ESB erkennt Finanzierung durch New Innovator des NIH Director Award (DP2 OD002002-01), NIH Challenge Grant 1RC1MH088182-01, NIH Große Chancen Stipendium 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, NSF (0835878 und 0848804), die McGovern Institute Neurotechnologie Award Program , dem Department of Defense, NARSAD, die Alfred P. Sloan Foundation, Jerry und Marge Burnett, der SFN-Forschungspreis für Innovation in Neuroscience, dem MIT Media Lab, der Benesse Stiftung und der Wallace H. Coulter Foundation.

1. Der Bau Stereotaktische Clamp <ol><li> Die stereotaktische Klammer zur Befestigung der Injektor-Array mit dem stereotax verwendet, so dass die Injektoren parallel zur stereotaktischen Arm sind. </li><li> Jedes Labor muss nur eine Klammer, es sei denn, es wird erwartet, dass mehr als eine Operation kann gleichzeitig stattfinden. In diesem Fall machen die gleiche Nummer wie die zu erwartende maximale Anzahl der gleichzeitigen Operationen. Es könnte auch ratsam, eine zusätzliche machen, im Falle von Schäden an der ersten. </li><li> Um die stereotaktische Klemme, erstens, ist ein 1,5 mm Außendurchmesser (OD) Stahlkanüle bis 2 cm in der Länge geschnitten, und eines der Enden nach unten, bis flach Dremeled. </li><li> Als nächstes wird ein kleines Stück (ca. 0,5 x 0,5 cm) aus PCB proto-board geschnitten, um als Abstandshalter verwendet werden. </li><li> Mit Hilfe eines Laser-Cutter, um sicherzustellen, dass alle Schnitte senkrecht zur Oberfläche des Materials, sind zwei identische Rechtecke (2.1 &quot;x 3 / 8&quot;) von 1 / 8 &quot;Acryl Folien, jedes Rechteck mit zwei kreisrunde Löcher in Schnitt gegenüberliegenden Ecken des Rechtecks. Das erste Loch hat einen Durchmesser 1,5 mm, und ist gerade groß genug, um die Metallkanüle festhalten. Das zweite Loch hat einen Durchmesser 1 / 16 &quot;(Abbildung 1C). </li><li> Die Metall-Kanüle wird in die 1,5 mm Loch von einem Rechteck eingefügt, dann durch die 1,5 mm Bohrung des zweiten. Das untere Ende der Kanüle ist mit der Unterseite des unteren Rechtecks ​​ausgerichtet und bildet die Form eines Hockey-Schläger. </li><li> Halten Sie die Abstandhalter fest zwischen die beiden Rechtecke statt, ist diese Struktur zusammen mit Heißkleber rund um die Kanüle und 1,5 mm Löcher zementiert, wobei darauf zu vermeiden, kleben Sie den Abstandhalter an den Rechtecken. Knetmasse kann hilfreich sein, Dinge zusammen zu halten während dieses Prozesses. </li><li> Nachdem der Leim getrocknet ist, ist ein 1-72 Schraube in den 1 / 16 Loch von der Oberseite der Rechtecke eingefügt. Dann wird eine 1-72 Sechskantmutter wird auf das Ende der 1-72 Schraube eingedreht und festgezogen. Die Schraube und Mutter dazu dienen, die Klammer zusammenhalten. </li><li> Zur Befestigung der Sechskantmutter an der Unterseite des unteren Rechtecks, kleine Mengen von 5-Minuten-Epoxy sind um den Rand der Sechskantmutter gesunken, ohne dass das Epoxidharz in das Gewinde der hex Mutter oder Schraube zu bekommen. Jede Modelliermasse wird entfernt, und es wird bestätigt, dass der Abstandhalter fest an seinem Platz kann durch Anziehen der Schraube gehalten werden. </li></ol> 2. Vorbereiten des Systems für die individuelle Injektor Array: Hamilton Pumpe und stereotax <ol><li> Der Injektor-Array-System kann an nahezu jedem Satz von Koordinaten in das Gehirn angepasst werden. </li><li> Der Benutzer zuerst lokalisiert Koordinaten des gewünschten Injektionsstellen in eine Maus (oder andere Arten) Hirnatlas, die Umstellung auf den entsprechenden Koordinaten der stereotax verwendet (hier X-, Y-und Z-Koordinaten). Die Zahl der Injektionsstellen (drei in den Figuren 1A und 1B) wird im Folgenden als k sein. </li><li> k-Zahl von 10 ul Hamilton Spritzen sind in einer Injektion / Entnahme Spritzenpumpe wie diese von der Harvard Gerät gestellt. </li><li> Next, 3-Fuß-lange Stücke aus Polyethylen-Schlauch fest mit der Nadel eines jeden Hamilton-Spritze befestigt. </li><li> Für jedes Stück aus Polyethylen-Schlauch, eine F-252-Schlauch Manschette aus Upchurch Scientific ist über das offene Ende geschoben und an eine P-627 Schlauchadapter mit der mitgelieferten Mutter und Ferrule, auch von Upchurch Scientific. </li></ol> 3. Die Konstruktion der Customized Injector Array <ol><li> Jeder Injektor Array wird der Satz von Koordinaten, die der Benutzer angepasst werden. Doch für Sätze von Koordinaten, die nur durch eine Übersetzung und / oder Rotation unterscheiden, kann die gleiche Düse Array verwendet werden. </li><li> Betrachtet man nur die relative X-und Y-Koordinaten der Injektionsstelle, sind k Löcher in eine PCB proto-board mit einer Dicke von 1 / 32 gebohrt &quot;, mit dem gleichen Abstand zueinander. Diese Bohrlöcher werden mit einem Modela Mini-Mühle und eine 0,011&quot; Durchmesser Bohrer von der McMaster-Carr. Achten Sie darauf, eine langsame Bohren (Z-Geschwindigkeit) nutzen, um zu vermeiden brechen oder Verschleiß des Bohrers. Vor dem Entfernen der Karte aus der Mühle, ist ein Rechteck um die kleinen Löcher gebohrt, mit einem größeren Bohrer mit einem Durchmesser von 1 / 32 &quot;, zu vermeiden, tragen die kleineren Code für die Mini-Mühle erzeugt wird, kann leicht mit Hilfe von MATLAB werden;. Probe Code ist in den folgenden Dateien zur Verfügung gestellt. <ol class="lroman"><li> generate.m - MATLAB-Code zur Erzeugung Modela Code gewünschten Koordinaten </li><li> holes_ex.rml - Modela Code für das Bohren Ruftonmuster (acht Löcher) in Proto-Board </li><li> outline_ex.rml - Modela Code für das Bohren Rechteck um Löcher </li></ol></li><li> 245 um OD/100 um Innendurchmesser (ID) Quarzglaskapillare Schlauch, erhältlich von Polymicro Technologies, ist in k Anzahl von 3 cm große Stücke schneiden. Diese umfassen die einzelnen Injektoren. Ein Einweg-Stück Kapillarrohr wird durch stochertejedes der Löcher, zu beseitigen Schmutz, ohne zu verstopfen die tatsächliche Injektoren. Die Injektoren sind dann zur Hälfte in jedes Loch gesteckt, so dass sie dicht und parallel zueinander gehalten. Die Injektoren sind in den Vorstand geklebt und bildet die Struktur der Injektor-Array. Was bleibt, ist die Injektoren auf die richtige Länge zu trimmen. </li><li> Der Injektor-Array ist die stereotaktische Klemme, indem Sie eine Ecke des proto-board zwischen den Acryl-Rechtecke angebracht ist, und dann durch Anziehen der Schraube der stereotaktischen Klemme. Als nächstes wird die Metallkanüle der Klemme, die stereotax befestigt, mit dem Befestigungsmechanismus der stereotax. </li><li> Alle folgenden wird unter dem Mikroskop durchgeführt. Für einen der äußeren Einspritzdüsen (das heißt, eines, das von der Seite mit einer geraden Kante angefahren werden kann, ohne anzustoßen in keine der anderen Injektoren), ist die Spitze, die über den Boden des Proto-Board mit einer Schere abgeschnitten. Für kortikale Injektionen, ist es angebracht, die Injektor sich etwa 5mm über der Oberfläche des proto-board. Für tiefere Injektionen, kann diese Zahl durch die entsprechende Erhöhung in der Tiefe erhöht werden. Die Spitze ist mit einem Dremel abgeflacht. Injector Tipps können auch geschliffen werden in einem Winkel als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme gegen Verstopfung, wenn Präzision in der Tiefe ist weniger wichtig. </li><li> Als nächstes wird ein stabiler Bezugspunkt innerhalb der Reichweite der stereotaktischen Arm gewählt, und der Injektor-Array wird verschoben, so dass die abgeflachte Spitze des äußeren Injektor, bei dieser Bezugspunkt ist. </li><li> Ein zweiter Injektor ist so gewählt, zusammen mit den entsprechenden Koordinaten. Betrachtet wird der relative Unterschied in der Höhe (z-Richtung) zwischen dem ersten und zweiten Injektor Koordinaten. Der Injektor-Array ist entlang der Z-Achse durch diese relative Distanz bewegt. Die zweite Einspritzdüse wird beschnitten und Dremeled auf die richtige Länge, so dass die Spitze des zweiten Injektor ist jetzt flach und auf der Höhe des Bezugspunktes. Der Injektor-Array kann in der X-und Y-Richtung bewegt werden, um gegenüber der Injektorspitze mit dem Bezugspunkt zu erleichtern. </li><li> Dieser Prozess der Besatz ist für die restlichen Injektoren wiederholt. </li></ol> 4. Montage des gesamten Systems <ol><li> Die stereotaktische Klemme und maßgeschneiderte Injektor-Array, beide bereits gebaut, sind für diesen Teil benötigt. </li><li> Das hintere Ende eines jeden Injektors (Ende, der bisher nicht beschnitten) ist in einen blauen F-240-Schlauch Manschette und mit Hilfe eines P-235 Nuss-und P-200 Zwinge aus Upchurch Scientific eingefügt wird, wird auf den Gewindeadapter bereits angeschlossen befestigt die Hamilton-Pumpe durch PE-Rohre. Die Anweisungen des Herstellers kann für weitere Details eingesehen werden. </li><li> Mit einer 27-Gauge-Nadel wird Silikonöl in die Rückseite des Hamilton-Spritzen so dass das gesamte System aus dem Hamilton-Spritze ist es, die Injektorspitze gefüllt injiziert, ohne Luftblasen überhaupt. </li><li> Als Hamilton Spritzen sind in der Hamilton-Pumpe neu platziert, ist das größtmögliche Volumen von Silikonöl in die Spritzen erhalten. </li><li> Wenn das Experiment erfordert mehr Spritzen als die Pumpe für (zwei in diesem Fall) ist so konzipiert, kann das Spritzen mit kleinen Stücken aus Kunststoff (z. B. Nadel caps) angeordnet werden, damit sie parallel zueinander, und dafür zu sorgen, dass alle Stücke sind getrieben von der Pumpe im gleichen Umfang. Oder Sie können ein Multi-Rack-Upgrade-Kit von Harvard Apparatus erworben werden, um bis zu 10 Spritzen auf einmal. </li></ol> 5. Injektionen / Chirurgie <ol><li> Der Prozess der Injektion mit einem parallel Injektor ist sehr ähnlich dem der Injektion mit einer einzigen Pipette. </li><li> Es ist wichtig, langsam nachfüllen verwenden / Infusion Raten während dieses Prozesses, denn schnelle Pumpen könnten Druck auf das Gelenk zwischen großen und kleinen Schlauch gelegt. Empfohlene max Geschwindigkeit: 2 ml / min für das Laden-Virus, und 0,1 ml / min zur Infusion Virus. </li><li> Einer narkotisierten Maus ist in der stereotax gesetzt und bleibt während des gesamten Versuchs betäubt. </li><li> Bereiten Sie die Maus nach Bedarf. Zum Beispiel mit einem Skalpell wird ein einziger hieb die Mittellinie der Haut gemacht, zwischen den Augen, zwischen den Ohren. Die Haut wird wieder auf den Schädel freizulegen, und die Faszie zu reinigen. A gezogen Glaspipette auf die stereotax befestigt. Die Positionen des Ohres Bars sind so eingestellt, bis Bregma und Lambda auf die gleiche Höhe ausgerichtet sind, und so, dass die Verbindungslinie zwischen ihnen ist parallel zur Y-Achse des stereotax. Die Achsen der stereotax sind nach dem Koordinatensystem, in dem die Injektion Koordinaten berechnet wurden orientiert. Die stereotaktische ist mit der Spitze der Glaspipette auf Bregma Null und dann die Spitze liegt leicht über dem Schädel an der X-und Y-Koordinaten von einem der Injektionsstelle positioniert. </li><li> Mit Hilfe eines zahnärztlichen Bohrers, der Schädel ist unterhalb der Spitze sorgfältig weg, bis es bleibt eine extrem dünne Schicht des Knochens verglichen. Die Glaspipette kann geringer seined und angehoben, um zu überprüfen, dass das Loch gebohrt an der richtigen Stelle zentriert ist. Mit einer 30-Gauge-Nadel, ein kleines Stück der Schicht wird vorsichtig aus, um die richtige X-und Y-Koordinaten, nahm, so dass die Dura mater freigelegt ist. Dieses Loch sollte gerade groß genug, um einer der Injektoren (0,25 mm breit) passen. Siehe Abbildung 1D für Diagramm. Auf diese Weise sind klein, 0,25 mm große Löcher in den Schädel, beim X-und Y-Koordinaten, die jeweils an der Injektionsstelle. </li><li> Die Glaspipette wird in einem Entsorgungsboxen verworfen, und die individuelle Injektor Array wird an die stereotax angebracht mit der stereotaktischen Klemme. </li><li> Um korrekt den Winkel des Injektors Array sind zwei äußeren Injektoren ausgewählt, um zu einem bestimmten Referenzpunkt kalibriert werden, wie folgt. Nach einer der Injektoren mit dem Referenzpunkt abgestimmt ist, betrachten die relative X-und Y-Abstände zwischen den Injektionen relativ zu diesem Injektor und einem anderen. Die Achsen der stereotax sind so eingestellt, dass gesamte Injektor-Array ist in der X-und Y-Richtung durch diesen relativen Abstände verschoben. Wenn der zweite Injektor ist jetzt nicht mit dem Bezugspunkt ausgerichtet, ist die Metallkanüle gelockert und gedreht werden. Dieser Prozess ist iterativ, bis der Injektor-Arrays richtig abgewinkelt wird wiederholt. </li><li> Vor dem Füllen der Injektoren mit einem Virus, sind die Injektoren mit Silikonöl gefüllt, bis die Spritzen an der 2 ul Punkt (oder mehr) sind. Dies stellt eine Pufferzone, so dass Luftblasen oder Verstopfungen in der Spitze leicht, indem Öl nach vorne mit dem Hamilton-Pumpe, ohne Nachfüllen des gesamten Systems mit Silikonöl von der Rückseite der Spritzen, wie zuvor beschrieben, entfernt werden. </li><li> Eine sterile Stück Parafilm ist auf dem Schädel platziert, und die Injektoren sind leicht auf den Parafilm gesenkt. Für Koordinaten mit sehr unterschiedlichen Tiefen, ein Brauch-Frästeil (z. B. eine Treppe Gebilde) erleichtern könnte loading. </li><li> Die folgenden Teile davon ausgehen, dass 1 ul Virus an jedem Standort geladen werden (die folgenden Mengen sollten verkleinert werden, wenn kleinere Mengen gewünscht werden) ist. Um zu gewährleisten, dass&gt; 1 ul des Virus an jedem Standort eingespritzt wird, beträgt 1,5 ul des Virus auf den Parafilm oder Treppe an der Spitze eines jeden Injektors pipettiert. </li><li> Mit dem Nachfüllen von dem Hamilton-Pumpe auf 1 ml / min, beträgt 1,2 ul des Virus in jedem Injektor wieder aufgefüllt. </li><li> Die Spitze des längsten Injektor ist bei Bregma Null, und dann den Injektor Array wird an die X-und Y-Koordinaten dieser Injektor verschoben. Wenn Verstopfung ist ein Problem, sagen, wenn viele tiefe Ziele beteiligt sind: Schon vor dem Einlegen der Injektor Spitzen in das Gehirn, ist es manchmal ratsam, die Pumpe die Infusion zu starten, bis Viren zu erkennen, die sich aus all den Injektor Tipps. Dies entfernt die Luftblasen in den Injektor Tipps und sorgt dafür, dass es keine Verstopfung. Im Falle einer Verstopfung wird der Hamilton-Pumpe auf einen kurzen Puls mit einer höheren Geschwindigkeit von 2 ml / min ziehen lassen, vorsichtig ausräumen zu verstopfen. </li><li> Der Injektor Array wird dann abgesenkt, durch die kleinen Löcher mit der 30-Gauge-Nadeln aus, um die richtige Z-Tiefe. </li><li> 1 ul-Virus wird durch jeden Injektor, bei 0,1 ml / min. </li><li> Die Injektionen werden allein für 30 Minuten verlassen. </li><li> Nach dem Injektor-Array wird langsam aus dem Gehirn extrahiert, die Hamilton-Pumpe eingestellt mit der gleichen Rate von 0,1 ml / min ziehen lassen, um für Verstopfungen in jedem Injektor überprüfen. </li><li> Dann werden die Injektoren sind durch Nachfüllen und Infusion von 1,5 ul Ethanol bei 2 ml / min gereinigt. </li><li> Schließlich sind die Injektoren mit Silikonöl gefüllt, um die 2 ul Pufferzone in jedem Hamilton-Spritze aufrecht zu erhalten. </li><li> Alle Geräte sollten vor und nach dem Eingriff sterilisiert werden, je nach Ihrer Institution Biosicherheit und Nutzung von Tieren Protokolle. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Die parallel Injektor Array beschleunigt eine Operation etwa um den Faktor gleich der Anzahl von Injektoren, nicht mitgerechnet Setup-und Recovery-Zeit, auch wenn einzelne Mal von der Geschicklichkeit des Behandlers abhängig ist. Für eine 1 Mikroliter Injektion, wir in der Regel sah Lentivirus Ausdruck in eine Sphäre von ca. 1mm Durchmesser (Abb. 1E). Die Präzision der Injektion war so, dass die Variabilität in der Spitze positioniert, von Versuch zu Versuch, war etwa 45 Mikrometer (Standardabweichung der Abstand von der Spitze der Lage, die beabsichtigten Position der Spitze). <img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Design, Implementierung und Verwendung eines parallel Virus Injektor-Array. A, schematische Darstellung des parallel Injektor-Array-System, die eine Dreifach-Injektor-Konfiguration, für drei gleichzeitige Injektionen. B, Foto von einem dreifachen parallel Injektor Array als in A diagrammed . <strong&gt; C, stereotaktischen Klemme, in Umrissen von oben gezeigt, D, Illustration der Technik für die effiziente, Schaden-Minimierung, Öffnung der Löcher im Schädel für Injektor Einsetzen in Gehirn:. mit einem zahnärztlichen Bohrer, dünnen Schädel bis auf ~ 50 Mikron dick, dann verwenden Sie der Spitze einer spitzen Nadel eine kleine Kraniotomie öffnen. E-, Fluoreszenz-Bild zeigt Channelrhodopsin-2 (ChR2)-GFP-markierten Zellen in drei Maus-kortikalen Regionen, wie die Dreifach-Injektor Array gezielt in B gezeigt

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Alle Arbeiten wurden in Übereinstimmung mit den NIH Leitfaden für Versuchstiere und vom MIT Animal Care und Nutzung und Biosafety Ausschüsse.

In den letzten Jahren haben eine Reihe von genetisch kodierten optischen Sensibilisatoren Neuronen aktiviert werden, damit aktiviert werden und zum Schweigen gebracht in vivo in einem zeitlich präzise Art und Weise, in Reaktion auf kurze Lichtimpulse (zB 1,4,5,6,7,8 , 11). Eine wichtige Methode, mit der Nervenzellen sensibilisiert worden, um in das Gehirn von Säugetieren Licht haben, wird über Viren, wie zB Lentiviren und Adeno-assoziierte Viren (AAV), die Gene, die für Opsine um Gehirne von Tieren reicht von Mäusen, Affen liefern können, in einem sichere und dauerhafte Art und Weise (zB 2,9,10). Viren ermöglichen schnellere Durchlaufzeiten, als sie Transgenik, vor allem für Organismen, die nicht genetische Modellorganismen wie Ratten und Affen, und für Opsine können hohe Expression, die nicht in transgenen Szenarien möglich ermöglichen kann. Hier zeigen wir eine parallele Injektor Array in der Lage zu schaffen, in einer schnellen Zeitskala, &quot;Circuit-Level-Transgenen,&quot; enabling gesamte 3-dimensionale Hirnstrukturen zu viral mit einem Gen gezielt in einem einzigen chirurgischen Schritt. Der Injektor Array besteht aus einer oder mehreren Verdrängerpumpen, dass jedes Laufwerk eine Reihe von Spritzen, von denen jeder in eine Polyimid / Fused-Silica-Feeds über eine Hochdruck-tolerant Anschluss Kapillare. Die Kapillaren sind so bemessen, und dann in, gewünschten Stellen durch individuelle Fräsen einer stereotaktischen Positionierung Bord angegebenen eingefügt, so dass Viren oder andere Reagenzien auf den gewünschten Satz an Hirnregionen geliefert werden. Zur Verwendung des Geräts, der Chirurg füllt zunächst die fluidische Subsystem vollständig mit Öl, Hinterfüllungen die Kapillaren mit dem Virus, fügt das Gerät in das Gehirn, und flößt Reagenzien langsam (&lt;0,1 ul / min). Diese Technologie ermöglicht eine Vielzahl neuer Arten von Experimenten, wie Millisekunden-Zeitskala Herunterfahren von komplex geformten Strukturen (wie dem Hippocampus) zu präzisen Zeitpunkten während Verhalten, zeitlich präzise Inaktivierung von bilateralen Strukturen, die redundant wirken können (z. B. der linken und rechten Amygdala), und die Störung mehrerer diskreter Hirnregionen (zB zum Antrieb von zwei verbundenen Regionen außer Phase zu untersuchen, wie Cross-Region synchron hängt Aktivität innerhalb jeder Region oder anregend Eingänge zu einer Region, während silencing eine Teilmenge von die Ziele, um zu verstehen, welche der verschiedenen Ziele sind entscheidend für die Vermittlung der Auswirkungen dieser Eingänge). Für große Gehirne wie die in den Primaten, bei denen wir vor kurzem optische Zelltyp spezifische neuronale Aktivierung 3, störende Tätigkeit in einem verhaltensgestörte relevanten Bereich können virale Kennzeichnung von großen, komplexen Strukturen erfordern demonstriert. Wir stellen fest, dass parallel Injektor-Arrays verwendet werden, um nahezu jede Nutzlast zu injizieren - Drogen, Neuromodulatoren, Neurotransmitter, oder sogar Zellen - in komplexe 3-D-Muster im Gehirn, in einer zeitlich präzise Art und Weise. Schließlich ist aus einer translatorischen Standpunkt aus ist es möglich, dass eine schnelle, Patienten-individuelle Gentherapie oder Drug-Delivery-Geräte können schnell werden individuell entworfen und gefertigt, um individuelle Gehirn Geometrien übereinstimmen, die Unterstützung neuer Behandlungsmöglichkeiten für eine Vielzahl von Erkrankungen, die möglicherweise durch den Einsatz von optische Kontrolle Moleküle. Der Injektor-Arrays wurden entwickelt, um genau zu sein, sowohl räumlich als auch volumetrisch. In der X-und Y-Richtung, ist dies durch Bohrungen sehr genau platziert Löcher mit einer kostengünstigen Mini-Mühle, mit den Löchern, die gerade groß genug, um die Injektoren, so dass Injektoren parallel zueinander statt fit erreicht, und in einer präzisen Standort. In der Z-Richtung sind die Injektoren getrimmt mit einem stereotaktischen Apparat, so dass ein Maß an Präzision entspricht, dass der stereotaktischen Operation. Die volumetrische Genauigkeit ergibt sich aus der Präzision der Hamilton-Pumpe, sowie die nahe null Totvolumen Anschlüsse, aus der Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) Gebiet angepasst. Die Injektoren sind aus Quarzglas Kapillarrohr, die stark und stabil genug, dass es genau die Form und den Abstand unter Druck hält gemacht wird, ohne größere Wandstärke von Alternativen wie z. B. Stahl Kanülen. Kleine Änderungen können leicht den parallel Injektor-Array an eine Vielzahl von Experimenten anzupassen. Zum Beispiel, wenn ein kleineres Volumen von Viren oder feiner Abstand erforderlich ist, können kleinere Kapillarrohr eingesetzt, zusammen mit einem entsprechenden kleineren Bohrer werden. Zukünftige Geräte können zu nutzen mikrofluidischen Kanälen und Pumpen, um die Anzahl der parallel Injektoren zu erhöhen, um die Größe zu minimieren (vielleicht die solche Bauteile auf die Köpfe der frei beweglichen Tieren montiert werden).

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		<th>Comment</th>
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<tr>
<td>Dremel Tool</td>
<td>Tool</td>
<td>Dremel</td>
<td>3956-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Cutter</td>
<td>Tool</td>
<td>Universal Laser Systems</td>
<td>VLS2.30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot glue gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Stanley Bostitch</td>
<td>GR20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump)</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton syringes</td>
<td>Tool</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>701N</td>
<td>Need one per injection site</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse stereotax</td>
<td>Tool</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51725D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Modela mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Roland</td>
<td>MDX-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.011" diameter drill bit for mini mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8915A12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/32" diameter drill bit For mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>8848A35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High speed dental drill</td>
<td>Tool</td>
<td>Lynx</td>
<td>333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dental drill accessories</td>
<td>Tool</td>
<td>Pearson</td>
<td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HTX-15R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 binding slotted machine screw</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>MX-0172B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 hex nut</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HNX-0172</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCB proto-board, 1/32" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Digi-Key</td>
<td>PC57-T-ND</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylic Sheet, 1/8" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8560K239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HPLC connectors</td>
<td>Material</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an &#x2018;x&#x2019; to the end of the part number)</td>
<td>Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused</td>
</tr>
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing, OD: 245 &mu;m, ID: 100 &mu;m</td>
<td>Material</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>2000022-10M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
<td>Material</td>
<td>Permatex</td>
<td>84101</td>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyethylene tubing .066 x .095 inch</td>
<td>Material</td>
<td>VWR</td>
<td>63018-827</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

scalable fluidic injector arrays for viral targeting of intact 3-d brain circuits

Unser Verständnis von neuronalen Schaltkreisen - stark durch eine Technologie wäre für die schnelle Targeting Gene bis hin zu komplexen 3 erleichtert - wie sie die Berechnungen, dass subserve Empfindung, Denken, Fühlen und Handeln, und wie sie sich in neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen beschädigte vermitteln - dimensionale neuronalen Schaltkreise, die die schnelle Entwicklung von &quot;Circuit-Level Transgenik.&quot; Vor kurzem haben wir Verfahren, bei denen Viren kodieren für lichtempfindliche Proteine ​​spezifischen Zelltypen zu Millisekunden-Zeitskala Aktivierung zu sensibilisieren und zum Schweigen im intakten Gehirn entwickelt. Wir stellen hier die Konzeption und Umsetzung eines Injektors Array der Lage ist, Viren (oder andere Flüssigkeiten), Dutzende von definierten Punkten innerhalb der 3-dimensionalen Struktur des Gehirns (<strong&gt; Abbildung. 1A, 1B</strong&gt;). Der Injektor Array besteht aus einer oder mehreren Verdrängerpumpen, dass jedes Laufwerk eine Reihe von Spritzen, von denen jeder in eine Polyimid / Fused-Silica-Feeds über eine Hochdruck-tolerant Anschluss Kapillare. Die Kapillaren sind so bemessen, und dann in, gewünschten Stellen durch individuelle Fräsen einer stereotaktischen Positionierung Bord angegebenen eingefügt, so dass Viren oder andere Reagenzien auf den gewünschten Satz an Hirnregionen geliefert werden. Zur Verwendung des Geräts, der Chirurg füllt zunächst die fluidische Subsystem vollständig mit Öl, Hinterfüllungen die Kapillaren mit dem Virus, fügt das Gerät in das Gehirn, und flößt Reagenzien langsam (&lt;0,1 Mikroliter / min). Die Parallelität der Injektor-Array ermöglicht eine schnelle, genaue und robuste Kennzeichnung des gesamten neuronalen Schaltkreise mit viralen Nutzlasten wie optische Sensibilisatoren, Licht-Aktivierung und Inaktivierung von definierten Schaltkreise im Gehirn zu aktivieren. Zusammen mit anderen Technologien wie Glasfaser-Arrays für Licht Lieferung an gewünschte Sätze von Hirnregionen, hoffen wir, einen Werkzeugkasten, dass die systematische Untersuchung von kausalen neuronalen Funktionen im intakten Gehirn aktiviert wird. Diese Technologie kann nicht nur öffnen, wie systematische Ansätze zur Schaltung fokussierten Neurowissenschaften in Säugetieren, und erleichtern die Kennzeichnung von Hirnregionen in großer Tiere wie Primaten, kann aber auch offen eine klinische translationale Pfad für Zell-spezifische optische Kontrolle der Prothetik können, deren Genauigkeit ermöglichen eine verbesserte Behandlung von hartnäckigen Störungen des Gehirns. Schließlich können solche Geräte, wie hier beschrieben zu erleichtern präzise getimten fluidische Lieferung von anderen Nutzlasten, wie Stammzellen und pharmakologische Mittel, um 3-dimensionale Strukturen, in einer leicht vom Benutzer individuell Mode.

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Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Controlling und Analyse von neuronalen Schaltkreisen<em&gt; In vivo</em&gt; Würde durch eine Technologie zur Bereitstellung von Viren und anderen Reagenzien zu wünschen übrig 3-dimensional Sätze von Hirnregionen erleichtert werden. Wir zeigen, kundenspezifische Fluidik-Injektor Array Herstellung und Lieferung von viral codierte optische Sensibilisatoren, so dass optische Manipulation komplexer Schaltkreise im Gehirn.

Skalierbare Fluidic Injector Arrays für Viral Targeting von Intact 3-D Schaltkreise im Gehirn

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K Aufrufe.  Massachusetts Institute of Technology. Controlling und Analyse von neuronalen Schaltkreisen In vivo Würde durch eine Technologie zur Bereitstellung von Viren und anderen Reagenzien zu wünschen übrig 3-dimensional Sätze von Hirnregionen erleichtert werden. Wir zeigen, kundenspezifische Fluidik-Injektor Array Herstellung und Lieferung von viral codierte optische Sensibilisatoren, so dass optische Manipulation komplexer Schaltkreise im Gehirn.

Serie: Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

Targeting von Deep Brain Strukturen mit Mikroinjektionen für die Lieferung von Drogen, virale Vektoren oder Zelltransplantaten

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Forschung

Neurowissenschaften

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Intact Histologische Charakterisierung von Brain-implantierten Microdevices und des umgebenden Gewebes

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Elektrophysiologische Aufnahme im Gehirn von erwachsenen Zebrafisch Intact

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

3-D-Bildgebung und Analyse von Neuronen Infizierte<em&gt; In-vivo-</em&gt; Mit<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Modifikation eines Colliculo-thalamokortikalen Maus Hirnschnitt, Einbindung der 3D-Druckkammerkomponenten und Multiskalen Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Schaltkreise in Hirnschnitten

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not represent the underlying cytoarchitectural and functional complexity of the affected individuals carrying suspected disease variants. Conventional 2-D models remain incomplete representations of in vivo-like structures and do not adequately capture the complexity of the brain. Thus, there is an emerging need for more 3-D hiPSC-based models that can better recapitulate the cellular interactions and functions seen in an in vivo system.
Here we report a protocol to develop a 3-D system from undifferentiated hiPSCs based on the serum free embryoid body (SFEB). This 3-D model mirrors aspects of a developing ventralized neocortex and allows for studies into functions integral to living neural cells and intact tissue such as migration, connectivity, communication, and maturation. Specifically, we demonstrate that the SFEBs using our protocol can be interrogated using physiologically relevant and high-content cell based assays such as calcium imaging, and multi-electrode array (MEA) recordings without cryosectioning. In the case of MEA recordings, we demonstrate that SFEBs increase both spike activity and network-level bursting activity during long-term culturing. This SFEB protocol provides a robust and scalable system for the study of developing network formation in a 3-D model that captures aspects of early cortical development.

Here we report a protocol to develop a three-dimensional (3-D) system from human induced-pluripotent stem cells (hiPSCs) called the serum free embryoid body (SFEB). This 3-D model can be used like an organotypic slice culture to model human cortical development and for the physiological interrogation of developing neural circuits.

Entwickeln von HiPSC-abgeleiteten serumfreien Embryoidkörpern zur Vernehmung von 3-D-Stammzellkulturen unter Verwendung physiologisch relevanter Assays

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Generation von 3-D-Kollagen-basierten Hydrogelen zur Analyse des axonalen Wachstums und Verhaltens während der Entwicklung des Nervensystems

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and smaller functional subgroups, it becomes paramount to record from projections and/or genetically-defined subpopulations of neurons. Fiber photometry is an accessible and powerful approach that can overcome these challenges. By combining optical and genetic methodologies, neural activity can be measured in deep brain structures by expressing genetically-encoded calcium indicators, which translate neural activity into an optical signal that can be easily measured. The current protocol details the components of a multi-fiber photometry system, how to access deep brain structures to deliver and collect light, a method to account for motion artifacts, and how to process and analyze fluorescent signals. The protocol details experimental considerations when performing single and dual color imaging, from either single or multiple implanted optic fibers.

This protocol details how to implement and perform multi-fiber photometry recordings, how to correct for calcium-independent artifacts, and important considerations for dual-color photometry imaging.

Multi-Fiber Photometrie zur Aufzeichnung neuronaler Aktivität bei frei beweglichen Tieren

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...