum Tag der Operation.</li>
	<li>Nadeln können wieder verwendet werden; am Ende des Experiments reinigen Sie mit Bleichmittel und Ethanol, die Lösung und mögliche Gewebe entfernen. Füllen Sie für eine vollständigere Reinigung, setzen Sie die Nadeln in einer Mikropipette Vorratsgefäß mit der Spitze nach unten das Glas mit destilliertem Wasser, bis die Spitzen bedeckt sind, Kochen Sie für 1,5 min alle übrig gebliebenen Gewebe zu entfernen, dann waschen mit Ethanol.</li>
</ol>(2) Verfahren
<ol><li>Wählen Sie das Menü "Einstellungen", um die Pumpe nach dem Durchmesser/Volumen der Mikroinjektion Spritze zu kalibrieren und Einstellen der Durchflussmenge bei 0,3 µL/min, nach den Anweisungen der Bedienungsanleitung der Pumpe.</li>
	<li>Füllen Sie eine 10-mL-Spritze (ausgestattet mit einer stumpfen Nadel (z.B.Hamilton Nadel, 30 G) und einem kurzen Polytetrafluorethylen-Rohr) mit sterilem Wasser und es verwenden Sie, um die Mikroinjektion Spritze (nach den Kolben vorsichtig entfernen) und die Injektion zu füllen Montage-Teilesatz für die manuelle Mikroinjektion Pumpe (MMP). Hinweis: Das MMP-Kit wird verwendet, um die Nadel in der stereotaktische Rahmen (Abbildung 2) sicher zu montieren. Das Kit besteht aus: einem Polytetrafluorethylen-Schläuche, Luer-Anschluss-Schläuche-Koppler, Pipette Halter und Dichtungen für Pipetten mit verschiedenen Außendurchmesser.</li>
	<li>Verbinden Sie die Nadel mit dem MMP-Kit.<ol>
<li>Spülen Sie mehr Wasser über das System zu, durch die 10-mL-Spritze, und überprüfen Sie, ob das Wasser aus der Nadel kommt. Hinweis: Stellen Sie sicher Luftblase im Inneren des Systems entfernen indem Sie die Füllung Schritte wiederholen.</li>
	</ol></li>
	<li>Trennen Sie die 10-mL-Spritze aus der Mikroinjektion Spritze drücken Sie langsam den Kolben um einen Tropfen Wasser an der Spitze der Mikroinjektion Spritze zu verlassen. Setzen Sie den Kolben in der Mikroinjektion Spritze.</li>
	<li>Die Mikroinjektion Spritze an die Pumpe anschließen und die Durchflussmenge bei 0,3 µL/min eingestellt. Hinweis: Warten Sie, bis ein Tropfen Austritt aus der Spitze der Nadel und dann für weitere 3 Minuten gehen lassen.</li>
	<li>Legen Sie den Fluss bei 0,1 µL/min und starten Sie die Operation. Die Pumpe sollte während der Durchführung der Operation laufenden. Hinweis: Für die Experimente berichtet in diesem Artikel verwenden wir männliche Sprague-Dawley Ratten 300 g (3 Monate alt). Das Verfahren ist jedoch insbesondere anwendbar auf andere Arten, Mäuse.</li>
	<li>Induzieren Sie Vollnarkose mit einer Methode, die von örtlichen Vorschriften genehmigt. Hinweis: Wir verwenden eine Mischung aus intraperitonealer Injektion (i.p.) von 85 mg/kg Ketamin und 8 mg/kg Xylazin für 20-50 min der Anästhesie. Es ist wichtig, dass Rute und/oder Zehen Prisen verwendet werden, um sicherzustellen, dass das Tier völlig sediert ist. Ebene der Anästhesie und grundlegende Eingeweide sind geprüft, bevor Chirurgie beginnt und alle 10 Minuten während der Durchführung der Operation überwacht. Tierischen Körpertemperatur ist konstant vor, während und nach chirurgischen Eingriffen mit einem Wasser wieder zirkulierenden Heizkissen gehalten. Tiere werden überwacht, bis vollständig erholt (z. B. sie sind aufrecht und ambulante). Darüber hinaus erhalten Tiere Analgetika (Tramadol, 5 – 7 mg/kg i.p) postoperativ alle 24 h für drei Tage.<ol>
<li>Der Kopf des Tieres zu rasieren und angemessene Vorbereitung der Operationsstelle für aseptische Chirurgie. Führen Sie eine zwei-Phasen-Peeling mit Jod-Lösung (Betadine) gefolgt von 70 % igem Ethanol. Darüber hinaus um Asepsis zu halten, wickeln die Operationsstelle mit einem chirurgischen Tuch (in dem Video wurde zu Demonstrationszwecken weggelassen worden).</li>
	</ol></li>
	<li>Positionieren Sie die Ratte in der stereotaktischen Rahmen über ein Wasser wieder zirkulierenden Wärme-Unterbett. Um zusätzliche Schmerzfreiheit am Ort der Operation gelten 0,5 % Lidocain-Lösung (7 mg/kg nicht überschreiten). Sterilisieren Sie vorab alle chirurgischen Instrumente mit einer Wulst Sterilisator oder Flüssigkeit kalt Desinfektion von selbstvergessen die Ausrüstung entweder 2 % Glutaraldehyd plus 7,05 % Phenol (Sporodicin oder Cidex) gefolgt von Spülen mit sterilem Wasser oder Kochsalzlösung. Die Desinfektion muss auch zwischen Verfahren durchgeführt werden. Machen Sie einen längs-Schnitt über den Schädel mit einem sterilen Skalpell. Seien Sie sanft, übermäßige Blutung zu vermeiden. Öffnen Sie die Kopfhaut mit einem flachen Spatel und chirurgische Clips auf die Hautlappen es geöffnet zu halten. Lösen Sie sehr sanft das Periost, aussetzen der Bregma und den Bereich des Schädels durch die Nadel eingeführt wird.</li>
	<li>Montieren Sie den Arm auf der stereotaktischen Rahmen (während die Strömung läuft) und bewegen Sie die Spitze der Nadel genau auf Bregma, die Aufmerksamkeit nicht auf die Spitze zu brechen. Kommentieren Sie die Antero-posterioren und Medio-lateralen Koordinaten der Bregma und übersetzen Sie, um die gewünschten Koordinaten. Geleitet von einem Stereomikroskop, senken Sie die Nadel, bis seine Spitze berührt fast den Schädel, markieren Sie die Bohrungen nach Anhebung des stereotaktischen Arms ein wenig vor Ort.</li>
	<li>Bohren (Spitze Ø Bohren: 0,8 mm; Drehzahl: 1.000 u/min) den Schädel auf der markierten Stelle. Vorsicht ist geboten, nicht zu die Dura bei den Bohrungen zu durchdringen. Während des Bohrens Tropfen Sie sterilen Kochsalzlösung zur Vermeidung von Knochenschädigung und Nekrose.</li>
	<li>Schneiden Sie ein kleines Stück Kunststoff Paraffin Film und legen Sie es auf den Schädel. Mit 10 µL pipettieren, machen Sie einen Tropfen der Lösung auf dem Kunststoff Paraffin-Film zu injizieren. Stoppen Sie die Pumpe leicht Abrufen der Drücker der Pumpe und erstellen eine kleine Luftblase in der Kapillare durch leichtes Ziehen des Kolbens der Spritze Mikroinjektion.</li>
	<li>Senken Sie die stereotaktischen Arm, bis die Spitze der Nadel die Tropfen erreicht. Zeichnen Sie die Probe durch ziehen (sehr langsam) den Kolben der Spritze Mikroinjektion, Blasenbildung zu vermeiden. Ersetzen Sie die Pumpe Drücker in Kontakt mit dem Kolben und schalten Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von 0,3 µL/min Wartezeit bis zur Bildung eines Tropfens (wenige Minuten) bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Hinweis: Im vorliegenden Beispiel Experiment wurde künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) im Striatum infundiert (AP: 1,5 ML: ±2.7; DV: -5,0) und im dorsalen Hippocampus (AP: -3,5, ML: ±2.1; DV:-3.5; in mm von Dura) 2 µL/Website. Um den Vergleich zwischen den beiden Methoden zu erleichtern, wurde jeder Bereich des Gehirns infundiert mit einer Quarz-Nadel in einer Hemisphäre und eine stumpfe Spitze 26 G oder 30 G Abschrägung-Tip Edelstahl Nadel in die andere.</li>
	<li>Senken Sie der Fluss auf 0,1 µL/min, nick die Dura mit einer Edelstahl-Fase-Tip-Nadel und senken Sie langsam die stereotaktischen Arm auf die dorsal-Ventral-Axt, Eintritt in das Hirngewebe. Wenn die gewünschte Position erreicht ist, gehen Sie unten zusätzliche 0,1 mm, die Pumpe zu stoppen, die stereotaktischen Arm von 0,1 mm zu erhöhen und starten Sie erneut die Pumpe an den Fluss auf 0,3 µL/min. Hinweis: Der Grund, eine langsame Strömung pflegen und senken die Nadel soll einen positiven Druck sichergestellt, der Eindringen von kleinen Fragmente von Gewebe in die Nadel selbst vermeidet. Ein solches würde den Tipp, beeinträchtigen die Lieferung der Lösung behindern. Da die Durchflussmenge sehr langsam ist, während die Nadel und die Geschwindigkeit der Senkung zu senken ca. 10 s/mm ist, bedeutet dies, dass die Mengen der Lösung, die entlang der Strecke Nadel bleiben vernachlässigbar im Vergleich zu denen an den Zielstandort injiziert. Diese Vorsichtsmaßnahme kann vermieden werden, wenn Nadeln mit seitlichen Bohrungen zu verwenden.</li>
	<li>Starten Sie die Stoppuhr und warten Sie, die benötigte Zeit je nach der gewünschten Lautstärke zu injizieren (z. B. 6 min 40 s wenn 2 µL injizieren). Überwachen Sie die Blase Bewegung während der Injektion. Am Ende stoppen Sie die Pumpe zu und warten Sie 5 min, bevor die Nadel langsam abrufen. Wenn die Quarz-Nadel vollständig extrahiert wird, starten Sie die Pumpe wieder und überprüfen Sie für die Bildung eines Tropfens an der Spitze der Nadel.</li>
	<li>Verschließen der Öffnung in der Oberfläche der Schädel mit Knochen Wachs, hämostatischen Clips entfernen und Naht der Kopfhaut, das Gebiet rund um die Wunde mit einer antibiotischen Creme (z.B. Neosporin) zu beschichten und das Tier zu Hause Käfig zurückkehren. Hinweis: Im Anschluss an die Euthanasie-Protokoll genehmigt durch die institutionellen Ethik-Ausschuß für die Experimente, die in diesem Artikel beschriebenen Tiere waren tief mit einer Injektion i.p. 43 mg/kg Ketamin und 7 mg/kg Xylazin betäubt und enthauptet. Gehirne wurden entfernt, postfixed in Formalin für 48 h und Paraffin eingebettet. Koronalen Abschnitte des Gehirns (8 µm) wurden mit einem Mikrotom geschnitten.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kirik, D., Rosenblad, C., Bj&#246;rklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+behavioral+and+neurodegenerative+changes+following+partial+lesions+of+the+nigrostriatal+dopamine+system+induced+by+intrastriatal+6-hydroxydopamine+in+the+rat.">Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat.</a> Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).</li><li>Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eltoprazine+prevents+levodopa-induced+dyskinesias+by+reducing+striatal+glutamate+and+direct+pathway+activity.">Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity.</a> Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).</li><li>Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+pay+attention:+attentional+performance+time-stamped+prefrontal+cholinergic+activation,+diurnality,+and+performance.">Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance.</a> J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).</li><li>Shoichet, M. S., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+delivery+to+the+central+nervous+system.">Cell delivery to the central nervous system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).</li><li>Simonato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+gene+therapy+for+neurological+disorders.">Progress in gene therapy for neurological disorders.</a> Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).</li><li>Bj&#246;rklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-and+Long-Term+Consequences+of+Intracranial+Injections+of+the+Excitotoxin,+Quinolinic+Acid,+as+Evidenced+by+GFA+Immunohistochemistry+of+Astrocytes.">Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes.</a> Brain Res. 317, 267-277 (1986).</li><li>Paradiso, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+delivery+of+fibroblast+growth+factor-2+and+brain-derived+neurotrophic+factor+reduces+spontaneous+seizures+in+an+epilepsy+model.">Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).</li><li>Falcicchia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Status+Epilepticus-Induced+BDNF+Expression+with+Herpes+Simplex+Virus+Type-1+Based+Amplicon+Vectors.">Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors.</a> PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).</li><li>Munoz, J. L., Coles, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz+micropipettes+for+intracellular+voltage+microelectrodes+and+ion-selective+microelectrodes.">Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes.</a> J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+research:+reporting+in+vivo+experiments:+the+ARRIVE+guidelines.">Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).</li><li>Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+cell+therapies+to+the+clinic:+characteristics+of+cell+suspensions+in+large-diameter+injection+cannulae.">Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae.</a> Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Artikel beschriebene Verfahren erfüllt die Bedürfnisse dargelegt in der Einleitung zur Optimierung Mikroinjektionen, die für verschiedene Zwecke12ausgeführt werden. Die hier beschriebenen Nadeln reduzieren Schäden auf ein minimum, im Wesentlichen nicht detektierbare Niveau; an der Abweichung mit Glas-Nadeln (, die anfällig für biegen), Quarz-Nadeln sind starr und gewährleisten einen zuverlässige Hit von der gewünschten Hirnregion sogar in tiefen Koordinaten. Zu...

Mikroinjektionen wurden für eine lange Zeit für die Lieferung von pharmakologisch wirksamen Verbindungen zur neuronalen Aktivität in bestimmten Hirnarealen zu modulieren. Darüber hinaus wurden sie zur Giftstoffe in der Nähe von bestimmten neuronalen Populationen, um Neurodegenerative Veranstaltungen charakteristisch für bestimmte Krankheiten, z. B. 6-hydroxy-Dopamin im Nigrostriatal Dopaminsystem der Parkinson-Krankheit zu imitieren zu imitieren injizieren 1 , 2 oder Immunotoxin 192 IgG Saporin, Läsion der cholinergen System3. Vor kurzem wurden Mikroinjektion Verfahren zur viralen Vektoren oder Zellen Transplantate für experimentelle Gehirn Störungen4,5gen oder Zelle Therapie liefern.
Die klassische Art der Nadeln, die in diesen Studien beschäftigt ist aus Edelstahl gefertigt. Obwohl einfach und praktisch in der Handhabung, Stahl Nadeln haben eine Reihe von Problemen6: sie sind relativ groß und kann dazu führen, dass Gewebeschäden, mit Austritt von Blut - Hirn-Schranke und Aktivierung der Astrozyten; Darüber hinaus können sie produzieren, Entkernung des Hirngewebes, die in die Nadel ein Hindernis oder sogar ganz vermeiden Strömung der gewünschten Lösung kommt. In jüngerer Zeit, verwenden Glas Nadeln bereit ad hoc aus Kapillaren wurden eingeführt in7,8. Diese verursachen keine signifikante Gewebe Schaden oder Astrozyten Aktivierung, aber sind relativ flexibel und können verbiegen als Tiefenstrukturen, reduziert die Genauigkeit der Lokalisierung (persönliche Beobachtungen) eingeführt.
Daher besteht die Notwendigkeit, so viel wie möglich Schaden zu reduzieren (vor allem bei Experimente, um Schaden zu heilen) und Erhöhung der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit (d.h., sicherzustellen, dass alle Lösung geliefert wird und korrekte Lokalisierung zu gewährleisten). Darüber hinaus wäre es wünschenswert, verschiedenen Nadel Designs zu verwenden, zur Gewährleistung einer optimalen Verteilung der injizierten Lösung in Hirnarealen mit unterschiedlichen Geometrien. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll um vorzubereiten und Quarz Nadeln für Mikroinjektionen im Nagetier Gehirn. Aufgrund der hohen Schmelzpunkt Quarz Kapillaren können nicht auf einem herkömmlichen Abzieher gezogen werden und daher nicht verwendet wurden in der Vergangenheit, um Nadeln zu generieren. Quarz, bietet jedoch einige wichtige Vorteile gegenüber Glas, insbesondere eine hohe Steifigkeit und Pause Widerstand9. Infolge ihrer Unbeugsamkeit sind Quarz Nadeln geeignet für Injektionen in ventralen Hirnregionen. Durch ihre hohe Beständigkeit gegen Bruch können sie modelliert werden, um mehrere Löcher, Erlangung Designs, die am effektivsten erweisen, selbst wenn Gehirnregionen mit komplexen Geometrien10gezielt erweitert.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Quartz capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA USA</td>
			<td>Q100-50-10</td>
			<td>Without filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette storage jar</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>E210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser microdissector</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, St&#376;tzerbach, Germany</td>
			<td>19138-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinfusion pump</td>
			<td>Univentor, Zejtun, Malta</td>
			<td>Model 864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual microinjection pump kit</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Item#: MMP-KIT</td>
			<td>Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Drill</td>
			<td>Proxxon</td>
			<td>28510 MicroMot 50/E</td>
			<td>Ball bearing drive shaft with variable speed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artficial Cerebral Spinal Fluid</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>26 G Blunt: 19138-U 
			30 G Bevel: 20757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>LEICA RM212RT</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

personalized needles for microinjections in the rodent brain

Mikroinjektionen werden für eine lange Zeit für die Lieferung der Medikamente oder Giftstoffe in bestimmten Hirnarealen, und in jüngerer Zeit, sie wurden verwendet, um gen oder Zelle Therapie-Produkte zu liefern. Leider, aktuelle Mikroinjektion Techniken verwenden, Stahl oder Glas Nadeln, die aus mehreren Gründen suboptimal sind: insbesondere Stahl Nadeln können dazu führen, dass Gewebeschäden und Glas Nadeln können verbiegen, wenn tief ins Gehirn, senkte die Zielregion fehlt. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Quarz-Nadeln, die eine Reihe von nützlichen Funktionen kombinieren verwenden. Diese Nadeln produzieren keine nachweisbaren Gewebeschädigung und als sehr steif, zuverlässige Lieferung in die gewünschte Hirnregion zu gewährleisten, auch wenn Sie Tiefe Koordinaten verwenden. Darüber hinaus ist es möglich, das Design der Nadel zu personalisieren, indem man mehrere Löcher von den gewünschten Durchmesser. Mehrere Bohrungen erleichtern die Injektion von großen Mengen der Lösung innerhalb eines größeren Bereichs, während große Löcher die Injektion von Zellen erleichtern. Darüber hinaus können diese Quarz-Nadeln gereinigt und wiederverwendet, so dass das Verfahren kostengünstiger wird.

Wir verglichen Schäden induziert durch direkte Mikroinjektion in der Ratte dorsalen Hippocampus und Striatum mit einer Quarz-Nadel (60 µM Außendurchmesser Tipp; 20 µM Durchmesser Bohrung Typ C, Abbildung 1) verglichen mit zwei Klassiker, stumpfen Ende 26 G und 30 G schräge Kante Edelstahl-Nadeln. Zu diesem Zweck wir injiziert 2 µL der ACFS rechts und links dorsalen Hippocampus und Striatum mit bzw. Quarz und Stahlnadel und 48 h nach der Injektion, wir G...

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Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Wir beschreiben hier ein Protokoll für die Mikroinjektion im Nagetier Gehirn, das Quarz-Nadeln verwendet. Diese Nadeln nicht nachweisbar Gewebeschäden zu produzieren und zuverlässige Lieferung auch in tiefen Regionen zu gewährleisten. Darüber hinaus können sie Forschungsbedarf durch personifizierte Entwürfe angepasst und können wiederverwendet werden.

Personalisierte Nadeln für Mikroinjektionen im Nagetier Gehirn

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

personalized-needles-for-microinjections-in-the-rodent-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.1K Aufrufe.  University of Ferrara. Wir beschreiben hier ein Protokoll für die Mikroinjektion im Nagetier Gehirn, das Quarz-Nadeln verwendet. Diese Nadeln nicht nachweisbar Gewebeschäden zu produzieren und zuverlässige Lieferung auch in tiefen Regionen zu gewährleisten. Darüber hinaus können sie Forschungsbedarf durch personifizierte Entwürfe angepasst und können wiederverwendet werden.

Serie: Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in which functional MRI data and in vivo intracortical recording can be performed simultaneously. The combination of MRI and electrical recording is technically challenging because the electrodes used for recording distort the MRI images and the MRI acquisition induces noise in the electrical recording. To minimize the mutual interference of the two modalities, glass microelectrodes were used rather than metal and a noise removal algorithm was implemented for the electrophysiology data. In our studies, two microelectrodes were separately implanted in bilateral primary somatosensory cortices (SI) of the rat and fixed in place. One coronal slice covering the electrode tips was selected for functional MRI. Electrode shafts and fixation positions were not included in the image slice to avoid imaging artifacts. The removed scalp was replaced with toothpaste to reduce susceptibility mismatch and prevent Gibbs ringing artifacts in the images. The artifact structure induced in the electrical recordings by the rapidly-switching magnetic fields during image acquisition was characterized by averaging all cycles of scans for each run. The noise structure during imaging was then subtracted from original recordings. The denoised time courses were then used for further analysis in combination with the fMRI data. As an example, the simultaneous acquisition was used to determine the relationship between spontaneous fMRI BOLD signals and band-limited intracortical electrical activity. Simultaneous fMRI and electrophysiological recording in the rodent will provide a platform for many exciting applications in neuroscience in addition to elucidating the relationship between the fMRI BOLD signal and neuronal activity.

We have developed a method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and electrophysiological recording in the rodent brain, providing a platform for the investigation of the relationship between neural activity and the blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signal.

Gleichzeitige fMRI und Elektrophysiologie in der Nager Gehirn

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain proper, that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis. The tissue harvested is suitable for biochemical and physiological analysis, and the MAV has been shown to be sensitive to damage produced by amphetamine and hyperthermia 1,2. As well, the major and minor cerebral vasculatures harvested in MAV are of potentially high interest when investigating concussive types of head trauma. The MAV dissected in this presentation consists of the pial and some of the arachnoid membrane (less dura) of the meninges and the major and minor cerebral surface vasculature. The choroid plexus dissected is the structure that resides in the lateral ventricles as described by Oldfield and McKinley3,4,5,6. The methods used for harvesting these two tissues also facilitate the harvesting of regional cortical tissue devoid of meninges and larger cerebral surface vasculature, and is compatible with harvesting other brain tissues such as striatum, hypothalamus, hippocampus, etc. The dissection of the two tissues takes from 5 to 10 min total. The gene expression levels for the dissected MAV and choroid plexus, as shown and described in this presentation can be found at GSE23093 (MAV) and GSE29733 (choroid plexus) at the NCBI GEO repository. This data has been, and is being, used to help further understand the functioning of the MAV and choroid plexus and how neurotoxic events such as severe hyperthermia and AMPH adversely affect their function.

This video presentation shows a method of harvesting the two most important highly vascular structures that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis.

Ein Visual Beschreibung der Dissektion der Hirnoberfläche Gefäßsystem und assoziierten Hirnhäute und der Aderhaut Plexus aus Rattenhirn

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Auswirkungen der Explosion-induzierte Neurotrauma auf Druck Nagetier mittlerer Hirnarterien

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Translational Brain Mapping at the University of Rochester Medical Center: Preserving the Mind Through Personalized Brain Mapping

The Translational Brain Mapping Program at the University of Rochester is an interdisciplinary effort that integrates cognitive science, neurophysiology, neuroanesthesia, and neurosurgery. Patients who have tumors or epileptogenic tissue in eloquent brain areas are studied preoperatively with functional and structural MRI, and intraoperatively with direct electrical stimulation mapping. Post-operative neural and cognitive outcome measures fuel basic science studies about the factors that mediate good versus poor outcome after surgery, and how brain mapping can be further optimized to ensure the best outcome for future patients. In this article, we describe the interdisciplinary workflow that allows our team to meet the synergistic goals of optimizing patient outcome and advancing scientific understanding of the human brain.

This article provides an overview of a multi-modal brain mapping program designed to identify regions of the brain that support critical cognitive functions in individual neurosurgery patients.

Translational Brain Mapping am University of Rochester Medical Center: Erhaltung des Geistes durch personalisierte Brain Mapping

The Translational Brain Mapping Program at the University of Rochester is an interdisciplinary effort that integrates cognitive science, neurophysiology, ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

Einsatz von Infrarot-Fluoreszenz und hochauflösendem Scannen zur Messung des Protein-Expression im Rodentrains

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases in ubiquitin-proteasome activity are critical for synaptic plasticity and memory formation and aberrant changes in this system are associated with a variety of neurological, neurodegenerative and psychiatric disorders. One of the issues in studying ubiquitin-proteasome functioning in the brain is that it is present in all cellular compartments, in which the protein targets, functional role and mechanisms of regulation can vary widely. As a result, the ability to directly compare brain ubiquitin protein targeting and proteasome catalytic activity in different subcellular compartments within the same animal is critical for fully understanding how the UPS contributes to synaptic plasticity, memory and disease. The method described here allows collection of nuclear, cytoplasmic and crude synaptic fractions from the same rodent (rat) brain, followed by simultaneous quantification of proteasome catalytic activity (indirectly, providing activity of the proteasome core only) and linkage-specific ubiquitin protein tagging. Thus, the method can be used to directly compare subcellular changes in ubiquitin-proteasome activity in different brain regions in the same animal during synaptic plasticity, memory formation and different disease states. This method can also be used to assess the subcellular distribution and function of other proteins within the same animal.

This protocol is designed to efficiently quantify ubiquitin-proteasome system (UPS) activity in different cellular compartments of the rodent brain. Users are able to examine UPS functioning in nuclear, cytoplasmic and synaptic fractions in the same animal, reducing the amount of time and number of animals needed to perform these complex analyses.

Quantifizierung subzellulärer Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Nagetierhirn

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...