이 작품은 유럽 공동체 [FP7-사람-2011-IAPP 프로젝트 285827 (EPIXCHANGE)]에서 교부 금에 의해 지원 되었습니다.

모든 실험 프로토콜은 동물 실험에 대 한 페라라 대학 윤리 위원회 및 건강의 이탈리아 정부에 의해 승인 되었다. 도착 (동물 연구: Vivo 실험에서 보고11) 지침에 따라 되었습니다.
1입니다. 석 영 바늘의 준비
<ol><li>깨끗 하 고 증류수에 5 분, 에탄올 99%, 5 분 및 5 분 diethyl-에테르에서 그들을 배치 하 여 석 영 모 세관 ( 재료의 표참조)을 소독.</li>
	<li>그들이 말리 면 완전히에 적어도 1 시간에 대 한 후드 아래 모세 혈관을 남겨 주세요.</li>
	<li>개인의 요구에 따라 충분히, 충분히 얇은 바늘의 생산을 허용 하는 매개 변수에 따라 레이저 끌어당기는 사람을 사용 하 여 바늘을 준비 합니다. 참고: 우리가 사용 하는 레이저 끌어당기는 사람 ( 재료의 표참조). 당기기를 위한 두 줄 프로그램을 사용 합니다. 첫 번째 줄 (값에 해당 하 필 라 멘 트) 최대 스캔 길이 높은 전력과 아무 당기는 힘을 사용 합니다. 매개 변수이 조합의 내부/외부 대형으로 긴 바늘의 형성을 허용 가장 낮은 확장 속도와 모 세관의 큰 부분을의 용 해를 리드 하 고 정강이 감소. 이 방법에서는, 바늘 높은 기계적인 저항 및 막힘 없이 줄기 세포 또는 바이러스 성 입자의 통과 허용 하는 넓은 내부 직경을 유지 합니다. 팁 너무 작고 긴, 필요한 기계 및 모양 특성 누락 되기 전에 속도 및 지연이 프로그램 라인의 모 세관 확장을 중지 해야 합니다. 일단 석 영 식 당기 프로그램의 두 번째 줄 자동으로 실행 됩니다 (5 s). 전원, 필 라 멘 트 및 당기는 힘의 매개 변수는 가장 짧은 가능한 팁 길이와 두 바늘 팁 파열으로의 분리를 피하고 가파른 칼 팁을 잘라 작동. 정기적으로, 우리의 장비와 우리가 사용 하 여 다음과 같은: 1 (a) = 전력 990, 필 라 멘 트 5, 속도 130, 지연 110, 풀 0; (b) 선 2 전원 970, 필 라 멘 트 3, 속도 0, 70, 지연 = 0를 당겨.</li>
	<li>이전에 70% 에탄올으로 청소 페 트리 접시에 바늘을 넣어.<ol>
<li>커버 플라스틱 파라핀 영화와 요리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마이크로-것에는 모세 혈관을 잘라.<ol>
<li>시작, 레이저 파워를 확인 하는 autocalibration 프로세스 실행 및 에너지 전달 하자. 절삭 매개 변수를 설정 합니다. 참고: 우리가 사용 하는 마이크로 것 ( 재료의 표참조) 및 다음 매개 변수: 레이저 펄스 에너지 (63 µJ), 최대 조리개의 20%의 레이저 빔 직경 (최대 조리개: 1.0 µ m), 및 최대 속도 (최대 10%의 절삭 속도 속도: 30 µ m/s).</li>
		<li>단단히 현미경 테이블에 바늘을 해결 하 고 컴퓨터 스크린의 센터에서 그것의 팁의 위치.</li>
		<li>메뉴 모음에서 연필 아이콘을 클릭 하 고 바늘의 레이저 절단에 대 한 마크를 그릴을 사용 합니다. 참고: 컷 바늘 표면에 관하여 약 45 °의 각도에서 해야 합니다.</li>
		<li>사이드 바 기능에 수 있도록 이전에 표시 된 자리를 잘라 레이저 "컷 시작" 버튼을 포함 하는 플래그를 선택 합니다.</li>
		<li>필요한 경우, 1.5.2-3;에 설명 된 절차를 반복 하 여 측면 구멍을 잘라 있다 (그림 1) 바늘 위치를 변경할 필요가 없습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>청소 잘라 후.<ol>
<li>플라스틱 튜브를 통해 무효 펌프에 바늘을 연결 합니다.</li>
		<li>펌프를 켜고 수동으로 중간 속도 (3 µ L/min)에서 앞으로 흐름 속도 설정.</li>
		<li>99% 에탄올을 발음 먼저 고 다음 증류수는 절단으로 불순물을 제거.</li>
		<li>99% 에탄올을 다시 건조를 쉽게 발음 참고: 각 단계 3 분 이상 지속 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수술 날까지 제대로 커버 페 트리 접시에 바늘을 저장 합니다.</li>
	<li>바늘을 다시 사용할 수 있습니다; 실험의 끝에, 표 백제 및 솔루션 및 가능한 조직 잔류물을 제거 하는 에탄올 청소. 더 완전 한 청소, 아래쪽을 가리키는 팁 micropipette 저장 항아리에 바늘을 넣어 팁 커버 때까지 증류수로 항아리를 작성, 어떤 남은 조직을 제거 후 에탄올으로 씻어 1.5 분 동안 끓여 야.</li>
</ol>2입니다. 절차
<ol><li>펌프 사용 설명서에서 제공 하는 지침에 따라 직경/microinjection 주사기의 볼륨에 따라 펌프를 보정 하 여 0.3 µ L/min 흐름 속도 설정 설정 메뉴를 선택 합니다.</li>
	<li>멸 균 물 10 mL 주사기 (무딘 바늘 (예를 들어, 해밀턴 바늘, 30 G)와 짧은 소계 튜브 장착)를 (후에 아주 조심 스럽게 피스톤을 제거 하는 데) microinjection 주사기와 주입을 채우기 위해 그것을 사용 하 여 수동 microinjection 펌프 (MMP)에 대 한 어셈블리 부품 키트. 참고: MMP 키트 정위 적 프레임 (그림 2)에서 바늘을 안전 하 게 마운트 하는 데 사용 됩니다. 키트 포함: 소계 튜빙, 루어 대 튜브 커플러, 피 펫 홀더 및 다른 외부 직경을 가진 펫에 대 한 가스 켓.</li>
	<li>MMP 키트에 바늘을 연결 합니다.<ol>
<li>10 mL 주사기를 통해 시스템에 걸쳐 더 많은 물을 플러시 고 물 바늘 나오는 여부를 확인 합니다. 참고: 작성 단계를 반복 하 여 시스템 내부의 모든 기포를 제거 해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Microinjection 주사기의 상단에 물 한 방울을 남겨두기 위하여 피스톤을 천천히 추진 하는 동안 microinjection 주사기에서 10 mL 주사기를 분리 합니다. Microinjection 주사기에서 피스톤을 삽입 합니다.</li>
	<li>Microinjection 주사기 펌프에 연결 하 고 0.3 µ L/분 유량을 설정 합니다. 참고: 드롭 바늘의 팁에서 유출 될 때까지 대기 하 고 가자 또 다른 3 분.</li>
	<li>0.1 µ L/min에서 흐름을 설정 하 고 수술 절차를 시작 합니다. 펌프는 수술을 수행 하는 동안 진행 해야 합니다. 참고:이 문서에서 보고 하는 실험에 대 한 우리 300 g (3 개월의 나이)의 남성 Sprague Dawley 쥐 사용 합니다. 그러나, 절차는 특히 다른 종, 마우스에 적용 됩니다.</li>
	<li>지역 규정에 의해 승인 하는 방법을 사용 하 여 전신 마 취를 유도. 참고: 우리는 마 취의 20-50 분 85 mg/kg 케 타 민 및 8 mg/kg xylazine의 복 주사 (i.p.)의 혼합을 사용합니다. 그것은 중요 한 꼬리 및 발가락 pinches 동물 진정 완벽 하 게 보장 하기 위해 사용 됩니다. 수술 시작 하 고 수술을 수행 하는 동안 10 분 마다 모니터링 하기 전에 마 취와 기본적인 생체의 수준 평가 됩니다. 중 고 물 다시 순환가 열 패드를 사용 하 여 수술 후 동물 체온 전에 일정 유지 됩니다. 동물에 게는 완전히 복구 될 때까지 모니터링 (예: 그들은 직 립 보 행). 또한, 동물 받을 진통제 (tramadol, 5-7 mg/kg i.p.) post-operatively 모든 24 시간 3 일 동안.<ol>
<li>동물의 머리를 면도 하 고 무 균 수술을 위한 외과 사이트를 적절 하 게 준비. 2 단계 스크럽 요오드 기반 솔루션 (Betadine) 70% 에탄올 다음을 수행 합니다. 또한, 무 균 상태를 유지 하려면 수술 드 레이프와 외과 사이트 랩 (비디오에서 생략 되었습니다 데모 목적을 위해).</li>
	</ol></li>
	<li>다시 난방 담요를 순환 하는 물 위에 stereotaxic 프레임에 쥐를 놓습니다. 수술의 사이트에 제공 하기 위해 추가 통증 완화, 0.5 %lidocaine 솔루션을 적용 (7 mg/kg을 초과 하지 않는). 미리 모든 수술 기구를 소독 살 균 물 또는 식 염 수와 린스 다음 immerging 장비 중 2%도 플러스 7.05% 페 놀 (Sporodicin 또는 Cidex)에 의해 비드 소독 기 또는 액체 냉 소독을 사용 하 여. 소독 절차 사이 수행 되어야 합니다. 멸 균된 메스를 사용 하 여 두개골에 경도 커트를 만드십시오. 과도 한 출혈을 방지 하려면 부드러운 수 있습니다. 편평한 주걱을 사용 하 여 두 피를 열고 뜨고 피부의 플랩에 수술 클립을 적용 합니다. 아주 부드럽게는 bregma와 두개골을 통해 바늘을 삽입 됩니다 영역을과 분리 합니다.</li>
	<li>(동안 흐름은 지속적인) 팔 stereotaxic 프레임에 탑재 고 주목 하지 팁 휴식 bregma 위에 정확히 바늘의 팁을 이동 합니다. bregma의 antero 후부 및 평점 옆 좌표에 주석을 추가 하 고 원하는 좌표에 번역. stereomicroscope에 의해 유도, 낮은 끝 거의 지는 두개골 때까지 바늘 표시 드릴링 자리 stereotaxic 팔을 약간 올리는 후.</li>
	<li>드릴 (드릴 팁 Ø: 0.8 m m, 드릴 속도: 1000 rpm) 표시 된 자리에서 두개골. 하지 드릴링 절차 동안 경질을 침투를 주의 해야 합니다. 드릴링, 하는 동안 뼈 손상과 괴 사를 방지 하려면 메 마른 염 분 드립.</li>
	<li>플라스틱 파라핀 영화의 작은 조각을 삭감 하 고 두개골에 배치. 10 µ L 피펫으로 사용 하 여 플라스틱 파라핀 영화에 삽입 하는 솔루션의 드롭을 확인 합니다. 펌프를 중지, 약간 펌프의 미는 사람을 검색 하 고 microinjection 주사기의 피스톤을 부드럽게 당겨서 작은 공기 방울이 모 세관에서 만들.</li>
	<li>낮은 정위 적 팔 때까지 바늘의 끝에 도달 하면 드롭. (아주 천천히) 어떤 거품 형성을 피하고 microinjection 주사기의 피스톤을 잡아 당겨 샘플을 그립니다. 피스톤 접촉 펌프 미 장착 하 고 단계로 진행 하기 전에 한 방울 (몇 분)의 형성까지 0.3 µ L/분 대기의 유량에 펌프를 켭니다. 참고: 현재 예제 실험에서 인공 척수 (실제)은 주입는 (AP: 1.5, ML: ±2.7; DV:-5.0) 등 해 마에 (AP:-3.5, ML: ±2.1; DV:-3.5; mm dura)에서에서 2 µ L/사이트. 두 개의 사출 방법 간의 비교를 촉진 하기 위하여 각 뇌 영역 한 반구와 26 G 무뚝뚝한 끝에 석 영 바늘 이나 다른 30 G 베벨 팁 스테인리스 바늘을 사용 하 여 주입 했다.</li>
	<li>낮은 0.1 µ L/min 흐름, 경질 스테인리스 스틸 경사 팁 바늘으로 닉 및 천천히 뇌 조직 입력 dorso 복 부 도끼에 정위 적 팔. 원하는 위치에 도달 하면 추가 0.1 m m 아래로 펌프, 0.1 m m 여 정위 적 팔을 인상 멈추고 0.3 µ L/min 흐름에 펌프 다시 시작 이동 합니다. 참고: 바늘을 낮추고 있는 동안 느린 흐름을 유지 하는 이유는 바늘 자체에 직물의 작은 파편의 침투를 방지 하는 긍정적인 압력을 보장 하기 위해. 이러한 이벤트는 팁, 솔루션의 제공을 방해 방해 것 이라고. 이후 흐름 속도가 매우 느린 약 10 s/m m는 바늘과 저하의 속도 낮추는 동안,이 바늘 트랙을 따라 남아 있는 솔루션의 금액은 무시할 대상 사이트에 삽입 하는 그에 비해 의미 합니다. 측면 구멍으로 바늘을 사용 하 여이 경고를 피할 수 있습니다.</li>
	<li>타이머를 시작 하 고 (예를 들어 6 분 40 s 2 µ L를 주입 하는 경우) 주입을 원하는 볼륨에 따라 필요한 시간 기다립니다. 주입 하는 동안 거품 움직임을 모니터링 합니다. 끝에, 펌프를 중지 하 고 천천히 바늘을 검색 하기 전에 5 분 기다립니다. 석 영 바늘 완전히 추출 펌프를 다시 시작 하 고 바늘의 끝에 한 방울의 형성에 대 한 확인.</li>
	<li>뼈 왁 스로 두개골 표면에 개통을 밀봉, hemostatic 클립을 제거 하 고 두 피를 봉합, 항생제 크림 (예를 들어, neosporin) 상처 주변 코트 그리고 홈 케이지 동물 돌아갑니다. 참고:이 문서에서 설명 하는 실험에 대 한 기관 윤리 위원회에 의해 승인 안락사 프로토콜에 따라 동물 깊이 43 mg/kg 케 타 민 및 7 mg/kg xylazine의 i.p. 주사와 마 취 고 참. 48 h를 포함 하는 파라핀 포 르 말린에 postfixed 두뇌 제거 되었다. 두뇌의 코로나 섹션 (8 µ m)는 톰을 사용 하 여 얇게 했다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kirik, D., Rosenblad, C., Bj&#246;rklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+behavioral+and+neurodegenerative+changes+following+partial+lesions+of+the+nigrostriatal+dopamine+system+induced+by+intrastriatal+6-hydroxydopamine+in+the+rat.">Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat.</a> Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).</li><li>Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eltoprazine+prevents+levodopa-induced+dyskinesias+by+reducing+striatal+glutamate+and+direct+pathway+activity.">Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity.</a> Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).</li><li>Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+pay+attention:+attentional+performance+time-stamped+prefrontal+cholinergic+activation,+diurnality,+and+performance.">Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance.</a> J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).</li><li>Shoichet, M. S., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+delivery+to+the+central+nervous+system.">Cell delivery to the central nervous system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).</li><li>Simonato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+gene+therapy+for+neurological+disorders.">Progress in gene therapy for neurological disorders.</a> Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).</li><li>Bj&#246;rklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-and+Long-Term+Consequences+of+Intracranial+Injections+of+the+Excitotoxin,+Quinolinic+Acid,+as+Evidenced+by+GFA+Immunohistochemistry+of+Astrocytes.">Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes.</a> Brain Res. 317, 267-277 (1986).</li><li>Paradiso, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+delivery+of+fibroblast+growth+factor-2+and+brain-derived+neurotrophic+factor+reduces+spontaneous+seizures+in+an+epilepsy+model.">Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).</li><li>Falcicchia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Status+Epilepticus-Induced+BDNF+Expression+with+Herpes+Simplex+Virus+Type-1+Based+Amplicon+Vectors.">Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors.</a> PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).</li><li>Munoz, J. L., Coles, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz+micropipettes+for+intracellular+voltage+microelectrodes+and+ion-selective+microelectrodes.">Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes.</a> J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+research:+reporting+in+vivo+experiments:+the+ARRIVE+guidelines.">Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).</li><li>Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+cell+therapies+to+the+clinic:+characteristics+of+cell+suspensions+in+large-diameter+injection+cannulae.">Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae.</a> Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 문서에서 설명 하는 기술은 microinjections 다양 한 목적으로12수행 되는 최적화에 대 한 소개 에 설명 된 요구 사항을 충족. 여기에 설명 된 바늘 최소, 본질적으로 감지할 수 없는 수준; 손상을 감소합니다 (구 부 경향이 있는) 유리 바늘으로 분산, 석 바늘은 딱딱한 고 깊은 좌표에도 원하는 뇌 영역의 신뢰할 수 있는 히트를 보장. 또한, 측면 구멍 팁 구멍 뇌 조직에 ?...

Microinjections는 특정 뇌 영역에 신경 활동을 조절 하 약리학 활성 화합물의 배달에 대 한 오랜 동안 사용 되어 왔습니다. 그들은 또한, 신경 이벤트 특정 질병, 예를 들면 6-hydroxy-도파민 nigrostriatal 도파민 시스템을 모방 하는 파 킨 슨 병에서의 특성을 모방 하기 위해 특정 신경 인구 근처 독 소를 주입 하 사용 되었습니다. 1 , 2 또는 병 해 시스템3변 하 immunotoxin 192 IgG saporin. 더 최근에, microinjection 절차 실험적인 뇌 장애4,5의 유전자 또는 세포 치료에 대 한 바이러스 성 벡터 또는 세포 이식 제공 하 사용 되었습니다.
이러한 연구에 사용 하는 바늘의 고전적인 유형의 스테인레스 스틸로 이루어집니다. 비록 간단 하 고 실용적인 사용을, 강철 바늘 문제6의 번호가: 그들은 비교적 큰 하 고 손상을 줄 수 있습니다 조직의 혈액-뇌 장벽의 누설 및 이다;의 활성화 또한, 그들은 심지어 완전히 원하는 솔루션의 흐름을 피 하거나 장애물을 만드는 바늘에 되 면 뇌 조직의 유선을 생산할 수 있습니다. 더 최근에, 유리 바늘 준비 임시 모세 혈관에서에 도입 되었습니다7,8을 사용. 이러한 중요 한 조직 손상도 사이토 활성화를 발생 하지 않습니다 하지만 상대적으로 유연 하 고 깊은 구조, 지역화 (개인적인 관측)의 정확도 감소에서 소개 될 때 구 부 수 있습니다.
따라서 만큼 손상 (특히 손상을 치료 하는 실험을 수행할) 때 정확성과 재현성을 증가 하면서 줄일 필요가 있다 (즉, 모든 솔루션 전달 하 고 올바른 지역화를 확인). 또한, 다양 한 형상의 뇌 영역에 주입 된 솔루션의 최적의 배포를 보장 하기 위해 다른 바늘 디자인을 사용 하는 것이 좋습니다 것입니다. 이 문서에서는, 우리는 준비 하 고 설치류 두뇌에 있는 microinjections에 대 한 석 영 바늘을 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 높은 융해 점 때문에 석 영 모 세관 기존의 끌어당기는 사람에 뽑아 수 없습니다와 따라서 사용 되지 않은 과거에 바늘을 생성 하. 그러나 석 영,, 유리, 특히 높은 강성 및 브레이크 저항9몇 가지 중요 한 이점을 제공합니다. 그들의 강성 때문에 석 영 바늘은 이상적으로 복 부 뇌 영역으로 주사에 적합 합니다. 파손을 그들의 높은 저항 때문에 그들은 여러 구멍, 복잡 한 형상의10뇌 영역을 대상으로 하는 경우에 가장 효과적인 증명할 수 있습니다. 있는 디자인을 얻기를 포함 하도록 모델링할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Quartz capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA USA</td>
			<td>Q100-50-10</td>
			<td>Without filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette storage jar</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>E210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser microdissector</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, St&#376;tzerbach, Germany</td>
			<td>19138-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinfusion pump</td>
			<td>Univentor, Zejtun, Malta</td>
			<td>Model 864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual microinjection pump kit</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Item#: MMP-KIT</td>
			<td>Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Drill</td>
			<td>Proxxon</td>
			<td>28510 MicroMot 50/E</td>
			<td>Ball bearing drive shaft with variable speed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artficial Cerebral Spinal Fluid</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>26 G Blunt: 19138-U 
			30 G Bevel: 20757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>LEICA RM212RT</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

personalized needles for microinjections in the rodent brain

Microinjections 약물 또는 특정 뇌 영역 내에서 독 소의 배달에 대 한 오랜 시간 동안 사용 되었습니다 그리고 더 최근에, 그들은 유전자 또는 세포 치료 제품에 사용 되었습니다. 불행히도, 현재 microinjection 기술 사용 여러 이유로 차선은 강철 또는 유리 바늘: 특히, 철강 바늘 조직 손상이 발생할 수 있습니다 및 대상 지역 누락, 두뇌에 깊이 인하 유리 바늘 구 부 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리가 준비 하 고 유용한 기능의 번호를 결합 하는 석 영 바늘을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 바늘 감지 조직 손상 생성 하지 않는다 그리고, 깊은 좌표를 사용 하는 경우에 원하는 뇌 영역에서 신뢰할 수 있는 전달 되도록 매우 엄격한 되 고. 또한, 원하는 직경의 여러 구멍을 만들어서 바늘의 디자인 맞춤 가능 하다. 여러 구멍 큰 구멍 세포의 주입을 용이 하 게 하는 반면 더 큰 영역 내에서 솔루션의 대용량의 주입을 촉진 한다. 또한, 이러한 석 영 바늘 청소 하 고 절차 비용 효과적 되는 다시 사용 될 수 있습니다.

우리 쥐 지 마에가 두 클래식, 26 G 무뚝뚝한 끝 및 30 G 베벨 가장자리와 비교 석 바늘 (60 µ M 외부 직경 팁; 한 20 µ M 직경 옆 구멍 유형 C, 그림 1)를 사용 하 여 직접 microinjection에 의해 유도 된 손상 비교 스테인레스 스틸의 바늘 이 목표를 우리는 오른쪽에 실제의 2 µ L를 주입 하 고 얼룩이 지는 Hematoxylin 오신 (그)를 사용 하 여 조직 손상 평가 했습니다...

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Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

우리는 여기 석 바늘을 사용 하 여 쥐 두뇌에 있는 microinjection에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 바늘 하지 감지 조직 손상을 생산 하 고 깊은 지역에도 안정적인 전달. 또한, 그들은 맞춤된 설계에 의해 연구의 필요에 적응 시킬 수 있다 하 고 다시 사용 될 수 있습니다.

쥐 두뇌에 있는 Microinjections에 대 한 개인화 된 바늘

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

personalized-needles-for-microinjections-in-the-rodent-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.1K 조회수.  University of Ferrara. 우리는 여기 석 바늘을 사용 하 여 쥐 두뇌에 있는 microinjection에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 바늘 하지 감지 조직 손상을 생산 하 고 깊은 지역에도 안정적인 전달. 또한, 그들은 맞춤된 설계에 의해 연구의 필요에 적응 시킬 수 있다 하 고 다시 사용 될 수 있습니다.

비디오: Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in which functional MRI data and in vivo intracortical recording can be performed simultaneously. The combination of MRI and electrical recording is technically challenging because the electrodes used for recording distort the MRI images and the MRI acquisition induces noise in the electrical recording. To minimize the mutual interference of the two modalities, glass microelectrodes were used rather than metal and a noise removal algorithm was implemented for the electrophysiology data. In our studies, two microelectrodes were separately implanted in bilateral primary somatosensory cortices (SI) of the rat and fixed in place. One coronal slice covering the electrode tips was selected for functional MRI. Electrode shafts and fixation positions were not included in the image slice to avoid imaging artifacts. The removed scalp was replaced with toothpaste to reduce susceptibility mismatch and prevent Gibbs ringing artifacts in the images. The artifact structure induced in the electrical recordings by the rapidly-switching magnetic fields during image acquisition was characterized by averaging all cycles of scans for each run. The noise structure during imaging was then subtracted from original recordings. The denoised time courses were then used for further analysis in combination with the fMRI data. As an example, the simultaneous acquisition was used to determine the relationship between spontaneous fMRI BOLD signals and band-limited intracortical electrical activity. Simultaneous fMRI and electrophysiological recording in the rodent will provide a platform for many exciting applications in neuroscience in addition to elucidating the relationship between the fMRI BOLD signal and neuronal activity.

We have developed a method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and electrophysiological recording in the rodent brain, providing a platform for the investigation of the relationship between neural activity and the blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signal.

쥐 두뇌에 동시 fMRI와 전기 생리학

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

연구

신경과학

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain proper, that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis. The tissue harvested is suitable for biochemical and physiological analysis, and the MAV has been shown to be sensitive to damage produced by amphetamine and hyperthermia 1,2. As well, the major and minor cerebral vasculatures harvested in MAV are of potentially high interest when investigating concussive types of head trauma. The MAV dissected in this presentation consists of the pial and some of the arachnoid membrane (less dura) of the meninges and the major and minor cerebral surface vasculature. The choroid plexus dissected is the structure that resides in the lateral ventricles as described by Oldfield and McKinley3,4,5,6. The methods used for harvesting these two tissues also facilitate the harvesting of regional cortical tissue devoid of meninges and larger cerebral surface vasculature, and is compatible with harvesting other brain tissues such as striatum, hypothalamus, hippocampus, etc. The dissection of the two tissues takes from 5 to 10 min total. The gene expression levels for the dissected MAV and choroid plexus, as shown and described in this presentation can be found at GSE23093 (MAV) and GSE29733 (choroid plexus) at the NCBI GEO repository. This data has been, and is being, used to help further understand the functioning of the MAV and choroid plexus and how neurotoxic events such as severe hyperthermia and AMPH adversely affect their function.

This video presentation shows a method of harvesting the two most important highly vascular structures that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis.

쥐의 뇌에서 뇌 표면 Vasculature 및 관련 Meninges의 해부 및 맥락막 얼기의 시각적 설명

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

성인 쥐의 뇌의 기존 및 비 인습적 인 지역에서 신경 줄기 세포 성장

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

가압된 설치류에 폭발을 이용한 Neurotrauma의 효과 중간 대뇌 동맥

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Translational Brain Mapping at the University of Rochester Medical Center: Preserving the Mind Through Personalized Brain Mapping

The Translational Brain Mapping Program at the University of Rochester is an interdisciplinary effort that integrates cognitive science, neurophysiology, neuroanesthesia, and neurosurgery. Patients who have tumors or epileptogenic tissue in eloquent brain areas are studied preoperatively with functional and structural MRI, and intraoperatively with direct electrical stimulation mapping. Post-operative neural and cognitive outcome measures fuel basic science studies about the factors that mediate good versus poor outcome after surgery, and how brain mapping can be further optimized to ensure the best outcome for future patients. In this article, we describe the interdisciplinary workflow that allows our team to meet the synergistic goals of optimizing patient outcome and advancing scientific understanding of the human brain.

This article provides an overview of a multi-modal brain mapping program designed to identify regions of the brain that support critical cognitive functions in individual neurosurgery patients.

로체스터 대학 의료 센터의 번역 뇌 매핑: 개인화된 뇌 매핑을 통해 마음 보존

The Translational Brain Mapping Program at the University of Rochester is an interdisciplinary effort that integrates cognitive science, neurophysiology, ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

근 적외선 형광 및 고 분해능 주사를 사용 하 여 설치류 뇌의 단백질 발현 측정

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases in ubiquitin-proteasome activity are critical for synaptic plasticity and memory formation and aberrant changes in this system are associated with a variety of neurological, neurodegenerative and psychiatric disorders. One of the issues in studying ubiquitin-proteasome functioning in the brain is that it is present in all cellular compartments, in which the protein targets, functional role and mechanisms of regulation can vary widely. As a result, the ability to directly compare brain ubiquitin protein targeting and proteasome catalytic activity in different subcellular compartments within the same animal is critical for fully understanding how the UPS contributes to synaptic plasticity, memory and disease. The method described here allows collection of nuclear, cytoplasmic and crude synaptic fractions from the same rodent (rat) brain, followed by simultaneous quantification of proteasome catalytic activity (indirectly, providing activity of the proteasome core only) and linkage-specific ubiquitin protein tagging. Thus, the method can be used to directly compare subcellular changes in ubiquitin-proteasome activity in different brain regions in the same animal during synaptic plasticity, memory formation and different disease states. This method can also be used to assess the subcellular distribution and function of other proteins within the same animal.

This protocol is designed to efficiently quantify ubiquitin-proteasome system (UPS) activity in different cellular compartments of the rodent brain. Users are able to examine UPS functioning in nuclear, cytoplasmic and synaptic fractions in the same animal, reducing the amount of time and number of animals needed to perform these complex analyses.

설치류 뇌의 세포외 유비퀴틴-프로테아솜 활동 정량화

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...