Forschung unterstützt von New Hampshire-INBRE durch einen Institutional Development Award (IDeA), P20GM103506, vom Nationalen Institut für Allgemeine Medizinische Wissenschaften des NIH.

Hinweis: Zeitliche Betrachtungen für jeden Assay müssen gemacht werden, da einzelne Medienvorbereitungen unterschiedliche Zeiten erfordern. Zum Beispiel sollten feste Agarplattenmedien ausreichend kühlen und trocknen lassen (1-2 Tage). Zusätzliche Zeitüberlegungen ( dh Einzelkolonie und Übernachtkulturwachstum) werden unter jedem Protokoll spezifiziert und sind in Tabelle 2 zu finden . 1. Vorbereitung der Medien <ol><li> 1x Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) <ol><li> Wiegen 4,0 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,72 g Na 2 HPO 4 und 0,12 g KH 2 PO 4 . Die Bestandteile werden in einem 1 l Erlenmeyerkolben vermischt, mit deionisiertem Wasser auf 500 ml eingestellt, mit einem pH-Meter den pH-Wert auf 7,2 eingestellt und HCl tropfenweise zu der Lösung gegeben und mit einem 0,22 μm-Filter autoklaviert oder filtriert. 1x PBS kann bei Raumtemperatur auf unbestimmte Zeit gelagert werden. ACHTUNG: HCl ist eine konzentrierte Säure und sollte entsprechend behandelt werdenZu institutionellen, lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften. Für entsprechende Handhabungsrichtlinien beachten Sie bitte das Sicherheitsdatenblatt des Herstellers. </li></ol></li><li> Luria-Bertani (LB) Brühe <ol><li> Wiegen 5,0 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt und 2,5 g NaCl. Kombinieren Sie die Bestandteile in einer 1 l Flasche, stellen Sie das Volumen auf 500 ml mit entionisiertem Wasser, Autoklav und speichern Sie bei Raumtemperatur für bis zu 6 Monate. Für klassische Biotyp-Virulenz-induzierende Bedingungen, pH-Wert auf 6,5 mit HCl vor dem Autoklavieren einstellen. </li></ol></li><li> AKI Medium mit 0,03% (w / v) NaHCO 3 <ol><li> Für Komponente 1 (AKI-Medium): 7,5 g Pepton, 2,0 g Hefeextrakt und 2,5 g NaCl wiegen. Kombinieren Sie die Bestandteile in einer 1 l Flasche, stellen Sie das Volumen auf 450 ml mit deionisiertem Wasser und Autoklav ein. AKI-Medium kann bei Raumtemperatur bis zu 6 Monate gelagert werden. </li><li> Für Komponente 2 (NaHCO 3 ): 1,5 g NaHCO 3 wiegen und Volumen einstellenBis 50 ml mit deionisiertem Wasser in einem sterilen Vesikel. Filter sterilisieren NaHCO 3 mit einem 0,22 μm Filter. NaHCO 3 muss unmittelbar vor Gebrauch hergestellt werden. </li><li> Aseptisch kombinieren die beiden Komponenten ein 1:10 Verhältnis durch Filtern von Komponente 2 in Komponente 1 vor der Verwendung. </li></ol></li><li> Luria-Bertani (LB) Agar Platten <ol><li> 5,0 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt, 2,5 g NaCl und 7,5 g Agar abwiegen. Die Bestandteile in einem 1 l Erlenmeyerkolben vereinigen, das Volumen auf 500 ml mit deionisiertem Wasser, Autoklaven einstellen und in Standard-100 mm x 15 mm sterilen Petrischalen vorbereiten. Überzogene Medien können bis zu 6 Monate in Plastik verpackt werden, Deckel-Seite bis 4 ° C. </li></ol></li><li> LB-Agarplatten ergänzt mit Polymyxin B <ol><li> Für Komponente 1 (LB-Agar): 5,0 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt, 2,5 g NaCl und 7,5 g Agar. Kombinieren Sie die Bestandteile in einem 1 l Erlenmeyerkolben, stellen Sie das Volumen auf 500 ml wi einTh deionisiertes Wasser und Autoklav. </li><li> Für Komponente 2 (Polymyxin B): Polymyxin B in deionisiertem Wasser in einem sterilen 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf eine Konzentration von 50.000 IE / μl auflösen und mit einem 0,22 μm Filter filtrieren. </li><li> Sobald die Komponente 1 zu der Berührung kalt ist, aber noch nicht verfestigt ist, fügen Sie 500 μl der Komponente 2 zu der Komponente 1 aseptisch hinzu, wodurch eine Endkonzentration von 50 IE / μL entsteht und sorgfältig vermischt wird. Bereiten Sie in standardisierten 100 mm x 15 mm sterilen Petrischalen vor, indem Sie gemischte Agarmedien in die Petrischalen gießen. Überzogene Medien können bis zu 3 Monate in Plastik verpackt werden, Deckel-Seite bis 4 ° C. </li></ol></li><li> Minimale Citrat-Mittel-Agar-Platten <ol><li> Für Komponente 1 (Agar mit Bromthymolblau): 7,5 g Agar und 0,02 g Bromthymolblau wiegen. Die Bestandteile in einem 1 l Erlenmeyerkolben vereinigen, das Volumen auf 450 ml mit deionisiertem Wasser einstellen und die Mischung autoklavieren. </li><li> Für Komponente 2 (10x VBMM): wiegen 10 g MgSO 4 7H 2 O, 10,0 g Zitronensäure H 2 O, 50,0 g wasserfreies K 2 HPO 4 und 17,5 g NaNH 4 HPO 4 4H 2 O. Die Bestandteile in einem 1 l Erlenmeyerkolben vereinigen, das Volumen auf 500 ml einstellen Mit entionisiertem Wasser und Autoklav oder Filter sterilisieren mit einem 0,22 μm Filter. 10x VBMM kann bei Raumtemperatur bis zu 6 Monaten gelagert werden. </li><li> Fügen Sie 50 ml Komponente 2 zu Komponente 1 hinzu und bereiten Sie in standardisierten 100 mm x 15 mm sterilen Petrischalen vor, indem Sie gemischte Agarmedien in die Petrischalen gießen. Überzogene Medien können bis zu 6 Monate in Plastik verpackt werden, Deckel-Seite bis 4 ° C. </li></ol></li><li> Milch-Agar-Platten <ol><li> Für Komponente 1 (Milch): 8,0 g sofortige fettfreie Trockenmilch in einem 1 l Erlenmeyerkolben wiegen, das Volumen auf 200 ml mit entionisiertem Wasser und Autoklav einstellen. </li><li> Für Komponente 2 (Agar mit Hirn-Herz-Infusion): 3,68 g Hirn-Herz-Infusion und 6,0 ​​g Agar. Kombinieren Sie die conSubstituenten in einem 500 mL Erlenmeyerkolben, Volumen auf 200 ml mit deionisiertem Wasser und Autoklav einstellen. </li><li> Kombinieren Sie die beiden Komponenten, indem Sie die Komponente 2 nach dem Autoklavieren in die Komponente 1 gießen und gründlich mischen. Vorbereiten in 150 mm x 15 mm sterilen Petrischalen. Milchplatten können bis zu einer Woche in Plastik gepackt werden, Deckel-Seite nach unten bei 4 ° C. Bereiten Sie in 150 mm x 15 mm sterilen Petrischalen vor, indem Sie gemischte Agarmedien in die Petrischalen gießen. </li></ol></li><li> Motility Agar Platten <ol><li> Für Komponente 1 (LB-Agar): 5,0 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt, 2,5 g NaCl und 2,0 g Agar. Die Bestandteile in einem 1 l Erlenmeyerkolben vereinigen, das Volumen auf 500 ml mit entionisiertem Wasser und Autoklav einstellen. </li><li> Für Komponente 2 (1% (Gew./Vol.) Triphenyltetrazoliumchlorid, TTC): 0,25 g TTC. Einstellen des Volumens auf 25 ml mit deionisiertem Wasser in einem sterilen Vesikel und Filter sterilisieren mit einem 0,22 μm Filter. Lagerung bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur eingewickeltIn der Folie, um die Belichtung zu minimieren. </li><li> Füge 2,5 ml 1% (w / v) sterile TTC zu autoklavierten Medien hinzu. </li><li> Gießen Sie die Medien so dick wie möglich (≥ 50 ml / Platte) in große 150 mm x 15 mm sterile Petrischalen. Überzogene Medien können bis zu einer Woche in Plastik gepackt werden, Deckel-Seite nach oben bei 4 ° C. Bereiten Sie in 150 mm x 15 mm sterilen Petrischalen vor, indem Sie gemischte Agarmedien in die Petrischalen gießen. </li></ol></li><li> Voges-Proskauer (VP) <ol><li> Für die Komponente 1 (Methyl-Rot-Voges-Proskauer-Brühe, MR-VP): 1,7 g MR-VP-Medium in einem 500 mL Erlenmeyerkolben abwiegen, das Volumen auf 100 ml mit entionisiertem Wasser und Autoklaven einstellen. Sterile MR-VP-Brühe kann bei Raumtemperatur bis zu 6 Monate gelagert werden. </li><li> Für Komponente 2 (5% (w / v) alpha (α) Naphthol): 1,0 g α-Naphthol in einer sterilen Vesikel abwiegen und das Volumen auf 20 ml mit 95% igem Ethanol einstellen. Α-Naphthol kann bei Raumtemperatur bis zu 1 Woche in Folie eingewickelt werden, um Licht exp zu minimierenOsure </li><li> Für Komponente 3 (40% (w / v) Kaliumhydroxid, KOH): 20,0 g KOH in einer sterilen Vesikel wiegen, das Volumen auf 50 ml mit sterilem deionisiertem Wasser einstellen. KOH kann bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur in einem Kunststoffgefäß aufbewahrt werden. </li></ol></li></ol> 2. Instandhaltung und Wachstum von V. Cholerae- Stämme <ol><li> Vorbereitung und Verwendung von Tiefkühlkulturen <ol><li> Pellet 1,8 ml flüssige über Nacht Kultur für 2 min durch Zentrifugation (≥8,600 xg) in einem sterilen 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen, entfernen Sie den Überstand und re-suspendieren Sie das Zellpellet in 900 &amp; mgr; l frische LB-Brühe durch Pipettieren. </li><li> Fügen Sie 900 μl steriles 60% (v / v) Glycerin der Kultur hinzu und mischen durch Vortexen. </li><li> Übertragen Sie die Mischung auf ein steriles 2 mL Kryo-Röhrchen und lagern Sie auf unbegrenzt bei -80 ° C. </li><li> Um zu verwenden, entfernen Sie eine kleine Menge von gefrorenen Bestand mit einer sterilen Impfschleife und Streifen für einzelne Kolonien auf LB agAr Platten. Sofort Rücklauf von gefrorenem Lager auf -80 ° C nach Gebrauch, um zu verhindern, dass Kulturen vollständig auftauen. Inkubieren Sie die Platten Deckel-Seite nach unten für 12 bis 16 h bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Wachstum von Übernachtkulturen in flüssigem Medium <ol><li> Streifen für Einzelkolonien (nach Abschnitt 2.1.4) aus gefrorenem Bestand auf LB-Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten Deckel-Seite nach unten für 12 bis 16 h bei 37 ° C. </li><li> 4 ml flüssige LB-Brühe in einem sterilen 10-ml-Kulturrohr mit einer einzigen Kolonie inokulieren, indem man die Oberfläche der einzelnen Kolonie mit einem sterilen Applikatorstock berührt und die Kolonie in die flüssige Brühe überführt. </li><li> Inkubieren mit Belüftung in einem Shaker-Inkubator bei 225 U / min für 12 bis 16 h bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Wachstumskurve <ol><li> Bereiten Sie über Nacht Kultur in flüssiger LB Brühe vor, wie oben in Protokoll 2.2 angegeben. </li><li> Mischen Sie eine 1: 100-Verdünnung der Übernachtkultur durch Übertragen von 250 μl über Nacht Kultur auf 25 ml frische LB-Brühe in einem sterilen 250 mL Erlenmeyerkolben. </li><li> Messen Sie die optische Dichte der Flüssigkulturen bei 600 nm (OD 600 ) jede Stunde, die zum Zeitpunkt der Inokulation beginnt (T 0 ). </li><li> Inkubieren Sie eine 1: 100-Verdünnung der Übernachtkultur mit Belüftung in einem Shaker-Inkubator bei 225 U / min für bis zu 30 h bei 37 ° C oder bis die Kultur die maximale Dichte erreicht. </li><li> Zeichnen Sie die OD 600 vs. Time und verwenden Sie eine lineare Regression, um die ungefähre Verdopplungszeit für jeden Stamm zu bestimmen. </li></ol></li><li> El Tor Biotype Virulenz Inducing Bedingungen <ol><li> Streifen für einzelne Kolonien aus gefrorenem Bestand auf LB-Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten Deckel-Seite nach unten, für 12 bis 16 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Inokulieren Sie 10 ml AKI-Medium, das 0,03% (w / v) NaHCO 3 mit einer einzigen Kolonie enthält. </li><li> Inkubieren Sie die Kultur ohne Belüftung bei 37 ° C für 3,5 h. </li><li> 7 ml Kultur entfernen und die restlichen 3 ml Kultus inkubierenRe mit Belüftung in einem Shaker-Inkubator bei 225 U / min für weitere 4 h. </li></ol></li><li> Klassische Biotyp Virulenz Inducing Bedingungen <ol><li> Streifen für einzelne Kolonien aus gefrorenem Bestand auf LB-Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten Deckel-Seite nach unten für 12 bis 16 h bei 37 ° C. </li><li> 4 ml flüssige LB-Brühe (pH 6,5) mit einer einzigen Kolonie inokulieren. </li><li> Inkubieren mit Belüftung in einem Shaker-Inkubator bei 225 U / min für 12 bis 16 h bei 30 ° C. </li></ol></li><li> Waschzelle Pellet in 1x PBS <ol><li> Pellet 1,8 ml über Nacht Kultur für 2 min durch Zentrifugation (≥8,600 xg) in einem sterilen 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Das Pellet in 1,8 ml 1x PBS durch Pipettieren erneut suspendieren. </li><li> Wiederholen Sie den Waschvorgang dreimal, gefolgt von einer abschließenden Resuspension in 1,8 ml 1x PBS. </li></ol></li></ol> 3. Charakterisierung von V. Cholerae Biotypen <ol><li> PCR-basierte Genetische Bildschirme mit ctxB und tcpA <ol><li> Entwerfen Sie einen Satz von Primern, die etwa 50-70 bp stromaufwärts und stromabwärts der Translationsstart- und Stoppstellen von ctxB bzw. tcpA anlagern. </li><li> Bereiten Sie über Nacht Kultur in flüssiger LB Brühe vor, wie oben in Protokoll 2.2 angegeben. </li><li> Isolieren Sie chromosomale DNA mit einem handelsüblichen Kit, der für Gram-negative Bakterien entwickelt wurde. Gereinigte chromosomale DNA kann unbegrenzt bei -20 ° C gelagert werden. Die chromosomale DNA-Isolierung unter Verwendung von im Handel erhältlichen Kits dauert im allgemeinen etwa 4 h. </li><li> Verwenden Sie ein Mikro-Volumen-Spektrophotometer, um sicherzustellen, dass die chromosomale DNA-Probe von hoher Qualität ist (A 260/280 &gt; 1,8). </li><li> Für jedes chromosomale DNA-Isolat wird die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf Eis in sterilen 200 &amp; mgr; l PCR-Röhrchen hergestellt und die Bereiche von ctxB und tcpA unter Verwendung von Standard-PCR-Komponenten amplifiziert: Taq- Polymerase und BuFfer (oder äquivalente), dNTP-Lösung und Vorwärts- / Rückwärts-Primer. Verwenden Sie Standard-PCR-Parameter (~ 3 Std.). Verwenden Sie zum Beispiel das folgende Protokoll: <ol><li> Anfängliche Denatur bei 95 ° C für 120 s. </li><li> Denaturierung bei 95 ° C für 60 s. </li><li> Anneal-Primer bei 60 ° C für 45 s. </li><li> Verlängere bei 72 ° C für 90 s. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1.5.2 bis 3.1.5.4 für 34 Zyklen. </li><li> Endverlängerung 72 ° C für 600 s. </li><li> Unendlicher Halten bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Färben Sie 5 &amp; mgr; l des jeweiligen PCR-Produkts unter Verwendung eines Standard-6 × DNA-Gel-Beladungsfarbstoffs und laden Sie etwa 10 &amp; mgr; l 1 kb-Leiter und 10 &amp; mgr; l PCR-Produkt auf ein 1% Agarosegel in 1x Tris-Borat-EDTA (TBE) Puffer. </li><li> Führen Sie die Gelelektrophorese bei 130 V aus, bis die Farbstofffront das Ende erreicht hat, aber nicht aus dem Gel (ca. 90 min). Eine ständige Überwachung wird empfohlen, da die Spannungs- und Laufzeiten je nach Ausstattung variieren können. </li><li> Bei der Überprüfung vonErfolgreiche PCR-Amplifikation bei der erwarteten Größe, reinigen die verbleibenden 45 μL PCR-Produkte mit einem handelsüblichen DNA Clean &amp; Concentrator Kit. </li><li> Sequenz gereinigtes PCR-Produkt (e) unter Verwendung der gleichen Primer, die für die PCR-Amplifikation verwendet werden, und die Vorbereitung pro lokalen Sequenzierungsrichtlinien-Richtlinien. </li><li> Vergleichen Sie das FASTA-Format von Gensequenzen von jedem Isolat zu der veröffentlichten Sequenz, die auf der NCBI-Website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) verfügbar ist, indem Sie die folgenden Zugangsnummern im Suchabfragefeld durchsuchen. </li><li> CtxB : (klassische) Region zwischen VC0395_A1059 bis VC0395_A1060 (El Tor) VC_1456 </li><li> TcpA : (klassisch) VC0395_A0353 (El Tor) VC_0828 </li></ol></li><li> Phänotypische Assays zur Biotyp-Klassifikation über Spotting <ol><li> Bereiten Sie über Nacht Kultur in flüssiger LB Brühe vor, wie oben in Protokoll 2.2 angegeben. </li><li> Waschen Sie das Zellpellet (s) gemäß Protokoll 2.6. </li><li> Verwenden Sie eine Pipette zuSpritzen 1 &amp; mgr; l gewaschene Kultur auf dem jeweiligen Medium. Für mittlere Auswahl- und Inkubationsangaben siehe Tabelle 2. </li></ol></li><li> Motilitätsassay <ol><li> Bereiten Sie über Nacht Kultur (en) in flüssiger LB-Brühe vor, wie zuvor in Protokoll 2.2 angegeben. </li><li> Waschen Sie das Zellpellet (s) gemäß Protokoll 2.6. </li><li> Inokulieren Sie Motilitäts-Agarplatten, indem Sie Inokulationsstab in die gewaschene Flüssigkeitskultur einfügen und &quot;vertikal&quot; in das Medium &quot;stab&quot;. Zwischen jeder Inokulation sterilisieren Sie den Drahtstab mit einem Bunsenbrenner, und wenn Sie Agar stechen, stellen Sie sicher, dass sich der Impfstab nicht beugt, da dies die Ergebnisse verändern kann. </li><li> Inkubieren Sie die Platten Deckel-Seite für 14 bis 24 h bei 37 ° C. Nach 14 h, überwachen Motilitätsplatten eng zu verhindern Überwachsen von Kulturen. </li></ol></li><li> Voges-Proskauer (VP) Assay <ol><li> Bereiten Sie über Nacht Kultur (en) in flüssiger LB-Brühe vor, wie zuvor in Protokoll 2.2 angegeben. </li><li> Inokulieren 4Ml Methylrot Voges-Proskauer oder MR-VP-Brühe durch Pipettieren von 10 &amp; mgr; l der zuvor hergestellten Übernachtkultur in 4 ml MR-VP-Brühe in einem sterilen Kulturrohr und Inkubieren mit Belüftung in einem Schüttel-Inkubator bei 225 U / min für 12 bis 16 H bei 37 ° C. </li><li> Füge 150 μl 5% (w / v) α-Naphthol und 50 μl 40% (w / v) KOH zu 1 mL Aliquoten der MR-VP-Übernachtkultur in sterilen Kulturröhrchen hinzu. </li><li> Kurz vorwirbeln und bei Raumtemperatur bis zu 4 h stehen lassen, bis sich Farbwechsel entwickelt. </li></ol></li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+cascade+controls+virulence+in+Vibrio+cholerae.">Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (12), 5403-5407 (1991).</li><li>Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duel+regulation+of+genes+involved+in+acetoin+biosynthesis+and+motility/biofilm+formation+by+the+virulence+activator+AphA+and+the+acetate-responsive+Lys-R+type+regulator+AlsR+in+Vibrio+cholerae.">Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae.</a> Mol. Microbiol. 57 (2), 420-433 (2005).</li><li>Vogel, H. J., Bonner, D. 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Microbiol. , 6A.2.1-6A.2.17 (2011).</li><li>Kovacikova, G., Skorupski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+virulence+gene+expression+in+Vibrio+cholerae+by+quorum+sensing:+HapR+functions+at+the+aphA+promoter.">Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter.</a> Mol. Microbiol. 46 (4), 1135-1147 (2002).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+functional+quorum-sensing+systems+in+recently+emerged+Vibrio+cholerae+toxigenic+strains.">The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3 (2), 218-222 (2011).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques.">Aseptic laboratory techniques.</a> J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).</li><li>Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+laboratory+maintenance+of+Vibrio+cholerae.">Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae.</a> Curr. Protoc. , 6A.1.1-6A.1.6 (2010).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Von den über 200 identifizierten V. Cholerae Serogruppen, nur O1 und O139 haben epidemisches Potential. Die O1 Serogruppe kann in zwei Biotypen unterteilt werden: klassisch und El Tor. Allerdings sind Hybrid-Stämme, die als El Tor-Varianten 13 , 17 bezeichnet werden, entstanden, die den El-Tor-Biotyp-Hintergrund besitzen und klassische Merkmale 8 , 9 , 10 <su...

Cholera ist eine Erkrankung des distalen Dünndarms, die durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln oder Wasser verursacht wird, die das aquatische Gram-negative Bakterium Vibrio cholerae enthalten. Symptome der Cholera sind Erbrechen und unkontrollierbare wässrige Durchfall, was zu schweren Dehydratation, die, wenn nicht richtig behandelt, wird zum Tod führen. V. Cholerae können in über 200 Serogruppen aufgeteilt werden, basierend auf der Struktur des Zelloberflächen-Lipopolysaccharids O-Antigens. Allerdings haben nur 2 Serogruppen, O1 und O139, epidemisches oder pandemisches Potential 1 , 2 gezeigt . Darüber hinaus ist die Serogruppe O139 in erster Linie nach Südostasien 3 , 4 isoliert, während die Serogruppe O1 weltweit verteilt ist. Darüber hinaus kann die O1-Serogruppe in 2 Haupt-Biotypen unterteilt werden: klassisch und El Tor. Der klassische Biotyp war für die erste 6 Cholera-Pandemie verantwortlichS zwischen 1817 und 1923. Die laufende siebte Pandemie ist ein Ergebnis des El Tor Biotyps, der weltweit den klassischen Biotyp in der Umwelt 5 , 6 , 7 vertrieben hat . In letzter Zeit sind Stämme aufgetreten, die charakteristische Merkmale sowohl der klassischen als auch der El Tor-Biotypen 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 enthalten und seither als El Tor-Varianten 13 , 17 bezeichnet werden . Einige El Tor-Varianten haben erhöhte Virulenz-Fähigkeiten mit einer schnelleren und schweren Krankheitsprogression gezeigt als bisher beobachtet, betontDie Notwendigkeit eines umfassenderen Ansatzes zur Identifizierung von Mitteln und zur Vorbeugung von Krankheiten 8 , 9 , 18 . Während die Biotyp-Identifizierung nicht sofort die Behandlung diktiert, können weitere Fortschritte in der Impfstoffentwicklung und zukünftigen therapeutischen Mitteln von der Biotypunterscheidung profitieren. Die erste Reihe von Protokollen, die hier aufgelistet sind, ermöglicht es den Ermittlern, V richtig zu pflegen. Cholerae-Stämme im Laborbereich. Konsistenz und anschließende Analyse erfordert die Vorbereitung und das Wachstum von Isolaten, die nicht biotypabhängig sind. Um jedoch die Virulenzgenexpression optimal zu induzieren, sind unabhängige biotypspezifische Kultivierungstechniken erforderlich. Darüber hinaus ist die Vorbereitung für verschiedene genetische und biochemische Assays in diesem Manuskript skizziert. Cholera-Toxin (CT) und das Toxin co-reGulf Pilot (TCP) sind zwei Hauptvirulenzfaktoren, die vom Masterregler ToxT in beiden Biotypen des V gesteuert werden. Cholerae O1 serogruppe 20 CT ist ein bipartites Toxin aus fünf CtxB Untereinheiten, die eine einzelne CtxA-Untereinheit umgeben, und ist verantwortlich für den schnellen Elektrolytverlust, der mit Cholera verbunden ist. TCP ist ein Typ-IV-Pilus, der von dem tcp- Operon ( tcpABQCRDSTEF ) codiert wird, und ist an der Anhaftung und Besiedlung des distalen Dünndarms beteiligt. TcpA ist das erste Gen des tcp- Operons, das für die einzelnen Pilinuntereinheiten kodiert, die für den Bau des Pilus 8 wesentlich sind. Die Gensequenz für ctxA ist vollständig zwischen klassischen und El Tor Biotypen konserviert , während ctxB und tcpA sich über die beiden Biotypen unterscheiden, aber in jedem Biotyp 8 konserviert sind. CtxB ist vollständig zwischen Biotypen außer bei zwei Base posi konserviert(115 und 203). Im El-Tor-Biotyp befindet sich Thymin an den Basenpositionen 115 und 203, während der klassische Biotyp an diesen Basen Cytosin enthält. TcpA ist in jedem Biotyp vollständig konserviert, unterscheidet sich aber bei mehreren Basen zwischen Biotypen. Diese genetischen Unterscheidungen dienen als primäre Biotyp-Identifikationsmarker, und nach der Sequenzierung des Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Amplifikationsprodukts einschließlich dieser Stellen können Isolationssequenzen mit Wildtyp (WT) klassischem O395 oder WT El Tor N16961 verglichen werden, um den Biotyphintergrund zu bestimmen Von CT und TCP in einem gegebenen V. cholerae- Isolat. Es wurden zahlreiche Protokolle entwickelt, um die phänotypischen Unterscheidungen zwischen den klassischen und den El Tor Biotypen 21 , 22 , 23 zu charakterisieren. Polymyxin B ist ein Peptid-Antibiotikum, das die Integrität der äußeren Zellmembran im Gram-negativen bac kompromittiertTeria und Polymyxin B-Resistenz können durch den Polymyxin-B-Resistenz-Assay 21 sichtbar gemacht werden. Citrat ist ein primäres Substrat des Kreb-Zyklus, und die Fähigkeit, Citrat als einzige Kohlenstoffquelle zu metabolisieren, kann unter Verwendung des Citratmetabolismus-Assays 22 bestimmt werden . HapR kodiert einen globalen regulator und den master quorum-sensing regulator in V. cholerae, HapR, der an verschiedene Promotorregionen bindet und die Gen- und Operon-Expression 24 reguliert. Einige pathogene Stämme von V. cholerae haben eine natürlich vorkommende Frame-Shift-Mutation im hapR- Gen, die diese dichteabhängige Regulation der Virulenzgenexpression verursacht hat, um 24 , 25 verloren zu werden. Die Messung der HapR-regulierten Protease-Aktivität unter Verwendung von Milch-Agar-Medien ermöglicht es dem Forscher zu identifizieren, ob ein bestimmtes Isolat eine funktionelle HapR 23 enthält . DasHämolyse-Assay-Tests für die Fähigkeit eines Stammes, hämolytische Enzyme zu sezernieren, die rote Blutkörperchen lysieren; Der Grad der Hämolyse kann auf Blut-Agarplatten 23 sichtbar gemacht werden. Die Motilität ist oft mit der Virulenz in V. cholerae assoziiert und kann mit Motilitäts-Agarplatten 23 analysiert werden. Die Voges-Proskauer-Assay-Tests für die Fähigkeit eines Stammes, Glukose als einzige Kohlenstoffquelle zu gären und das Nebenprodukt Acetoin zu produzieren 21 . Mit der Entstehung von El Tor-Varianten ist es schwierig, die Ergebnisse eines gegebenen phänotypischen Assays ohne umfangreiches genotypisches Screening vorherzusagen und vor dem Ableiten des Biotyp-Hintergrunds von V. Cholerae-Isolate ist es empfehlenswert, diese Assemblierung von Assays 23 durchzuführen und die Ergebnisse mit Referenzstämmen wie in Tabelle 2 zu vergleichen. Hier haben wir eine Reihe von Protokollen vorgestellt, die gemeinsam den Vorläufer nutzenGenotypische und phänotypische Assays für einen umfassenderen Ansatz zur Charakterisierung von V. Cholerae biotypen Darüber hinaus haben wir die genotypischen und phänotypischen Unterscheidungen der bekannten V beschrieben. Cholerae El Tor-Varianten (MQ1795 und BAA-2163) im Vergleich zu den üblicherweise verwendeten Biotyp-Referenzstämmen (WT-Klassik O395, WT El Tor C6706 und WT El Tor N16961, Tabelle 1 ). Die Entstehung von El Tor-Varianten hat Herausforderungen für die Zuverlässigkeit von zuvor eingesetzten Single-Assay-Biotyp-Charakterisierungsprotokollen herausgestellt; Dieses Mehrfach-Assay-Identifizierungssystem wird jedoch eine zuverlässigere Charakterisierung von klinischen und ökologischen V ermöglichen. Cholerae isoliert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1403">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:183px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:171px;">N3232S</td>
			<td style="width:683px;">https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60% Glycerol</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>356352</td>
			<td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Becto, Dickinson and Co.</td>
			<td>214030</td>
			<td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&#38;parentCategory=&#38;parentCategoryName=&#38;categoryId=&#38;categoryName=&#38;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar with brain-heart infusion</td>
			<td>Becto, Dickinson and Co.</td>
			<td>237500</td>
			<td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&#38;parentCategory=&#38;parentCategoryName=&#38;categoryId=&#38;categoryName=&#38;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>732-2789</td>
			<td>https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&#38;_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&#38;_dynSessConf=1766917479792147141&#38;targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&#38;lastLanguage=en&#38;/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&#38;_D%3AcurrentLanguage=+&#38;currentLanguage=en&#38;_D%3AlastLanguage=+&#38;_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anhydrous K2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P288-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&#38;searchTerm=P288500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blood Agar Plates</td>
			<td>Remel</td>
			<td>R01200</td>
			<td>Store at 4 &#176;C;&#160; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A73-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&#38;searchTerm=A73500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromothymol Blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B388-10</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&#38;searchTerm=B38810&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cirtric acid &#183;H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S72836-3</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Store at -20 &#176;C;&#160; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&#38;searchTerm=S311500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Clean &#38; Concentrator&#8482; -25 Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4007</td>
			<td>http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GelGreen Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41005</td>
			<td>https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10000x-in-water/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>840-208100</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158567</td>
			<td>https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Corrosive;&#160; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&#38;searchTerm=A144212&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&#38;searchTerm=P217500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&#38;searchTerm=P285500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&#38;searchTerm=P250500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Le Loop</td>
			<td>Decon Labs Inc.</td>
			<td>MP190-25</td>
			<td>http://deconlabs.com/products/leloop/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Le Stab</td>
			<td>Decon Labs Inc.</td>
			<td>MP186-5</td>
			<td>http://deconlabs.com/products/lestab/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&#38;searchTerm=M63500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Bio Rad Labs</td>
			<td>1704406</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&#38;WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&#38;WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MR-VP Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>216300</td>
			<td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&#38;parentCategory=&#38;parentCategoryName=&#38;categoryId=&#38;categoryName=&#38;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&#38;searchTerm=S374500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&#38;searchTerm=S27110&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&#38;searchTerm=S233500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaNH4HPO4&#183;4H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S218-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&#38;searchTerm=S218500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoDrop Lite Spectrophtometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-LITE-PR</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonfat dry milk</td>
			<td>Nestle Carnation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td>Becto, Dickinson and Co.</td>
			<td>211677</td>
			<td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&#38;parentCategory=&#38;parentCategoryName=&#38;categoryId=&#38;categoryName=&#38;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dishes (100 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dishes (150 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714</td>
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			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td>Store at -20 &#176;C;&#160; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
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		</tr>
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			<td>9310</td>
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		</tr>
		<tr height="21">
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			<td>Becto, Dickinson and Co.</td>
			<td>212750</td>
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		</tr>
		<tr height="21">
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			<td>MP Biomedicals</td>
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			<td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory techniques used to maintain and differentiate biotypes of vibrio cholerae clinical and environmental isolates

Das aquatische Gram-negative Bakterium Vibrio cholerae ist der ätiologische Wirkstoff der infektiösen Magen-Darm-Cholera. Wegen der globalen Prävalenz und Schwere dieser Krankheit, V. Cholerae wurde sowohl im Umwelt- als auch im Laborbereich umfassend untersucht und erfordert eine ordnungsgemäße Instandhaltungs- und Kultivierungstechniken. Klassik und El Tor sind zwei Hauptbiotypen, die das V bilden . Cholerae O1 Serogruppe, die jeweils einzigartige genotypische und phänotypische Eigenschaften aufweisen, die zuverlässige Mechanismen für die Biotypcharakterisierung liefern und unterschiedliche Virulenz induzierende Kultivierungsbedingungen erfordern. Unabhängig von der Biotype des ursächlichen Stammes für jede gegebene Infektion oder Ausbruch, die Standard-Behandlung für die Krankheit beinhaltet Rehydratationstherapie ergänzt mit einem Regime von Antibiotika. Allerdings kann eine Biotyp-Klassifikation für Laboruntersuchungen erforderlich sein und kann im biomedizinischen Bereich breitere Auswirkungen haben.In den frühen 2000er Jahren wurden klinische Isolate identifiziert, die genotypische und phänotypische Merkmale sowohl von klassischen als auch von El Tor Biotypen aufweisen. Die neu identifizierten Hybriden, die als El Tor-Varianten bezeichnet wurden, haben dazu geführt, dass die klinische und ökologisch isolierte Biotypidentifikation komplexer wird als die bisherigen traditionellen Einzelassay-Identifikationsprotokolle. Neben der Beschreibung von V. Cholerae-Instandhaltungs- und Kultivierungstechniken beschreibt dieses Manuskript eine Reihe von gen- spezifischen ( ctxB- und tcpA ) PCR-basierten genetischen Bildschirmen und phänotypischen Assays (Polymyxin B-Resistenz, Citrat-Metabolismus, proteolytische Aktivität, hämolytische Aktivität, Motilität und Glukosestoffwechsel über Voges- Proskauer-Assay), der gemeinsam zur Charakterisierung und / oder Unterscheidung zwischen klassischen und El-Tor-Biotypen verwendet wird. Gemeinsam bieten diese Assays einen effizienten systematischen Ansatz als Alternative oder zusätzlich zu kostspieligen, arbeitsintensiven Experimenten in der CharakteristikVon V. Cholerae klinische (und umwelt-) isolate.

Für die ordnungsgemäße Instandhaltung und Verwendung von Bakterienstämmen empfiehlt es sich, die Verdopplungszeit der betreffenden Stämme zu kennen. Hierbei sind die unterschiedlichen Wachstumsraten der üblichen V Cholerae-Stämme wurden durch eine Wachstumskurve nachgewiesen, und ungefähre Verdopplungszeiten wurden unter Verwendung einer linearen Regression berechnet. WT El Tor N16961 und El Tor Variante MQ1795 zeigten kürzere Verdopplungszeiten (~ 1 h bzw. ~ 1 h) als W...

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Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Dieses Manuskript beschreibt die richtigen Vibrio Cholerae-Instandhaltungstechniken zusätzlich zu einer Reihe von biochemischen Assays, die gemeinsam für eine schnelle und zuverlässige Differenzierung zwischen klinischen und ökologischen V verwendet werden. Cholerae-Biotypen im Laborbereich.

Labortechniken zur Aufrechterhaltung und Differenzierung von Biotypen von<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Klinische und umweltliche Isolate

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

laboratory-techniques-used-to-maintain-differentiate-biotypes-vibrio

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

10.8K Aufrufe.  Plymouth State University.  Dieses Manuskript beschreibt die richtigen Vibrio Cholerae-Instandhaltungstechniken zusätzlich zu einer Reihe von biochemischen Assays, die gemeinsam für eine schnelle und zuverlässige Differenzierung zwischen klinischen und ökologischen V verwendet werden. Cholerae-Biotypen im Laborbereich. 

Serie: Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

Multiplex Nachweis von Bakterien in komplexen Clinical and Environmental Proben mit Oligonukleotid-gekoppelten Fluoreszenz-Mikrosphären

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

Colonization von Euprymna scolopes Squid durch Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - Eine Methode zur genetischen Veränderung<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; On Natural Transformation und FLP-Rekombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better characterize the prevalence of these pathogens, EPA Method 1623 was developed and used to monitor levels of these organisms in US drinking water supplies 12. The method has three main parts; the first is the sample concentration in which at least 10 L of raw surface water is filtered. The organisms and trapped debris are then eluted from the filter and centrifuged to further concentrate the sample. The second part of the method uses an immunomagnetic separation procedure where the concentrated water sample is applied to immunomagnetic beads that specifically bind to the Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts allowing for specific removal of the parasites from the concentrated debris. These (oo)cysts are then detached from the magnetic beads by an acid dissociation procedure. The final part of the method is the immunofluorescence staining and enumeration where (oo)cysts are applied to a slide, stained, and enumerated by microscopy.
Method 1623 has four listed sample concentration systems to capture Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts in water: Envirochek filters (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV filters (Pall Corporation), Filta-Max filters (IDEXX, Westbrook, MA), or Continuous Flow Centrifugation (Haemonetics, Braintree, MA). However, Cryptosporidium and Giardia (oo)cyst recoveries have varied greatly depending on the source water matrix and filters used1,14. A new tangential flow hollow-fiber ultrafiltration (HFUF) system has recently been shown to be more efficient and more robust at recovering Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from various water matrices; moreover, it is less expensive than other capsule filter options and can concentrate multiple pathogens simultaneously1-3,5-8,10,11. In addition, previous studies by Hill and colleagues demonstrated that the HFUF significantly improved Cryptosporidium oocysts recoveries when directly compared with the Envirochek HV filters4. Additional modifications to the current methods have also been reported to improve method performance. Replacing the acid dissociation procedure with heat dissociation was shown to be more effective at separating Cryptosporidium from the magnetic beads in some matrices9,13 .
This protocol describes a modified Method 1623 that uses the new HFUF filtration system with the heat dissociation step. The use of HFUF with this modified Method is a less expensive alternative to current EPA Method 1623 filtration options and provides more flexibility by allowing the concentration of multiple organisms.

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

This protocol describes the use of a tangential flow hollow-fiber ultrafiltration sample concentration system and a heat dissociation as alternative steps for the detection of waterborne Cryptosporidium and Giardia species using EPA Method 1623.

Eine Änderung, die EPA-Methode 1623 Tangential Flow Hohlfaser-Ultrafiltration und Wärme Dissoziationsstufen nutzt, um auf Wasserbasis Detect<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Und<em&gt; Giardia spp.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor treatment options exist. The hallmarks of these laboratories are: custom-designed airtight doors, dedicated supply and exhaust airflow systems, a negative-pressure environment, and mandatory use of positive-pressure (&#8220;space&#8221;) suits. The risk for laboratory specialists working with highly pathogenic agents is minimized through rigorous training and adherence to stringent safety protocols and standard operating procedures. Researchers perform the majority of their work in BSL-2 laboratories and switch to BSL-4 suit laboratories when work with a high-consequence pathogen is required. Collaborators and scientists considering BSL-4 projects should be aware of the challenges associated with BSL-4 research both in terms of experimental technical limitations in BSL-4 laboratory space and the increased duration of such experiments. Tasks such as entering and exiting the BSL-4 suit laboratories are considerably more complex and time-consuming compared to BSL-2 and BSL-3 laboratories. The focus of this particular article is to address basic biosafety concerns and describe the entrance and exit procedures for the BSL-4 laboratory at the NIH/NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Such procedures include checking external systems that support the BSL-4 laboratory, and inspecting and donning positive-pressure suits, entering the laboratory, moving through air pressure-resistant doors, and connecting to air-supply hoses. We will also discuss moving within and exiting the BSL-4 suit laboratories, including using the chemical shower and removing and storing positive-pressure suits.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Although researchers are generally knowledgeable about procedures and safety precautions required for biosafety level 1 or 2 (BSL-1/2) experiments, they may not be familiar with experimental procedures in BSL-4 suit laboratories. This article provides a detailed visual demonstration of BSL-4 suit laboratory systems check, laboratory entry, movement, and exit procedures.

Sicherheitsvorkehrungen und Betriebsverfahren in einem (A) BSL-4-Labor: 1. Biosafety Level 4 Anzug Labor Suite Einreise- und Ausreiseverfahren

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Eine schnelle Strategie für die Isolierung neuer Faustoviruses von Umweltproben unter Verwendung von<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

eine Speichel- Antikörper Multiplex-Immunoassay Entwicklung der Humanexposition Umwelt Pathogens zu messen

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Entwicklung eines sensitiven und spezifischen chromogenen Agar Medium zum Nachweis von<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Und andere<em&gt; Vibrio</em&gt; Arten

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for quantitative analysis of cell surface proteins on immune cells, but it provides no information on the localization and migration patterns of these cells within the lung. Similarly,&#160;chemotaxis assays can be performed to study the potential of cells to respond to chemotactic factors in vitro, but these assays do not reproduce the complex environment of the intact lung. In contrast to these aforementioned techniques, the location of individual cell types within the lung can be readily visualized by generating Precision-cut Lung Slices (PCLS), staining them with commercially available, fluorescently tagged antibodies, and visualizing the sections by confocal microscopy. PCLS can be used for both live and fixed lung tissue, and the slices can encompass areas as large as a cross section of an entire lobe. We have used this protocol to successfully visualize the location of a wide variety of cell types in the lung, including distinct types of dendritic cells, macrophages, neutrophils, T cells and B cells, as well as structural cells such as lymphatic, endothelial, and epithelial cells. The ability to visualize cellular interactions, such as those between dendritic cells and T cells, in live, three-dimensional lung tissue, can reveal how cells move within the lung and interact with one another at steady state and during inflammation. Thus, when used in combination with other procedures, such as flow cytometry and quantitative PCR, PCLS can contribute to a comprehensive understanding of cellular events that underlie allergic and inflammatory diseases of the lung.

We describe a method for generating Precision-cut Lung Slices (PCLS) and immunostaining them to visualize the localization of various immune cell types in the lung. Our protocol can be extended to visualize the location and function of many different cell types under a variety of conditions.

Precision-cut Maus Lung Slices Live-Pulmonary Dendritische Zellen sichtbar zu machen

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...