Name: personalized needles for microinjections in the rodent brain
Uploaded: 2018-01-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
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이 작품은 유럽 공동체 [FP7-사람-2011-IAPP 프로젝트 285827 (EPIXCHANGE)]에서 교부 금에 의해 지원 되었습니다.

모든 실험 프로토콜은 동물 실험에 대 한 페라라 대학 윤리 위원회 및 건강의 이탈리아 정부에 의해 승인 되었다. 도착 (동물 연구: Vivo 실험에서 보고11) 지침에 따라 되었습니다.
1입니다. 석 영 바늘의 준비
<ol><li>깨끗 하 고 증류수에 5 분, 에탄올 99%, 5 분 및 5 분 diethyl-에테르에서 그들을 배치 하 여 석 영 모 세관 ( 재료의 표참조)을 소독.</li>
	<li>그들이 말리 면 완전히에 적어도 1 시간에 대 한 후드 아래 모세 혈관을 남겨 주세요.</li>
	<li>개인의 요구에 따라 충분히, 충분히 얇은 바늘의 생산을 허용 하는 매개 변수에 따라 레이저 끌어당기는 사람을 사용 하 여 바늘을 준비 합니다. 참고: 우리가 사용 하는 레이저 끌어당기는 사람 ( 재료의 표참조). 당기기를 위한 두 줄 프로그램을 사용 합니다. 첫 번째 줄 (값에 해당 하 필 라 멘 트) 최대 스캔 길이 높은 전력과 아무 당기는 힘을 사용 합니다. 매개 변수이 조합의 내부/외부 대형으로 긴 바늘의 형성을 허용 가장 낮은 확장 속도와 모 세관의 큰 부분을의 용 해를 리드 하 고 정강이 감소. 이 방법에서는, 바늘 높은 기계적인 저항 및 막힘 없이 줄기 세포 또는 바이러스 성 입자의 통과 허용 하는 넓은 내부 직경을 유지 합니다. 팁 너무 작고 긴, 필요한 기계 및 모양 특성 누락 되기 전에 속도 및 지연이 프로그램 라인의 모 세관 확장을 중지 해야 합니다. 일단 석 영 식 당기 프로그램의 두 번째 줄 자동으로 실행 됩니다 (5 s). 전원, 필 라 멘 트 및 당기는 힘의 매개 변수는 가장 짧은 가능한 팁 길이와 두 바늘 팁 파열으로의 분리를 피하고 가파른 칼 팁을 잘라 작동. 정기적으로, 우리의 장비와 우리가 사용 하 여 다음과 같은: 1 (a) = 전력 990, 필 라 멘 트 5, 속도 130, 지연 110, 풀 0; (b) 선 2 전원 970, 필 라 멘 트 3, 속도 0, 70, 지연 = 0를 당겨.</li>
	<li>이전에 70% 에탄올으로 청소 페 트리 접시에 바늘을 넣어.<ol>
<li>커버 플라스틱 파라핀 영화와 요리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마이크로-것에는 모세 혈관을 잘라.<ol>
<li>시작, 레이저 파워를 확인 하는 autocalibration 프로세스 실행 및 에너지 전달 하자. 절삭 매개 변수를 설정 합니다. 참고: 우리가 사용 하는 마이크로 것 ( 재료의 표참조) 및 다음 매개 변수: 레이저 펄스 에너지 (63 µJ), 최대 조리개의 20%의 레이저 빔 직경 (최대 조리개: 1.0 µ m), 및 최대 속도 (최대 10%의 절삭 속도 속도: 30 µ m/s).</li>
		<li>단단히 현미경 테이블에 바늘을 해결 하 고 컴퓨터 스크린의 센터에서 그것의 팁의 위치.</li>
		<li>메뉴 모음에서 연필 아이콘을 클릭 하 고 바늘의 레이저 절단에 대 한 마크를 그릴을 사용 합니다. 참고: 컷 바늘 표면에 관하여 약 45 °의 각도에서 해야 합니다.</li>
		<li>사이드 바 기능에 수 있도록 이전에 표시 된 자리를 잘라 레이저 "컷 시작" 버튼을 포함 하는 플래그를 선택 합니다.</li>
		<li>필요한 경우, 1.5.2-3;에 설명 된 절차를 반복 하 여 측면 구멍을 잘라 있다 (그림 1) 바늘 위치를 변경할 필요가 없습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>청소 잘라 후.<ol>
<li>플라스틱 튜브를 통해 무효 펌프에 바늘을 연결 합니다.</li>
		<li>펌프를 켜고 수동으로 중간 속도 (3 µ L/min)에서 앞으로 흐름 속도 설정.</li>
		<li>99% 에탄올을 발음 먼저 고 다음 증류수는 절단으로 불순물을 제거.</li>
		<li>99% 에탄올을 다시 건조를 쉽게 발음 참고: 각 단계 3 분 이상 지속 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수술 날까지 제대로 커버 페 트리 접시에 바늘을 저장 합니다.</li>
	<li>바늘을 다시 사용할 수 있습니다; 실험의 끝에, 표 백제 및 솔루션 및 가능한 조직 잔류물을 제거 하는 에탄올 청소. 더 완전 한 청소, 아래쪽을 가리키는 팁 micropipette 저장 항아리에 바늘을 넣어 팁 커버 때까지 증류수로 항아리를 작성, 어떤 남은 조직을 제거 후 에탄올으로 씻어 1.5 분 동안 끓여 야.</li>
</ol>2입니다. 절차
<ol><li>펌프 사용 설명서에서 제공 하는 지침에 따라 직경/microinjection 주사기의 볼륨에 따라 펌프를 보정 하 여 0.3 µ L/min 흐름 속도 설정 설정 메뉴를 선택 합니다.</li>
	<li>멸 균 물 10 mL 주사기 (무딘 바늘 (예를 들어, 해밀턴 바늘, 30 G)와 짧은 소계 튜브 장착)를 (후에 아주 조심 스럽게 피스톤을 제거 하는 데) microinjection 주사기와 주입을 채우기 위해 그것을 사용 하 여 수동 microinjection 펌프 (MMP)에 대 한 어셈블리 부품 키트. 참고: MMP 키트 정위 적 프레임 (그림 2)에서 바늘을 안전 하 게 마운트 하는 데 사용 됩니다. 키트 포함: 소계 튜빙, 루어 대 튜브 커플러, 피 펫 홀더 및 다른 외부 직경을 가진 펫에 대 한 가스 켓.</li>
	<li>MMP 키트에 바늘을 연결 합니다.<ol>
<li>10 mL 주사기를 통해 시스템에 걸쳐 더 많은 물을 플러시 고 물 바늘 나오는 여부를 확인 합니다. 참고: 작성 단계를 반복 하 여 시스템 내부의 모든 기포를 제거 해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Microinjection 주사기의 상단에 물 한 방울을 남겨두기 위하여 피스톤을 천천히 추진 하는 동안 microinjection 주사기에서 10 mL 주사기를 분리 합니다. Microinjection 주사기에서 피스톤을 삽입 합니다.</li>
	<li>Microinjection 주사기 펌프에 연결 하 고 0.3 µ L/분 유량을 설정 합니다. 참고: 드롭 바늘의 팁에서 유출 될 때까지 대기 하 고 가자 또 다른 3 분.</li>
	<li>0.1 µ L/min에서 흐름을 설정 하 고 수술 절차를 시작 합니다. 펌프는 수술을 수행 하는 동안 진행 해야 합니다. 참고:이 문서에서 보고 하는 실험에 대 한 우리 300 g (3 개월의 나이)의 남성 Sprague Dawley 쥐 사용 합니다. 그러나, 절차는 특히 다른 종, 마우스에 적용 됩니다.</li>
	<li>지역 규정에 의해 승인 하는 방법을 사용 하 여 전신 마 취를 유도. 참고: 우리는 마 취의 20-50 분 85 mg/kg 케 타 민 및 8 mg/kg xylazine의 복 주사 (i.p.)의 혼합을 사용합니다. 그것은 중요 한 꼬리 및 발가락 pinches 동물 진정 완벽 하 게 보장 하기 위해 사용 됩니다. 수술 시작 하 고 수술을 수행 하는 동안 10 분 마다 모니터링 하기 전에 마 취와 기본적인 생체의 수준 평가 됩니다. 중 고 물 다시 순환가 열 패드를 사용 하 여 수술 후 동물 체온 전에 일정 유지 됩니다. 동물에 게는 완전히 복구 될 때까지 모니터링 (예: 그들은 직 립 보 행). 또한, 동물 받을 진통제 (tramadol, 5-7 mg/kg i.p.) post-operatively 모든 24 시간 3 일 동안.<ol>
<li>동물의 머리를 면도 하 고 무 균 수술을 위한 외과 사이트를 적절 하 게 준비. 2 단계 스크럽 요오드 기반 솔루션 (Betadine) 70% 에탄올 다음을 수행 합니다. 또한, 무 균 상태를 유지 하려면 수술 드 레이프와 외과 사이트 랩 (비디오에서 생략 되었습니다 데모 목적을 위해).</li>
	</ol></li>
	<li>다시 난방 담요를 순환 하는 물 위에 stereotaxic 프레임에 쥐를 놓습니다. 수술의 사이트에 제공 하기 위해 추가 통증 완화, 0.5 %lidocaine 솔루션을 적용 (7 mg/kg을 초과 하지 않는). 미리 모든 수술 기구를 소독 살 균 물 또는 식 염 수와 린스 다음 immerging 장비 중 2%도 플러스 7.05% 페 놀 (Sporodicin 또는 Cidex)에 의해 비드 소독 기 또는 액체 냉 소독을 사용 하 여. 소독 절차 사이 수행 되어야 합니다. 멸 균된 메스를 사용 하 여 두개골에 경도 커트를 만드십시오. 과도 한 출혈을 방지 하려면 부드러운 수 있습니다. 편평한 주걱을 사용 하 여 두 피를 열고 뜨고 피부의 플랩에 수술 클립을 적용 합니다. 아주 부드럽게는 bregma와 두개골을 통해 바늘을 삽입 됩니다 영역을과 분리 합니다.</li>
	<li>(동안 흐름은 지속적인) 팔 stereotaxic 프레임에 탑재 고 주목 하지 팁 휴식 bregma 위에 정확히 바늘의 팁을 이동 합니다. bregma의 antero 후부 및 평점 옆 좌표에 주석을 추가 하 고 원하는 좌표에 번역. stereomicroscope에 의해 유도, 낮은 끝 거의 지는 두개골 때까지 바늘 표시 드릴링 자리 stereotaxic 팔을 약간 올리는 후.</li>
	<li>드릴 (드릴 팁 Ø: 0.8 m m, 드릴 속도: 1000 rpm) 표시 된 자리에서 두개골. 하지 드릴링 절차 동안 경질을 침투를 주의 해야 합니다. 드릴링, 하는 동안 뼈 손상과 괴 사를 방지 하려면 메 마른 염 분 드립.</li>
	<li>플라스틱 파라핀 영화의 작은 조각을 삭감 하 고 두개골에 배치. 10 µ L 피펫으로 사용 하 여 플라스틱 파라핀 영화에 삽입 하는 솔루션의 드롭을 확인 합니다. 펌프를 중지, 약간 펌프의 미는 사람을 검색 하 고 microinjection 주사기의 피스톤을 부드럽게 당겨서 작은 공기 방울이 모 세관에서 만들.</li>
	<li>낮은 정위 적 팔 때까지 바늘의 끝에 도달 하면 드롭. (아주 천천히) 어떤 거품 형성을 피하고 microinjection 주사기의 피스톤을 잡아 당겨 샘플을 그립니다. 피스톤 접촉 펌프 미 장착 하 고 단계로 진행 하기 전에 한 방울 (몇 분)의 형성까지 0.3 µ L/분 대기의 유량에 펌프를 켭니다. 참고: 현재 예제 실험에서 인공 척수 (실제)은 주입는 (AP: 1.5, ML: ±2.7; DV:-5.0) 등 해 마에 (AP:-3.5, ML: ±2.1; DV:-3.5; mm dura)에서에서 2 µ L/사이트. 두 개의 사출 방법 간의 비교를 촉진 하기 위하여 각 뇌 영역 한 반구와 26 G 무뚝뚝한 끝에 석 영 바늘 이나 다른 30 G 베벨 팁 스테인리스 바늘을 사용 하 여 주입 했다.</li>
	<li>낮은 0.1 µ L/min 흐름, 경질 스테인리스 스틸 경사 팁 바늘으로 닉 및 천천히 뇌 조직 입력 dorso 복 부 도끼에 정위 적 팔. 원하는 위치에 도달 하면 추가 0.1 m m 아래로 펌프, 0.1 m m 여 정위 적 팔을 인상 멈추고 0.3 µ L/min 흐름에 펌프 다시 시작 이동 합니다. 참고: 바늘을 낮추고 있는 동안 느린 흐름을 유지 하는 이유는 바늘 자체에 직물의 작은 파편의 침투를 방지 하는 긍정적인 압력을 보장 하기 위해. 이러한 이벤트는 팁, 솔루션의 제공을 방해 방해 것 이라고. 이후 흐름 속도가 매우 느린 약 10 s/m m는 바늘과 저하의 속도 낮추는 동안,이 바늘 트랙을 따라 남아 있는 솔루션의 금액은 무시할 대상 사이트에 삽입 하는 그에 비해 의미 합니다. 측면 구멍으로 바늘을 사용 하 여이 경고를 피할 수 있습니다.</li>
	<li>타이머를 시작 하 고 (예를 들어 6 분 40 s 2 µ L를 주입 하는 경우) 주입을 원하는 볼륨에 따라 필요한 시간 기다립니다. 주입 하는 동안 거품 움직임을 모니터링 합니다. 끝에, 펌프를 중지 하 고 천천히 바늘을 검색 하기 전에 5 분 기다립니다. 석 영 바늘 완전히 추출 펌프를 다시 시작 하 고 바늘의 끝에 한 방울의 형성에 대 한 확인.</li>
	<li>뼈 왁 스로 두개골 표면에 개통을 밀봉, hemostatic 클립을 제거 하 고 두 피를 봉합, 항생제 크림 (예를 들어, neosporin) 상처 주변 코트 그리고 홈 케이지 동물 돌아갑니다. 참고:이 문서에서 설명 하는 실험에 대 한 기관 윤리 위원회에 의해 승인 안락사 프로토콜에 따라 동물 깊이 43 mg/kg 케 타 민 및 7 mg/kg xylazine의 i.p. 주사와 마 취 고 참. 48 h를 포함 하는 파라핀 포 르 말린에 postfixed 두뇌 제거 되었다. 두뇌의 코로나 섹션 (8 µ m)는 톰을 사용 하 여 얇게 했다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kirik, D., Rosenblad, C., Bj&#246;rklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+behavioral+and+neurodegenerative+changes+following+partial+lesions+of+the+nigrostriatal+dopamine+system+induced+by+intrastriatal+6-hydroxydopamine+in+the+rat.">Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat.</a> Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).</li><li>Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eltoprazine+prevents+levodopa-induced+dyskinesias+by+reducing+striatal+glutamate+and+direct+pathway+activity.">Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity.</a> Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).</li><li>Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+pay+attention:+attentional+performance+time-stamped+prefrontal+cholinergic+activation,+diurnality,+and+performance.">Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance.</a> J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).</li><li>Shoichet, M. S., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+delivery+to+the+central+nervous+system.">Cell delivery to the central nervous system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).</li><li>Simonato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+gene+therapy+for+neurological+disorders.">Progress in gene therapy for neurological disorders.</a> Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).</li><li>Bj&#246;rklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-and+Long-Term+Consequences+of+Intracranial+Injections+of+the+Excitotoxin,+Quinolinic+Acid,+as+Evidenced+by+GFA+Immunohistochemistry+of+Astrocytes.">Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes.</a> Brain Res. 317, 267-277 (1986).</li><li>Paradiso, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+delivery+of+fibroblast+growth+factor-2+and+brain-derived+neurotrophic+factor+reduces+spontaneous+seizures+in+an+epilepsy+model.">Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).</li><li>Falcicchia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Status+Epilepticus-Induced+BDNF+Expression+with+Herpes+Simplex+Virus+Type-1+Based+Amplicon+Vectors.">Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors.</a> PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).</li><li>Munoz, J. L., Coles, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz+micropipettes+for+intracellular+voltage+microelectrodes+and+ion-selective+microelectrodes.">Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes.</a> J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+research:+reporting+in+vivo+experiments:+the+ARRIVE+guidelines.">Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).</li><li>Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+cell+therapies+to+the+clinic:+characteristics+of+cell+suspensions+in+large-diameter+injection+cannulae.">Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae.</a> Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 문서에서 설명 하는 기술은 microinjections 다양 한 목적으로12수행 되는 최적화에 대 한 소개 에 설명 된 요구 사항을 충족. 여기에 설명 된 바늘 최소, 본질적으로 감지할 수 없는 수준; 손상을 감소합니다 (구 부 경향이 있는) 유리 바늘으로 분산, 석 바늘은 딱딱한 고 깊은 좌표에도 원하는 뇌 영역의 신뢰할 수 있는 히트를 보장. 또한, 측면 구멍 팁 구멍 뇌 조직에 ?...

Microinjections는 특정 뇌 영역에 신경 활동을 조절 하 약리학 활성 화합물의 배달에 대 한 오랜 동안 사용 되어 왔습니다. 그들은 또한, 신경 이벤트 특정 질병, 예를 들면 6-hydroxy-도파민 nigrostriatal 도파민 시스템을 모방 하는 파 킨 슨 병에서의 특성을 모방 하기 위해 특정 신경 인구 근처 독 소를 주입 하 사용 되었습니다. 1 , 2 또는 병 해 시스템3변 하 immunotoxin 192 IgG saporin. 더 최근에, microinjection 절차 실험적인 뇌 장애4,5의 유전자 또는 세포 치료에 대 한 바이러스 성 벡터 또는 세포 이식 제공 하 사용 되었습니다.
이러한 연구에 사용 하는 바늘의 고전적인 유형의 스테인레스 스틸로 이루어집니다. 비록 간단 하 고 실용적인 사용을, 강철 바늘 문제6의 번호가: 그들은 비교적 큰 하 고 손상을 줄 수 있습니다 조직의 혈액-뇌 장벽의 누설 및 이다;의 활성화 또한, 그들은 심지어 완전히 원하는 솔루션의 흐름을 피 하거나 장애물을 만드는 바늘에 되 면 뇌 조직의 유선을 생산할 수 있습니다. 더 최근에, 유리 바늘 준비 임시 모세 혈관에서에 도입 되었습니다7,8을 사용. 이러한 중요 한 조직 손상도 사이토 활성화를 발생 하지 않습니다 하지만 상대적으로 유연 하 고 깊은 구조, 지역화 (개인적인 관측)의 정확도 감소에서 소개 될 때 구 부 수 있습니다.
따라서 만큼 손상 (특히 손상을 치료 하는 실험을 수행할) 때 정확성과 재현성을 증가 하면서 줄일 필요가 있다 (즉, 모든 솔루션 전달 하 고 올바른 지역화를 확인). 또한, 다양 한 형상의 뇌 영역에 주입 된 솔루션의 최적의 배포를 보장 하기 위해 다른 바늘 디자인을 사용 하는 것이 좋습니다 것입니다. 이 문서에서는, 우리는 준비 하 고 설치류 두뇌에 있는 microinjections에 대 한 석 영 바늘을 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 높은 융해 점 때문에 석 영 모 세관 기존의 끌어당기는 사람에 뽑아 수 없습니다와 따라서 사용 되지 않은 과거에 바늘을 생성 하. 그러나 석 영,, 유리, 특히 높은 강성 및 브레이크 저항9몇 가지 중요 한 이점을 제공합니다. 그들의 강성 때문에 석 영 바늘은 이상적으로 복 부 뇌 영역으로 주사에 적합 합니다. 파손을 그들의 높은 저항 때문에 그들은 여러 구멍, 복잡 한 형상의10뇌 영역을 대상으로 하는 경우에 가장 효과적인 증명할 수 있습니다. 있는 디자인을 얻기를 포함 하도록 모델링할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Quartz capillaries</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA USA</td><td>Q100-50-10</td><td>Without filament</td></tr><tr><td>Puller</td><td>Sutter</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette storage jar</td><td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>Laser microdissector</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>LMD6500</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, St&amp;Yuml;tzerbach, Germany</td><td>19138-U</td><td></td></tr><tr><td>Microinfusion pump</td><td>Univentor, Zejtun, Malta</td><td>Model 864</td><td></td></tr><tr><td>Manual microinjection pump kit</td><td>WPI</td><td>Item#: MMP-KIT</td><td>Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame</td></tr><tr><td>Precision Drill</td><td>Proxxon</td><td>28510 MicroMot 50/E</td><td>Ball bearing drive shaft with variable speed</td></tr><tr><td>Artficial Cerebral Spinal Fluid</td><td>Tocris</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel</td><td>Hamilton</td><td>26 G Blunt: 19138-U&lt;br/&gt; 30 G Bevel: 20757</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica, Germany</td><td>LEICA RM212RT</td><td></td></tr></tbody></table>

personalized needles for microinjections in the rodent brain

Microinjections 약물 또는 특정 뇌 영역 내에서 독 소의 배달에 대 한 오랜 시간 동안 사용 되었습니다 그리고 더 최근에, 그들은 유전자 또는 세포 치료 제품에 사용 되었습니다. 불행히도, 현재 microinjection 기술 사용 여러 이유로 차선은 강철 또는 유리 바늘: 특히, 철강 바늘 조직 손상이 발생할 수 있습니다 및 대상 지역 누락, 두뇌에 깊이 인하 유리 바늘 구 부 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리가 준비 하 고 유용한 기능의 번호를 결합 하는 석 영 바늘을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 바늘 감지 조직 손상 생성 하지 않는다 그리고, 깊은 좌표를 사용 하는 경우에 원하는 뇌 영역에서 신뢰할 수 있는 전달 되도록 매우 엄격한 되 고. 또한, 원하는 직경의 여러 구멍을 만들어서 바늘의 디자인 맞춤 가능 하다. 여러 구멍 큰 구멍 세포의 주입을 용이 하 게 하는 반면 더 큰 영역 내에서 솔루션의 대용량의 주입을 촉진 한다. 또한, 이러한 석 영 바늘 청소 하 고 절차 비용 효과적 되는 다시 사용 될 수 있습니다.

우리 쥐 지 마에가 두 클래식, 26 G 무뚝뚝한 끝 및 30 G 베벨 가장자리와 비교 석 바늘 (60 µ M 외부 직경 팁; 한 20 µ M 직경 옆 구멍 유형 C, 그림 1)를 사용 하 여 직접 microinjection에 의해 유도 된 손상 비교 스테인레스 스틸의 바늘 이 목표를 우리는 오른쪽에 실제의 2 µ L를 주입 하 고 얼룩이 지는 Hematoxylin 오신 (그)를 사용 하 여 조직 손상 평가 했습니다...

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Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

우리는 여기 석 바늘을 사용 하 여 쥐 두뇌에 있는 microinjection에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 바늘 하지 감지 조직 손상을 생산 하 고 깊은 지역에도 안정적인 전달. 또한, 그들은 맞춤된 설계에 의해 연구의 필요에 적응 시킬 수 있다 하 고 다시 사용 될 수 있습니다.

쥐 두뇌에 있는 Microinjections에 대 한 개인화 된 바늘

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K 조회수.  University of Ferrara. 우리는 여기 석 바늘을 사용 하 여 쥐 두뇌에 있는 microinjection에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 바늘 하지 감지 조직 손상을 생산 하 고 깊은 지역에도 안정적인 전달. 또한, 그들은 맞춤된 설계에 의해 연구의 필요에 적응 시킬 수 있다 하 고 다시 사용 될 수 있습니다.

비디오: Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

손상 3 - D 뇌 회로의 타겟팅 바이러스성을위한 확장 가능한 유체 인젝터 배열

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

연구

신경과학

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

마약, 바이러스성 벡터, 또는 세포 이식 전달 Microinjections 깊은 뇌 구조의 타겟팅

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

쥐 뇌 미세 주입은 분자 기판 동기를 행동을 연구하기 위해

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

행동분석학

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

동시 전기 생리 녹화 및 설치류의 뇌에서 억제 에이전트의 마이크로 주사

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal resolution from shallow and deep brain regions. Their use has been hindered, however, by mechanical and structural mismatches between the probes and brain tissue that commonly lead to micromotion and gliosis with resulting signal instability in chronic recording experiments. In contrast, following the implantation of ultraflexible mesh electronics via syringe injection, the mesh probes form a seamless, gliosis-free interface with the surrounding brain tissue that enables stable tracking of individual neurons on at least a year timescale. This protocol details the key steps in a typical mouse neural recording experiment using syringe-injectable mesh electronics, including the fabrication of mesh electronics in a standard photolithography-based process possible at many universities, loading mesh electronics into standard capillary needles, stereotaxic injection in vivo, connection of the mesh input/output to standard instrumentation interfaces, restrained or freely moving recording sessions, and histological sectioning of brain tissue containing mesh electronics. Representative neural recordings and histology data are presented. Investigators familiar with this protocol will have the knowledge necessary to incorporate mesh electronics into their own experiments and take advantage of the unique opportunities afforded by long-term stable neural interfacing, such as studies of aging processes, brain development, and the pathogenesis of brain disease.

Mesh electronics probes seamlessly integrate and provide stable, long-term, single-neuron level recording within the brain. This protocol uses mesh electronics for in vivo experiments, involving the fabrication of mesh electronics, loading into needles, stereotaxic injection, input/output interfacing, recording experiments, and histology of tissue containing mesh probes.

안정적인 만성 설치류 전기 생리학에 대 한 주사기-주 사용 메쉬 전자

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...

생체공학

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

로봇 미세 주입을 사용하여 뇌 조각의 단일 신경 줄기 세포 및 뉴런 조작

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Free-Hand Approach를 사용하여 마우스에서 뇌내 주사 수행

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. An intracerebroventricular (ICV) injection allows the widespread delivery of the experimental agent throughout the brain (particularly in the structures near the ventricles). Here, methods for making free-hand ICV injections in adult mice are described. By using visual and tactile landmarks on the heads of mice, injections into the lateral ventricles can be made rapidly and reliably. The injections are made with a glass syringe held in the experimenter&#39;s hand and placed at approximate distances from the landmarks. Thus, this technique does not require a stereotaxic frame. Furthermore, this technique requires only brief isoflurane anesthesia, which permits the subsequent assessment of mouse behavior and/or physiology in awake, freely behaving mice. Free-hand ICV injection is a powerful tool for the efficient delivery of experimental agents into the brains of living mice and can be combined with other techniques such as frequent blood sampling, neural circuit manipulation, or in vivo recording to investigate neuroendocrine processes.

저자 스포트라이트: 생식 신경 조절의 통찰력, 혁신 및 미래 방안 

Here, a simple and rapid approach for performing intracerebroventricular injections in mice using a free-hand approach (that is, without a stereotaxic device) is described.

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. ...

쥐 두뇌에 있는 Microinjections에 대 한 개인화 된 바늘

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마약, 바이러스성 벡터, 또는 세포 이식 전달 Microinjections 깊은 뇌 구조의 타겟팅

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동시 전기 생리 녹화 및 설치류의 뇌에서 억제 에이전트의 마이크로 주사

안정적인 만성 설치류 전기 생리학에 대 한 주사기-주 사용 메쉬 전자

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Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice