Name: enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain
Uploaded: 2017-10-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
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Die Autoren danken Dr. Jim Lah und Allan Levey, Emory Universitätsklinik für Neurologie, für die hilfreichen Kommentare und Anregungen. Diese Arbeit wurde teilweise finanziert durch die Beschleunigung der Medizin Partnerschaft Grant (U01AG046161-02), die Emory Alzheimer Disease Research Center (P50AG025688) und eine National Institute on Aging gewähren (R01AG053960-01) N.T.S. Diese Forschung wurde auch teilweise durch die Neuropathologie Kern von Emory Neurowissenschaften NINDS Core Facilities Grant, P30NS055077 unterstützt.

Ethik-Erklärung: alle Hirngewebe stammen aus der Emory Alzheimer &#39; s Disease Research Center (ADRC) Brain Bank. Post-mortem Gewebe unter richtigen institutionellen Review Board (IRB) Protokolle erworben wurden.
 1. Homogenisierung und Fraktionierung <ol><li>Gewebe Auswahl Hinweis: Frozen Post-mortem frontalen Kortex Gewebe aus gesunden Kontrolle (Ctl) und pathologisch bestätigten AD-Fälle wurden ausgewählt von der Emory ADRC Gehirn Bank (n = 2). Post-Mortem neuropathologische Auswertung der Amyloid-Plaques Verteilung wurde entsprechend des Konsortiums, eine Registrierung für Alzheimer zu etablieren durchgeführt &#39; s Krankheit semi-quantitativen Kriterien 24, scoring, obwohl neurofibrillären Gewirr Pathologie wurde gemäß der Braak-staging-System bewertet. 16 <ol><li>erhalten Post-mortem Hirngewebe von gesunden Kontrolle (Ctl) und pathologisch eingefroren bestätigt AD-Fälle. Verwendung von Containern von Trockeneis, Zange und einer Rasierklinge, Verbrauchsteuern ~ 250 mg Teile der grauen Substanz aus jede Gewebeprobe auf tarierten Einweg wiegen Boote, kümmert sich um Auftauen des Gewebes zu verhindern. Nehmen Sie das Gewicht jedes Stückes, homogenisiert werden.</li>
		<li>Verbrauchsteuern ~ 250 mg der grauen Zellen mit Zange und gestochen von visuell inspizieren, um die Schnittstelle zwischen der äußeren graue Substanz und inneren weißen Substanz zu finden. Vermeiden Sie weiße Substanz und was noch wichtiger ist, alle großen Blutgefäße oder blutigen Regionen, Hirnhäute oder Arachnoidea Mater. Halten Sie das Gewebe eingefroren während des Schneidprozesses indem arbeiten schnell und häufig mit einem Gewicht von Boot mit Hirngewebe in Polystyrol-Behälter mit trocken Ice</li>
		<li>Datensatz das exakte Gewicht der grauen Substanz, die aus jedem gefrorenen Stück mit Hilfe einer Analysenwaage herausgeschnitten. Berechnen Sie das Volumen des wenig Salz (LS) Puffer für Dounce Homogenisierung (5 mL/g oder 20 % w/V) benötigt (siehe Tabelle 1).</li>
		<li>Vorbereitung 10 mL LS Puffer mit 1 x Protease und Phosphatase-Inhibitor cocktail und chill auf Eis.</li>
		<li>Entfernen Sie wog Gewebe und mit einem Gewicht von Boot aus Trockeneis und Würfel in etwa 2 x 2 mm Stücke wie es taut. Transfer zu einem 2 mL vorgekühlt Dounce Homogenisator Schlauch auf Ice</li>
		<li>5 mL/g (20 % w/V) der eiskalten wenig Salz (LS) Puffer mit 1 X Protease und Phosphatase-Inhibitor cocktail hinzufügen.</li>
		<li>Homogenize das Hirngewebe auf Eis mit etwa 10 Schläge von hoher Bodenfreiheit Stößel A und 15 Hübe der niedrige Clearance Stößel B.</li>
		<li>Alle Homogenat auf ein 2 mL Polypropylen-Rohr mit einem Glas Pasteurpipette übertragen. Beschriften der Röhrchen mit &#8220; TH &#8221; (insgesamt Homogenat), das Gewebe Fall Nummer und homogenisierte Volumen. aliquoten 0,8 mL in einem beschrifteten 1,5 mL-Tube. Jede überschüssige Homogenat kann ähnlich sein, regelmÄÑig und gespeicherte bei-80 ° c</li>
		<li>Zu je 0,8 mL Aliquoten, bzw. 100 µL 5 M NaCl und 10 % (w/V) Sarkosyl zu Konzentrationen von 0,5 M und 1 % w/V, hinzufügen. Mischen Sie Rohre gut durch Umkehrung und inkubieren Sie auf Eis für 15 min. Label Rohre mit &#34; TH-S &#34; (insgesamt Homogenat-Sarkosyl) darauf hin, dass die Homogenates in Sarkosyl-Puffer (Tabelle 1).</li>
		<li>Beschallen jedes Rohr für drei 5 s-Pulse bei 30 % Amplitude auf Eis (maximale Intensität = 40 %) mit einer Sonde Microtip.</li> <li>bestimmen die Proteinkonzentrationen von der Homogenates mit der Bicinchoninic Säure (BCA) assay 25 Methode. 
		Hinweis: Die durchschnittliche Proteinkonzentration von TH-S Homogenates in 5 mL LS pro Gramm Gewebe vorbereitet ist 15-20 mg/mL. Die Homogenates fraktioniert sofort oder bis zur Verwendung bei-80 ° C gelagert werden kann.</li>
		<li>Verdünnen TH-S Homogenates bis 10 mg/mL mit eiskalten Sark Puffer (Tabelle 1) mit 1 x Phosphatase, Protease-Inhibitoren.</li>
		<li>Transfer 5 mg Protein (0,5 mL) von jeder TH-S Homogenat in 500 µL Polycarbonat Ultrazentrifugen Tuben und paar-Balance mit Sark-Puffer. Laden Sie Rohre in einem vorgekühlt Rotor und Ultrazentrifugen 180.000 x g für 30 min bei 4 ° c Übertragung Sarkosyl lösliche Überstände (S1) auf 1,5 mL Röhrchen und Lagern bei-80 ° c 
		Hinweis: (Optional-Waschanlagen) fügen Sie 200 µL Sark-Puffer, der Ultrazentrifuge Rohre mit Waschmittel-unlösliche Fraktionen (P1) und verdrängen die Pellets (P1) von der Unterseite der Ultrazentrifuge Rohre mit einer Pipettenspitze 200 µL.</li>
		<li>Kurz Puls-Spin die invertierten Rohre für 2-3 s (&#8804; 2.500 X g) auf einem Microcentrifuge der Pellets (P1) und Puffer auf die 1,5 mL Röhrchen unten übertragen. Aufschwemmen der unlöslichen Pellets (P1) im Sark-Puffer durch Pipettieren rauf und runter um sicherzustellen das Pellet wird gestört,.</li>
		<li>Paar-Balance und Zentrifuge bei 180.000 x g für eine zusätzliche 30 min bei 4 ° c</li>
		<li>Verwerfen den optionalen waschen überstand (S2) und inkubieren Sie die Sarkosyl-unlösliche Pellets (P2) in 50-75 µL Harnstoff Puffer (Tabelle 1) mit 1 x PIC (Protease und Phosphatase-Inhibitor cocktail) für 30 min bei Raumtemperatur zu solubilisieren die Pellet. 
		Hinweis: Warme Harnstoff Puffer auf Raumtemperatur vor Gebrauch SDS Niederschlag zu vermeiden. Für Waschmittel-Sensitive Anwendungen weglassen SDS aus Harnstoff Puffer und in niedrigen Salz Puffer betrachten waschen das unlösliche Pellet (P2), bevor in Harnstoff Puffer resuspending.</li>
		<li>Übertragen die resuspendierte Pellets (P2) auf 0,5 mL Röhrchen und verwenden Sie kurze (1 s) Microtip Beschallung bei 20 % Amplitude (maximale Intensität = 40 %), voll die Pellets solubilisieren.</li>
		<li>Bestimmen die Proteinkonzentrationen von Sarkosyl löslich (S1) und unlösliche (P2) Brüche mit der BCA assay Methode. Diese Fraktionen sofort verwenden oder bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunoblotting <ol><li>Western Blot Hinweis: Western blotting nach zuvor gemeldeten Verfahren mit leichten Modifikationen durchgeführt wurde. 5 , 10 <ol><li>bereiten 40 µg Proben von insgesamt Homogenates (TH-S), Sark-löslich (S1) und Sark-unlösliche (P2) Brüche in 1 X Laemmli SDS-Page-Probenpuffer mit 5 mM DÄMMUND pH 7. Inkubieren Sie Proben bei 95 ° C für 5 min.</li>
		<li>Last Proben auf ein Fertigteil 10-Brunnen 4-12 % Bis-Tris SDS-PAGE gel. Bei 80 V für die ersten Zentimeter (10 min) und 120 V für den Rest (60 min) oder bis die Tracking-Farbstoff den Boden des Gels erreicht electrophorese.</li>
		<li>Verwenden Sie frischen Rasierklinge und Gel Messer auf Split-die vorgegossenen Gel-Kassette offen. Sanft die Kämme und ganz unten das Gel mit einer frischen Rasierklinge wegschneiden.</li>
		<li>Aufschwemmen der unlöslichen Pellets (P1) in 200 µl Sark-Puffer mit 1 X PIC durch Pipettieren rauf und runter.</li>
		<li>Übertragung an eine 0,2 µm Nitrozellulose-Membran mit einer trockenen Übertragungsmethode auf ein Blot Maschine (siehe der Materialtabelle).</li>
		<li>Blockieren die Membran in blockierende Puffer (BB) ohne Tween 20 für 30 min, gefolgt mit BB mit 0,05 % Tween 20 (BB/T) für 30 min. Nach der Blockierung, spülen Sie die Membran in TBS/T (0,1 % Tween 20) für 5 min um überschüssige blockierende Puffer entfernen.</li>
		<li>Bereiten 1:1,000 Verdünnungen der primären Antikörper pT231, Tau-2 (Pan Tau), AT8 und EEA1 in BB/T (0,05 % Tween 20).</li>
		<li>Brüten die Membranen in Primärantikörper Lösung über Nacht bei 4 ° C mit kreisförmigen Bewegung. Spülen Sie die Membran in TBS/T für 3 x 15 min.</li>
		<li>Sonde die Membran mit einer Verdünnung 1: 20.000 Eindringmittel beschriftet in der Nähe von IR Sekundärantikörper in BB/T für 60 min bei Raumtemperatur in Dunkelheit auf Shaker. Spülen Sie die Membran für 3 x 10 min in TBS/T und 2 x 5 min in El</li>
		<li>Scannen die Membran, die über eine Infrarot imaging-System bei der entsprechenden Erregung Wellenlänge (z.B. 700 nm (Rot-Kanal) für Infrarot-Farbstoff 680 Ziege Anti-Maus IgG (H + L) sekundär- und 800 nm (Grün-Kanal) für Infrarot-Farbstoff 790 Esel Anti-Kaninchen IgG (H + L (sekundäre)).</li>
		<li>Verwenden die Software zur Abbilderstellung Signalintensitäten zu quantifizieren und Densitometrie Messungen gemäß den Hersteller &#39; Anweisungen, Auto-Hintergrund zu gewährleisten wird voraussichtlich den gesamten Hintergrund durchschnittliche.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier wir vorstellen und diskutieren eine abgekürzte Einzelschritt Waschmittel-Fraktionierung-Protokoll, die für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen von Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen bis hin zu funktionellen Protein misfolding assays und westliche Beflecken. 5 , 6 , 7 , 10 dieser Methodik ist vielleicht die meisten wirksam, wenn Sie zur Untersuchung neurodegenerati...

Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD), Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und die eng verwandten Prion-Krankheiten sind gekennzeichnet durch die allmähliche Anhäufung von proteinopathies Waschmittel-unlösliche Aggregate im Gehirn mit begleitenden kognitiven ablehnen. 1 , 2 diese gemeinsame pathologische Funktion wird gedacht, um eine zentrale Rolle in der Ätiologie und Pathophysiologie dieser neurodegenerativen Krankheiten. 2 diese Aggregate bestehen typischerweise aus Polymeren Amyloid Fasern, die zusammengesetzt sind, sich wiederholender Einheiten der fehlgefaltete Protein ausstellenden Kreuz β-Struktur. 1 , 2 , 3 , 4 biochemisch, Amyloid Aggregate sind sehr widerstandsfähig gegen chemische oder thermische Denaturierung und Solubilisierung,3 stellt besondere Herausforderungen an ihre Reinigung, Analyse und über traditionelle biochemischen Techniken zu studieren. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 es überrascht nicht, wurde die Waschmittel-unlösliche Proteinfraktion viel Forschungsschwerpunkt in der Pathophysiologie der neurodegenerativen Erkrankungen mit der Anhäufung von fehlgefaltete Proteine. 6 , 12 , 13 , 14
Biochemische Fraktionierung Techniken wurden oft genutzt, um die Reinigungsmittel-unlösliche Fraktion aus Post-mortem Gehirn Homogenates bereichern. 6 , 12 , 13 , 14 eine der am häufigsten verwendeten Methoden beinhaltet die sequentielle Extraktion von Gewebe Homogenates mit Puffern und Reinigungsmittel erhöhen Stringenz, gefolgt von Ultrazentrifugation, die löslichen und unlöslichen Anteile zu partitionieren. Eine häufig verwendete sequentielle Fraktionierung Protokoll6,14 beinhaltet die Homogenisierung der gefrorene Gewebeproben in einem Waschmittel-freie wenig Salz (LS)-Puffer und die daraus resultierende unlösliche Pellets werden dann nacheinander mit extrahiert Puffer mit hohen Salz, nichtionischen Detergentien, hohen Saccharose, wie Ionischen Detergentien und schließlich Chaotropes Harnstoff. 6 , 14 eine offensichtliche Nachteil solch eine sequentielle Fraktionierung Protokolle ist die beträchtliche Zeit und Arbeit Engagement erforderlich, um sie abzuschließen. Einschließlich der Homogenisierung und Ultrazentrifugation, eine typische 5-stufige Fraktionierung Protokoll dauert mehrere Stunden oder sogar Tage dauern. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 darüber hinaus möglichst viele pathologische Proteinaggregaten unlöslich in allen außer den härtesten Bedingungen19,20 bleiben die meisten der erzeugten Brüche sind nur von begrenztem Wert. Somit sind die weniger strengen Fraktionierung Schritte nutzen hohe Salzkonzentrationen und nichtionische Detergentien weitgehend überflüssig.
Frühere Studien haben gezeigt, dass die ionische Waschmittel N-Natriumlaurylsulfat-Sarkosin (Sarkosyl) ein ausgezeichneter Kandidat für einen vereinfachten einstufigen Waschmittel Fraktionierung Protokoll ist. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 als denaturierenden Waschmittel, Sarkosyl ist streng genug, um die überwiegende Mehrheit der nativ gefaltete Proteine im Gehirn anderweitig ohne Gefäss-fehlgefaltete Protein-Aggregate bestehend aus Beta-Amyloid (Aβ),6,11 phosphorylierten Tau (pTau),6 TAR DNA-bindendes Protein 43 (TDP-43),14 Alpha-Synuclein,12,13 Scrapie,23 oder U1 small nuclear Ribonucleoproteins (U1 SnRNPs) wie U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Da Sarkosyl weniger streng als die allgegenwärtigen anionische Detergenzien Dodecyl Natriumsulfat (SDS) ist, bewahrt es weniger robuste Oligomere Formen von fehlgefaltete Protein-Aggregate, die SDS-Behandlung nicht standhalten können. 9
Zuvor beschrieben wir eine abgekürzte Waschmittel-Fraktionierung-Protokoll, das vergleichbar mit aufwendiger sequentielle Fraktionierung Methoden Ergebnisse erzielt. 5 durch die weniger strenge Fraktionierung Schritte auslassen, konnten wir ein facile Einzelschritt Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn zu entwickeln. 5 dieses ausführliche Protokoll beschriebenen eignet sich gut für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen reichen von Western blotting und Massenspektrometrie-basierte Proteomics, funktionsfähiges Protein misfolding und Aggregation seeding assays. 5 , 6 , 21

<table><tbody><tr><td>Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>78441</td><td>protease &amp;amp; phosphatase inhibitor cocktail</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB505110</td><td>microtip ultrasonicator</td></tr><tr><td>Optimax TLX Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>361545</td><td>refrigerated ultracentrifuge</td></tr><tr><td>TLA120.1 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>362224</td><td>ultracentrifuge rotor</td></tr><tr><td>500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td>ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor</td></tr><tr><td>4X SDS sample buffer</td><td>Home-made</td><td>N/A</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TCEP solution, neutral pH</td><td>Thermo Fisher</td><td>77720</td><td>reducing agent</td></tr><tr><td>(TBS) blocking buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>37542</td><td>blocking buffer</td></tr><tr><td>(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20</td><td>Thermo Fisher</td><td>37543</td><td>blocking buffer and antibody diluent</td></tr><tr><td>4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well</td><td>Thermo Fisher</td><td>NW04120BOX</td><td>precast SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>MES SDS Running Buffer (20X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>B0002</td><td>SDS-PAGE running buffer</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5777-50G</td><td>detergent</td></tr><tr><td>Anti-Tau-2 (pan tau) antibody</td><td>Chemicon</td><td>MAB375</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB5450</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)</td><td>Thermo Fisher</td><td>MN1020</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody</td><td>abcam</td><td>ab2900</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21058</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11374</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>iBlot2 Dry Blotting System</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB21001</td><td>Gel transfer</td></tr><tr><td>iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB23002</td><td>Gel transfer</td></tr></tbody></table>

enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain

In dieser Studie beschreiben wir eine abgekürzte Einzelschritt Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn. Das Ionische Waschmittel N-Natriumlaurylsulfat-Sarkosin (Sarkosyl) solubilisiert effektiv nativ gefaltete Proteine im Gehirngewebe, so dass die Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate aus einer breiten Palette von neurodegenerativen Proteinopathies, wie Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson und Amyotrophe Lateralsklerose und Prion-Krankheiten. Menschlichen Kontrolle und Post-mortem Hirngewebe AD wurden homogenisiert und sedimentierte durch Ultrazentrifugation in Anwesenheit von Sarkosyl Waschmittel-unlösliche Aggregate einschließlich pathologischer phosphorylierten Tau, das Herzstück der neurofibrillären bereichern Verwicklungen in AD. Westliche Beflecken, demonstriert die differenzielle Löslichkeit der aggregierten phosphoryliert-Tau und die Waschmittel-lösliche Protein, frühen Endosom Antigen 1 (EEA1) in Steuerung und AD Gehirn. Proteomic Analysen ergaben auch Bereicherung der β-Amyloid (Aβ), Tau, snRNP70 (U1 - 70 K), und Apolipoprotein E (APOE) in die Sarkosyl-unlösliche Bruchteilen von AD Gehirn im Vergleich zu denen der Kontrolle, konsistent mit früheren Gewebe Fraktionierung Strategien . Somit eignet sich dieses einfache Bereicherung-Protokoll für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen reichen von Western blotting und funktionsfähiges Protein Co Aggregation Assays, Massenspektrometrie-basierte Proteomics.

Das abgekürzte einstufigen Sarkosyl-Fraktionierung-Protokoll wurde verwendet, um Waschmittel-unlösliche Aggregate aus Kontrolle und AD Post-mortem Gehirn (Abbildung 1) zu bereichern. Proteine aus TH-S, S1, S2 und P2 Fraktionen wurden gelöst durch SDS-PAGE, für 15 min in Coomassie Blau Fixativ Puffer gefolgt von schonende Färbung mit Coomassie Brilliant Blue G-250 Färbung Puffer fest. Die Wiederfreisetzung Schritt ist optional, da gab es nicht nachweisba...

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Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Eine abgekürzte Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn wird beschrieben.

Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.0K Aufrufe.  Emory School of Medicine. Eine abgekürzte Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn wird beschrieben.

Serie: Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's disease pathogenesis1. A&beta; is predominantly a 40- or 42-amino acid peptide that is prone to self-aggregation into &beta;-sheet-rich amyloid fibrils that are found in the cores of cerebral senile plaques in Alzheimer's disease. Increasing evidence suggests that low molecular weight, soluble A&beta; multimers are more toxic than fibrillar A&beta; amyloid2. The identification and quantification of low- and high-molecular weight multimeric A&beta; species in brain tissue is an essential objective in Alzheimer's disease research, and the methods employed also can be applied to the identification and characterization of toxic multimers in other proteopathies3. Naturally occurring A&beta; multimers can be detected by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis followed by immunoblotting with A&beta;-specific antibodies. However, the separation and detection of multimeric A&beta; requires the use of highly concentrated cortical homogenates and antigen retrieval in small pore-size nitrocellulose membranes. Here we describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, separation of proteins by SDS-PAGE, and antigen-epitope retrieval/Western blotting with antibody 6E10 to the N-terminal region of the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect A&beta; monomers, dimers, trimers, tetramers, and higher molecular weight multimers in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&#946; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

We describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, protein separation by SDS-PAGE, antigen retrieval and immunoblotting with an antibody to the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect monomeric and multimeric A&beta; in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

SDS-PAGE/Immunoblot Detektion von Aß Multimere in Human Kortikale Gewebehomogenaten mit Antigen-Epitope Retrieval

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform PrPSc 1. PrPC is detergent-soluble and sensitive to proteinase K (PK)-digestion, whereas PrPSc forms detergent-insoluble aggregates and is partially resistant to PK2-6. The conversion of PrPC to PrPSc is known to involve a conformational transition of &alpha;-helical to &beta;-sheet structures of the protein. However, the in vivo pathway is still poorly understood. A tentative endogenous PrPSc, intermediate PrP* or "silent prion", has yet to be identified in the uninfected brain7.
Using a combination of biophysical and biochemical approaches, we identified insoluble PrPC aggregates (designated iPrPC) from uninfected mammalian brains and cultured neuronal cells8, 9. Here, we describe detailed procedures of these methods, including ultracentrifugation in detergent buffer, sucrose step gradient sedimentation, size exclusion chromatography, iPrP enrichment by gene 5 protein (g5p) that specifically bind to structurally altered PrP forms10, and PK-treatment. The combination of these approaches isolates not only insoluble PrPSc and PrPC aggregates but also soluble PrPC oligomers from the normal human brain. Since the protocols described here have been used to isolate both PrPSc from infected brains and iPrPC from uninfected brains, they provide us with an opportunity to compare differences in physicochemical features, neurotoxicity, and infectivity between the two isoforms. Such a study will greatly improve our understanding of the infectious proteinaceous pathogens. The physiology and pathophysiology of iPrPC are unclear at present. Notably, in a newly-identified human prion disease termed variably protease-sensitive prionopathy, we found a new PrPSc that shares the immunoreactive behavior and fragmentation with iPrPC 11, 12. Moreover, we recently demonstrated that iPrPC is the main species that interacts with amyloid-&beta; protein in Alzheimer disease13. In the same study, these methods were used to isolate Abeta aggregates and oligomers in Alzheimer's disease13, suggesting their application to non-prion protein aggregates involved in other neurodegenerative disorders.

A new species of cellular prion protein (PrPC) has recently been identified in uninfected human brains using the methods described here. These methods can be used to isolate various PrP species, while some of them are also useful in isolating other misfolded protein aggregates from human brains.

Isolierung von löslicher und unlöslicher PrP Oligomere in das normale menschliche Gehirn

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Medizin

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, little is known about changes in neuronal chromatin and nuclear organization during the course of development and aging, or in chronic neuropsychiatric disease. However, to date most chromatin and DNA based assays (other than FISH) lack single cell resolution. To this end, the considerable cellular heterogeneity of brain tissue poses a significant limitation, because typically various subpopulations of neurons are intermingled with different types of glia and other non-neuronal cells. One possible solution would be to grow cell-type specific cultures, but most CNS cells, including neurons, are ex vivo sustainable, at best, for only a few weeks and thus would provide an incomplete model for epigenetic mechanisms potentially operating across the full lifespan.  Here, we provide a protocol to extract and purify nuclei from frozen (never fixed) human postmortem brain. The method involves extraction of nuclei in hypotonic lysis buffer, followed by ultracentrifugation and immunotagging with anti-NeuN antibody. Labeled neuronal nuclei are then collected separately using fluorescence-activated sorting. This method should be applicable to any brain region in a wide range of species and suitable for chromatin immunoprecipitation studies with site- and modification-specific anti-histone antibodies, and for DNA methylation and other assays. 

The cellular heterogeneity of brain tissue poses a significant limitation for the study of epigenetic markings in chromatin because most assays lack single cell resolution. Neurons typically are intermingled with glia and other non-neuronal cells. We provide a protocol to extract and collect neuronal nuclei from human brain.

Neuronale Kerne Isolation von Human Postmortem Gehirngewebe

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Biologie

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or pathological conditions. Basically, this technique is based on the separation of proteins according to their isoelectric point in a first step, and secondly according to their molecular weights by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In this report an optimized sample preparation protocol for little amount of human post-mortem and mouse brain tissue is described. This method enables to perform both two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and mini 2DE immunoblotting. The combination of these approaches allows one to not only find new proteins and/or protein modifications in their expression thanks to its compatibility with mass spectrometry detection, but also a new insight into markers validation. Thus, mini-2DE coupled to western blotting permits to identify and validate post-translational modifications, proteins catabolism and provides a qualitative comparison among different conditions and/or treatments. Herein, we provide a method to study components of protein aggregates found in AD and Lewy body dementia such as the amyloid-beta peptide and the alpha-synuclein. Our method can thus be adapted for the analysis of the proteome and insoluble proteins extract from human brain tissue and mice models too. In parallel, it may provide useful information for the study of molecular and cellular pathways involved in neurodegenerative diseases as well as potential novel biomarkers and therapeutic targets.

A common protein extraction protocol using urea/thiourea/SDS buffer for human and mice brain tissue allows indentification of proteins by 2D-DIGE and their subsequent characterization by mini 2DE immunoblotting. This method enables one to obtain more reproducible and reliable results from human biopsies and experimental models.

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, oligomers and fibrils. During disease, &#945;-syn undergoes conformational changes to form oligomers and high molecular weight aggregates that tend to make the protein more insoluble. Abnormally aggregated &#945;-syn is a neuropathological feature of Parkinson&#39;s disease (PD), dementia with Lewy bodies (DLB) and multiple system atrophy (MSA). Biochemical characterization and analysis of insoluble &#945;-syn using buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation provides a powerful tool to determine the development of &#945;-syn pathology associated with disease progression. This protocol describes the isolation of increasingly insoluble/aggregated &#945;-syn from post-mortem human brain tissue. This methodology can be adapted with modifications to studies of normal and abnormal &#945;-syn biology in transgenic animal models harbouring different &#945;-syn mutations as well as in other neurodegenerative diseases that feature aberrant fibrillar deposits of proteins related to their respective pathologies.

Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (&#945;-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of &#945;-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

Sequentielle Extraktion von löslichen und unlöslichen Alpha-Synuclein von Parkinson-Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin occurs in equilibrium in its two forms: monomeric globular (G-actin) and polymerized filamentous (F- actin). At the synaptic terminals, actin cytoskeleton forms the basis for critical pre- and post-synaptic functions. Moreover, dynamic changes in the actin polymerization status (interconversion between globular and filamentous forms of actin) are closely linked to plasticity-related alterations in synaptic structure and function. We report here a modified fluorescence-based methodology to assess polymerization status of actin in ex vivo conditions. The assay employs fluorescently labelled phalloidin, a phallotoxin that specifically binds to actin filaments (F-actin), providing a direct measure of polymerized filamentous actin. As a proof of principle, we provide evidence for the suitability of the assay both in rodent and post-mortem human brain tissue homogenates. Using latrunculin A (a drug that depolymerizes actin filaments), we confirm the utility of the assay in monitoring alterations in F-actin levels. Further, we extend the assay to biochemical fractions of isolated synaptic terminals wherein we confirm increased actin polymerization upon stimulation by depolarization with high extracellular K+.

We report a simple, time-efficient and high-throughput fluorescence spectroscopy-based assay for the quantification of actin filaments in ex vivo biological samples from brain tissues of rodents and human subjects.

Ein zeiteffizienter Fluoreszenzspektroskopie-basierter Assay zur Bewertung des Actin-Polymerisationsstatus in Nagetier- und menschlichem Hirngewebe

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Nuclei Isolation and Super-Resolution Structured Illumination Microscopy for Examining Nucleoporin Alterations in Human Neurodegeneration

The nuclear pore complex (NPC) is a complex macromolecular structure comprised of multiple copies of ~30 different nucleoporin proteins (Nups). Collectively, these Nups function to regulate genome organization, gene expression, and nucleocytoplasmic transport (NCT). Recently, defects in NCT and alterations to specific Nups have been identified as early and prominent pathologies in multiple neurodegenerative diseases, including Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), Alzheimer&#39;s Disease (AD)/Frontotemporal Dementia (FTD), and Huntington&#39;s Disease (HD). Advances in both light and electron microscopy allow for a thorough examination of sub-cellular structures, including the NPC and its Nup constituents, with increased precision and resolution. Of the commonly used techniques, super-resolution structured illumination microscopy (SIM) affords the unparalleled opportunity to study the localization and expression of individual Nups using conventional antibody-based labeling strategies. Isolation of nuclei prior to SIM enables the visualization of individual Nup proteins within the NPC and nucleoplasm in fully and accurately reconstructed 3D space. This protocol describes a procedure for nuclei isolation and SIM to evaluate Nup expression and distribution in human iPSC-derived CNS cells and postmortem tissues.

<meta charset="utf8"></head><body>Kernisolierung und superauflösende strukturierte Beleuchtungsmikroskopie zur Untersuchung von Nukleoporinveränderungen bei der menschlichen Neurodegeneration

This protocol describes an optimized workflow for nuclei isolation and super-resolution structured illumination microscopy to evaluate individual nucleoporins within the nucleoplasm and NPCs in induced pluripotent stem cell derived neurons and postmortem human tissues.

Kernisolierung und superauflösende strukturierte Beleuchtungsmikroskopie zur Untersuchung von Nukleoporinveränderungen bei der menschlichen Neurodegeneration

The nuclear pore complex (NPC) is a complex macromolecular structure comprised of multiple copies of ~30 different nucleoporin proteins (Nups). ...

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease (AD), amyloid-beta peptides form protofibrils in the extracellular space, which act as seeds that gradually grow and mature into large amyloid plaques. Despite this basic understanding, current knowledge of the amyloid fibril structure, composition, and deposition patterns in the brain is limited. One major barrier has been the inability to isolate highly purified amyloid fibrils from brain extracts. Affinity purification and laser capture microdissection-based approaches have been previously used to isolate amyloids but are limited by the small quantity of material that can be recovered. This novel, robust protocol describes the biochemical purification of amyloid plaque cores using sodium dodecyl sulfate (SDS) solubilization with sucrose density gradient ultracentrifugation and ultrasonication and yields highly pure fibrils from AD patients and AD model brain tissues. Mass spectrometry (MS)-based bottom-up proteomic analysis of the purified material represents a robust strategy to identify nearly all the primary protein components of amyloid fibrils. Previous proteomic studies of proteins in the amyloid coronae have revealed an unexpectedly large and functionally diverse collection of proteins. Notably, after refining the purification strategy, the number of co-purifying proteins was reduced by more than 10-fold, indicating the high purity of the isolated SDS insoluble material. Negative staining and immuno-gold electron microscopy allowed confirmation of the purity of these preparations. Further studies are required to understand the spatial and biological attributes that contribute to the deposition of these proteins into amyloid inclusions. Taken together, this analytical strategy is well-positioned to increase the understanding of amyloid biology.

This biochemical purification method with mass spectrometry-based proteomic analysis facilitates the robust characterization of amyloid fibril cores, which may accelerate the identification of targets for preventing Alzheimer's disease.

Biochemische Reinigung und proteomische Charakterisierung von Amyloid-Fibrillenkernen aus dem Gehirn

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Isolation of Amyloid Fibrils from Brain Tissue Extract

Source: Upadhyay, A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/63816">Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the protocol for isolating&#160; amyloid fibrils from mouse brain tissue extract using density gradient centrifugation and digestion of non-amyloid proteins.

Isolierung von Amyloid-Fibrillen aus Hirngewebeextrakt

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Tissue harvesting and ...

Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

SDS-PAGE/Immunoblot Detektion von Aß Multimere in Human Kortikale Gewebehomogenaten mit Antigen-Epitope Retrieval

Isolierung von löslicher und unlöslicher PrP Oligomere in das normale menschliche Gehirn

Neuronale Kerne Isolation von Human Postmortem Gehirngewebe

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Sequentielle Extraktion von löslichen und unlöslichen Alpha-Synuclein von Parkinson-Brains

Ein zeiteffizienter Fluoreszenzspektroskopie-basierter Assay zur Bewertung des Actin-Polymerisationsstatus in Nagetier- und menschlichem Hirngewebe

Kernisolierung und superauflösende strukturierte Beleuchtungsmikroskopie zur Untersuchung von Nukleoporinveränderungen bei der menschlichen Neurodegeneration

Kernisolierung und superauflösende strukturierte Beleuchtungsmikroskopie zur Untersuchung von Nukleoporinveränderungen bei der menschlichen Neurodegeneration

Biochemische Reinigung und proteomische Charakterisierung von Amyloid-Fibrillenkernen aus dem Gehirn

Isolierung von Amyloid-Fibrillen aus Hirngewebeextrakt