Name: a modified yeast-one hybrid system for heteromeric protein complex-dna interaction studies
Uploaded: 2017-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
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Wir danken SS Wang, M. Amar und A. Galla für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom Nationalen Institut für Allgemeine Medizinische Wissenschaften der National Institutes of Health unter den Auszeichnungsnummern RO1GM067837 und RO1GM056006 (an SAK) unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar.

<html> 1. Konstruieren und Reporter Plasmid Vorbereitung <ol><li> PCR amplifizieren die Promotorregionen / &quot;Fragmente&quot; (vorzugsweise ~ 250 - 500 bp) der zu analysierenden Ziel-DNA zur weiteren Klonierung in den Eingangsvektor unter Verwendung von E. coli (TOP10). </li><li> Nach der Sequenzierungsbestätigung subclonieren Sie den positiven Klon in einem kompatiblen pGLacZi-Expressionsvektor 7 wie zuvor beschrieben 8 , 9 , 10 , 11 . </li><li> Verwandeln Sie den Hefestamm für die Promotorintegration (YM4271) durch homologe Rekombination von pGLacZi, um einen Hefe-Reporter-Stamm zu erzeugen, wie zuvor beschrieben 12 , 13 . Die Transformations- und Bestätigungsschritte des Hefestammes mit dem DNA-Bereich zusammen mit dem Rezept des Mediums werden hier nicht beschrieben, da die Schritte dem klassischen Y1H-Protokoll ähnlich sindAss = &quot;xref&quot;&gt; 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Die pEXP-AD502 Kontrollplasmid für Normalisierungszwecke verwendet werden , während β-Galactosidase - Aktivität , wie zuvor quantifiying 8 beschrieben. </li><li> Klonen Sie das TF oder Protein von Interesse und klonieren Sie anschließend den interagierenden Protein-Partner in pDEST22 und pDEST32ΔDBD (pDEST32 minus DNA Binding Domain) Expressionsvektoren. Die transformierten Hefe-Promotor-Fragmente und die TF-Klone werden anschließend weiter im Protokoll verwendet. </li></ol> 2. Modifiziertes Y1.5H-Protokoll <ol><li> Am Tag 1 (Nachmittag) beginnen Sie mit 5 ml Kultur in SD-Ura aus einer Petrischale oder Glycerin-Stamm und über Nacht in einem 30 ° C-Shaker inkubieren. ANMERKUNG: Diese Kultur kann von einer frisch gestreiften Platte oder direkt von einem 25% oder 30% Glycerinbestand der Hefe gestartet werdenKlon mit dem DNA-Fragment. </li><li> Am Tag 2 (Nachmittag) werden 10 ml YPDA-Medium mit 500 &amp; mgr; l der Übernachtkultur inokuliert und über Nacht in einem 30 ° C-Schüttler inkubiert. </li><li> Tag 3 (früh am Morgen und ganzer Nachmittag): Bereiten Sie kompetente Zellen (früh am Morgen) vor. <ol><li> 100 ml YPDA-Medium mit den 2 ml der Übernachtkultur inokulieren und in einem 30 ° C-Schüttler inkubieren. Diese frische Kultur wachsen, bis die OD 600 0,4-0,8 (3-5 h) erreicht. HINWEIS: Überprüfen Sie die OD 600 der Übernachtkultur und stellen Sie sicher, dass der Startpunkt OD 600 für diesen Schritt 0,1 - 0,2 beträgt. Die Verwendung von über- oder untergewachsenen Kultur kann das Experiment verlängern. </li><li> 5 min bei 1000 xg und 21 ° C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen. </li><li> Reagenzgläser in 10 ml sterilem Wasser unter Verwendung eines Wirbels oder Pipettierens auf und ab. </li><li> 5 min bei 1000 xg und 21 ° C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen. </li><li> RekonstituierenPellets in 2 ml Tris-Ethylendiamintetraessigsäure (TE) / Lithiumacetat (LiAc) unter Verwendung eines Wirbels oder Pipettierens nach oben und unten. HINWEIS: Bitte beachten Sie das Rezept für TE / LiAc in Tabelle 1 . </li><li> Zentrifuge für 5 min 1000 xg und 21 ° C. Den Überstand verwerfen. </li><li> Pellet in 4 ml TE / LiAc + 400 μl Lachssperma-DNA (10 mg / mL) nach oben und unten pipettieren und mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li></ol></li><li> Co-Transformation: Hitze schock die Zellen (spät am Nachmittag) <ol><li> 20 μl Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Mischplatte (U-Boden) verteilen. </li><li> Zugabe von 150 ng (~ 1,5 μL) des pDEST22: TF-Plasmids, pDEST32ΔDBD: TF-Plasmid und pEXP-AD502 plus pDEST32ΔDBD: TF (Normalisierungskontrolle) zu den Vertiefungen. HINWEIS: Es werden optimale Ergebnisse mit ~ 150 ng von jeweils pDEST22: TF und pDEST32ΔDBD: TF-Plasmid für eine erfolgreiche Co-Transformation erwartet. Kann mit Konstrukt- und Plasmidausdrücken variierenMuss bei jedem experiment optimiert werden Eine weitere Steuerung pDEST22-TF plus pDEST32deltaDBD kann auch nach eigenem Ermessen aufgenommen werden. </li><li> 100 μl TE / LiAc / Polyethylenglykol (PEG) pro Vertiefung zugeben ( dreimal mischen ). HINWEIS: Bitte beachten Sie das Rezept für TE / LiAc / PEG in Tabelle 1 . </li><li> Die Platte mit einer atmungsaktiven Dichtung bedecken und für 20 - 30 min (länger dauern) bei 30 ° C inkubieren (keine Rührung erforderlich). </li><li> Hitzeschock für 20 min ( genau ) bei 42 ° C. </li></ol></li><li> Tafeln Sie die Zellen. <ol><li> 5 min bei 1000 xg und 21 ° C zentrifugieren. Den Überstand mit einer Mehrkanalpipette entfernen. Zugabe von 110 μl TE und mischen. </li><li> 5 min bei 1000 xg und 21 ° C zentrifugieren. 100 μl des Überstandes mit einer Mehrkanalpipette entfernen. Das Pellet mit dem Puncher wieder suspendieren. </li><li> Übertragen von Zellen auf SD-Trp-Leu- Agarplatten. Inkubieren von PlattenBei 30 ° C bis zum nächsten Schritt </li></ol></li><li> Tag 5 (nachmittags): Übertragen Sie die Zellen auf neue Platten mit Puncher / Mikroplattenreplikator. <ol><li> Füllen Sie eine sterile 96-Well-Mischplatte (U-Boden) mit 50 μl TE mit einer Mehrkanalpipette. Den Puncher in TE vornässen HINWEIS: Der Puncher oder der Mikroplattenreplikator sollte vor diesem Schritt und anschließend später im Protokoll sterilisiert werden. Die übliche Art des Sterilisierens des Punchers, wie das Eintauchen in Ethanol (100%, nicht molekularbiologischer Grad) und dann das Brennen in die Flamme, kann angewendet werden. Warten Sie 1 min, um die Puncher-Stifte abzukühlen. Achtung: Bei der Sterilisation auf der Bank; Sicherstellen, dass die Bank mit Ethanol vorgereinigt und frei von brennbaren Stoffen ist. Tragen Sie eine persönliche Schutzausrüstung (PSA). </li><li> Stanzkolonien und wieder suspendieren in TE-gefüllte Platte. HINWEIS: Wenn es ein glattes Wachstum auf der Platte gibt, können Kolonien direkt gestanzt werdenAuf die TE-gefüllte Platte oder alternativ sollte einzelne Kolonie (bei mehreren Kolonien) mit einem sterilisierten Zahnstocher auf die TE-gefüllte Platte gepickt werden und anschließend kann der Puncher für den nächsten Schritt verwendet werden. </li><li> Übertragen Sie sie auf neue SD-Trp-Leu- Agarplatten für optimale Flächendeckung. Inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C bis zum nächsten Schritt. </li></ol></li><li> Tag 7 (Nachmittag): Kultur starten, um die β-Galactosidase-Aktivität zu messen. <ol><li> Füllen Sie eine sterile 96-Well-Mischplatte (U-Boden) mit 50 μl SD-Trp-Leu- Medium mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Füllen Sie einen sterilen 96-tiefen Brunnenblock mit 180 μl SD-Trp-Leu- Medien mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Den Puncher in den Medien vorbereiten und die Kolonien von der Platte auf die 50 μl Medien auftragen. </li><li> Übertragen Sie 20 μl Hefe auf die 180 μl SD-Trp-Leu- Medien und versiegeln den Block mit einer atmungsaktiven Dichtung. InkubierenFür 36 h bei 30 ° C Schüttler. </li></ol></li><li> Tag 9 (Morgen): Beginne die Kultur für die enzymatische Messung. <ol><li> Übertragen Sie 100 &amp; mgr; l Kultur auf 500 &amp; mgr; l YPDA-Medium in einem sterilisierten 96-tiefen Bohrlochblock. </li><li> Die sterilisierte Tiefbrunnenplatte mit einer atmungsaktiven Dichtung abdecken und für 3 - 5 h bei 30 ° C unter Rühren bei 200 U / min (bis OD 600 0,3-0,6) inkubieren. </li><li> Kultur erneut suspendieren und 125 μL unter Verwendung einer Mehrkanalpipette auf einer Spektrophotometerplatte (Maß OD 600 ) übertragen. HINWEIS: Achtung: Vermeiden Sie den letzten Tropfen, um Blasen zu vermeiden, wenn der OD 600 unter 0,3 - 0,6 liegt, inkubieren Sie die restlichen Zellen für 1 - 2 h mehr, je nach dem Lesen. Die bei diesem Schritt verwendete 125 &amp; mgr; l-Kultur kann nach dem Ermessen des Benutzers verworfen oder auf den ursprünglichen Tiefbrunnenblock zurückgeführt werden. </li><li> Die restlichen Zellen im Tiefbrunnenblock 10 min bei 3000 xg und 21 ° C zentrifugieren. Supernatan entfernenT durch invertieren. </li><li> 200 μl Z-Puffer zugeben und vortexen. HINWEIS: Bitte beachten Sie das Rezept für Z-Puffer in Tabelle 1 . </li><li> 5 min bei 3000 xg und 21 ° C zentrifugieren. Den Überstand durch Invertieren entfernen. </li><li> 20 μL Z-Puffer hinzufügen und vortexen. </li><li> Die Platte mit Dichtfolie abdecken, die Frost-Tau-Zyklen widerstehen kann. Führen Sie 4 Zyklen von Frost / Tauwetter mit flüssigem Stickstoff in einem Dunstabzug und dann 42 ºC in einem Wasserbad (jeweils 2 min). </li><li> Zugabe von 200 μl Z-Puffer / Beta-Mercaptoethanol (β-ME) / Ortho-Nitrophenyl-β-galactosid (ONPG) (12 ml, 21 μl, 8,4 mg ergeben 20 ml Lösung, immer frisch zubereiten ). HINWEIS: ONPG wird sich etwas Zeit nehmen, um sich richtig aufzulösen, so dass die Lösung eine Stunde vor dem Erreichen dieses Schrittes vorbereitet wird. ONPG dient als Substrat für die Messung der β-Galactosidase-Aktivität. </li><li> Inkubieren Sie bis zu 17 - 24 h bei 30 ° C (Check-in, wenn die Farbe früher entwickelt wirdWeiter zum nächsten Schritt). </li></ol></li><li> Tag 10 (Morgen): Stoppen Sie die Reaktion und messen Sie. <ol><li> Füge 110 μl 1M Na 2 CO 3 hinzu , um die Reaktions- und Aufzeichnungszeit zu stoppen. </li><li> Vortex und 10 min bei 3000 xg und 21 ° C zentrifugieren. </li><li> Nehmen Sie 125 μl Überstand mit Mehrkanal und messen Sie OD 420 . HINWEIS: Achtung, den letzten Tropfen nicht abgeben, um Blasen zu vermeiden. </li><li> Berechnen Sie die β-gal-Aktivität: 1000 x OD 420 / (Zeit (min) x Volumen (mL) x OD 600 in einer Kalkulationstabelle. </li></ol></li></ol>

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	<li>Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+formulations+for+various+two-hybrid+systems.">Media formulations for various two-hybrid systems.</a> Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+one-hybrid+assays:+A+historical+and+technical+perspective.">Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective.</a> Methods. 57 (4), 441-447 (2012).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+Method:+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Gavin, A. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes.">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).</li><li>Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+B-BOX32+interacts+with+CONSTANS-LIKE3+to+regulate+flowering.">Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).</li><li>Helfer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LUX+ARRHYTHMO+encodes+a+nighttime+repressor+of+circadian+gene+expression+in+the+Arabidopsis+core+clock.">LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock.</a> Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).</li><li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors.">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).</li><li>Wanke, D., Harter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plant+Regulatory+DNA+sequences+by+the+Yeast-One-Hybrid+Assay.">Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay.</a> Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).</li><li>Klein, P., Dietz, K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+DNA-Binding+Proteins+and+Protein-Protein+Interactions+by+Yeast+One-Hybrid+and+Yeast+Two-Hybrid+Screen.">Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen.</a> Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).</li><li>Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Arabidopsis+Transcriptional+Regulators+by+Yeast+One-Hybrid+Screens+Using+a+Transcription+Factor+ORFeome.">Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome.</a> Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).</li><li>Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway-Compatible+Yeast+One-Hybrid+Screens.">Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens.</a> CSH Protoc. 2006 (5), (2006).</li><li>Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gateway-compatible+yeast+one-hybrid+system.">A gateway-compatible yeast one-hybrid system.</a> Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).</li></ol>

Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Das bestehende Y1H-Standardverfahren eignet sich zur Identifizierung einer einzigen Protein-Beute-Bindung an seinen DNA-Köder. Mit verschiedenen technischen Modifikationen wurde das bestehende System zur Definition von Transkriptionsregulierungsnetzwerken eingesetzt. Es ist jedoch bekannt, dass TFs als Teil von Komplexen mit zwei oder mehr TFs oder Proteinen fungieren, wobei nur ein Teil der TF an die DNA binden kann. Proteine ​​oder TFs, die nur die Protein-bindenden Domänen besitzen und die Fähigkeit besitzen, ...

<html> Im Allgemeinen, um Protein-DNA-Wechselwirkungen zu verstehen, ist der Y1H-Assay das bevorzugte System, das erfolgreich in einer Laboreinstellung verwendet wird 1 . Der basische Y1H-Assay umfasst zwei Komponenten: a) ein Reporter-Konstrukt mit DNA von Interesse erfolgreich kloniert stromaufwärts eines Gens, das für ein Reporterprotein kodiert; Und b) ein Expressionskonstrukt, das ein Fusionsprotein zwischen dem interessierenden TF und einer Hefe-Transkriptions-Aktivierungsdomäne (AD) erzeugt. Die DNA von Interesse wird gemeinhin als &quot;Köder&quot; bezeichnet, während das Fusionsprotein als &quot;Beute&quot; bekannt ist. In den vergangenen Jahren wurden mehrere Versionen des Y1H-Assays entwickelt, um den spezifischen Bedürfnissen mit ihren eigenen Vorteilen gerecht zu werden 2 . Der bestehende Y1H-Assay kann erfolgreich implementiert werden, um die Interaktion eines Proteins zu einem Zeitpunkt mit seinem DNA-Köder zu identifizieren und zu validieren, aber es fehlt die Fähigkeit, heterodimere oder multimere Protein-DNA-Wechselwirkungen zu identifizieren. &quot;&gt; Die hier beschriebene Methode ist eine modifizierte Version der vorhandenen Y1H, die es Forschern ermöglicht, gleichzeitig mehrere Proteine ​​zu untersuchen, die an ihre Ziel-DNA-Sequenz (en) binden. Ziel dieses Assays ist es, das Protein von Interesse mit einer Aktivierungsdomäne (pDEST22: TF) und die Aktivierung der an einen Reporter fusionierten Kandidaten-DNA-Regionen in Gegenwart und / oder Abwesenheit des wechselwirkenden Protein-Partners (pDEST32ΔDBD-TF) im Hefe-System aus. Dieser Assay erlaubt es uns zu bestimmen, ob die Wechselwirkung zwischen diesen beiden ist Proteine ​​sind für die Aktivierung des Ziels erforderlich, ein GATEWAY Klonierungs-kompatibles System und daher in einer regelmäßigen Laborumgebung möglich. Das Thisprotokoll basiert auf einer direkten Transformation, die die Einfachheit der Co-Transformation verschiedener TFs in einem Hefe-System ermöglicht So ist es eine vorteilhafte Strategie, die Proteinkomplexe, die an ihre möglichen DNA-Targets binden, für die in vitro molekulare und funktionelle Validierung zu bestimmenOder irgendein System. Aktuelle Techniken wie Tandem Affinitätsreinigung (TAP) sind kostspielig und arbeitsintensiv, erlauben aber den Nachweis von Protein-Hetrocomplexen im großen Maßstab 3 , 4 , 5 . Dieser modifizierte Hefe-Ein-Hybrid kann in einer regelmäßigen Laboreinstellung im kleinen Maßstab erfolgreich durchgeführt werden ( Abbildung 1 ) und ist auch kostengünstig. Der Y1.5H-Assay kann Forschern in der gesamten Gemeinschaft helfen, ihre Hypothese zu testen und zu validieren, um die Rolle der multimeren Protein-Komplexbindung an ein gemeinsames DNA-Ziel unter Verwendung eines heterologen Systems zu definieren. Basierend auf den Befunden konnte die Hypothese in vivo im bevorzugten Studiensystem validiert werden . In letzter Zeit haben wir diesen Ansatz verwendet, um die Rolle eines TF und seiner Wirkungsweise zu definieren, um die Blüte in Arabidopsis zu regulieren 6 .

<table><tbody><tr><td>pDEST22 vector</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000101</td><td>Pro-Quest Two hybrid system kit</td></tr><tr><td>pDEST32delatDBD</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000102</td><td>Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain</td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K240020</td><td></td></tr><tr><td>YM4271 Strain</td><td>Clontech</td><td>K1603-1</td><td>MATCHMAKER One-Hybrid System</td></tr><tr><td>pEXP-AD502</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000101</td><td>Pro-Quest Two hybrid system kit</td></tr><tr><td>GATEWAY LR Clonase II enzyme mix</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>YPDA media</td><td>Clontech</td><td>630410</td><td></td></tr><tr><td>SD-Agar</td><td>Clontech</td><td>630412</td><td></td></tr><tr><td>SD minimal media</td><td>Clontech</td><td>630411</td><td></td></tr><tr><td>Uracil DO Supplement</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Tryptophan Do Supplement</td><td>Clontech</td><td>630413</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>LiAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>Saplmon Sperm (10mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>96 well round bottom Plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>650101</td><td></td></tr><tr><td>PEG3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1546547</td><td></td></tr><tr><td>96-deep well block</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2000</td><td></td></tr><tr><td>Sealable Foil</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0110</td><td></td></tr><tr><td>Araseal</td><td>Excel Scientific</td><td>B-100</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>034461-100</td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73660</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223484</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83266</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA54-4</td><td></td></tr><tr><td>Drybath</td><td>Thermo Fischer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voretx</td><td>Thermo Fischer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifgue</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader</td><td>Molecular Device</td><td></td><td>SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Fisher</td><td>Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees</td><td></td></tr><tr><td>Shaker Incubator</td><td>New Brunswick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Thermo Fisher</td><td>IsoTemp 205</td><td></td></tr><tr><td>Puncher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falocn</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flask</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petriplates (150mm)</td><td>Greiner bio-one</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a modified yeast-one hybrid system for heteromeric protein complex-dna interaction studies

Im Laufe der Jahre hat sich der Hefe-Ein-Hybrid-Assay als eine wichtige Technik zur Identifizierung und Validierung von physikalischen Wechselwirkungen zwischen Proteinen wie Transkriptionsfaktoren (TFs) und deren DNA-Ziel erwiesen. Die hier vorgestellte Methode nutzt das zugrunde liegende Konzept des Y1H, wird aber modifiziert, um Protein-Komplexe, die an ihre Ziel-DNA binden, zu untersuchen und zu validieren. Daher wird es als der modifizierte Hefe-Ein-Hybrid (Y1.5H) -Assay bezeichnet. Dieser Assay ist kostengünstig und kann in einem regelmäßigen Laboratorium leicht durchgeführt werden. Unter Verwendung eines heterologen Systems könnte die beschriebene Methode ein wertvolles Werkzeug sein, um den heteromeren Proteinkomplex zu testen und zu validieren, der an ihre DNA-Ziel (e) für die funktionelle Genomik in jedem System der Studie, insbesondere der Pflanzengenomik, bindet.

Das allgemeine Plattenaufbauprozess für die Co-Transformation von DNA-Regionen in den Hefezellen mit Protein von Interesse ( Abbildung 2 ). Der Plattenaufbau kann entsprechend der Notwendigkeit des Experiments und der Anzahl der untersuchten DNA-Regionen / Fragmente modifiziert werden. Nach dem Tag-5 des Protokolls sollte eine gut gewachsene und positive Platte sichtbar sein wie in Abbildung 3 . In unserer Studie wurde die Prom...

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A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Ein modifiziertes Hefe-ein-Hybrid-System für Heteromere Protein-Komplex-DNA-Interaktionsstudien

Der hier beschriebene modifizierte Hefe-Ein-Hybrid-Assay ist eine Erweiterung des klassischen Hefe-Ein-Hybrid- (Y1H) -Assays, um die heteromere Protein-Komplex-DNA-Wechselwirkung in einem heterologen System für jede funktionelle Genomforschung zu untersuchen und zu validieren.

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

a-modified-yeast-one-hybrid-system-for-heteromeric-protein-complex

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K Aufrufe.  University of Southern California.  Der hier beschriebene modifizierte Hefe-Ein-Hybrid-Assay ist eine Erweiterung des klassischen Hefe-Ein-Hybrid- (Y1H) -Assays, um die heteromere Protein-Komplex-DNA-Wechselwirkung in einem heterologen System für jede funktionelle Genomforschung zu untersuchen und zu validieren. 

Serie: A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Forschung

Biochemie

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

Verbesserte Hefe One-Hybrid Screens, Transkriptionsfaktor Bindung an menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Genetik

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-Ubiquitin Basierend Membrane Yeast Two-Hybrid (Mythos) System: Ein wirksames Instrument zur Ermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Biologie

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Immunologie und Infektion

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role in a variety of physiologic and disease processes, including early embryogenesis, wound healing 1, inflammation 2, 3, and host defense 4. PGRN also functions as a neurotrophic factor 5, and mutations in the PGRN gene resulting in partial loss of the PGRN protein cause frontotemporal dementia 6, 7. Our recent studies have led to the isolation of PGRN as an important regulator of cartilage development and degradation 8-11. Although PGRN, discovered nearly two decades ago, plays crucial roles in multiple physiological and pathological conditions, efforts to exploit the actions of PGRN and understand the mechanisms involved have been significantly hampered by our inability to identify its binding receptor(s). To address this issue, we developed a modified yeast two-hybrid (MY2H) approach based on the most commonly used GAL4 based 2-hybrid system. Compared with the conventional yeast two-hybrid screen, MY2H dramatically shortens the screen process and reduces the number of false positive clones. In addition, this approach is reproducible and reliable, and we have successfully employed this system in isolating the binding proteins of various baits, including ion channel 12, extracellular matrix protein 10, 13, and growth factor14. In this paper, we describe this MY2H experimental procedure in detail using PGRN as an example that led to the identification of TNFR2 as the first known PGRN-associated receptor 14, 15.

We have modified the conventional yeast two-hybrid screening, an effective genetic tool in identifying protein interaction. This modification markedly shortens the process, reduces the workload, and most importantly, reduces the number of false positives. In addition, this approach is reproducible and reliable.

Modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid-System, um Proteine ​​interagieren mit dem Growth Factor Progranulin Identifizieren

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

Reverse-Hefe-Zwei-Hybrid-System an Säugetier Nuclear Receptor Rückstände Identifizieren Sie, dass Interagieren Sie mit Liganden und / oder Antagonisten

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

<meta charset="utf8"></head><body>Optimierung der Proteinfunktionen durch Techniken zur Anzeige von Hefeoberflächen

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and versatile tools in the protein engineering field is yeast surface display, where a pool of randomized proteins is expressed on the surface of yeast. The linkage of phenotype (e.g., binding of the yeast-displayed protein to the antigen of interest) and genotype (the plasmid encoding for the protein variant) enables selection of this library for desired properties and subsequent sequencing of enriched variants. By combining magnetic bead selection with flow cytometric sorting, protein variants with enhanced binding to a target antigen can be selected and enriched. Notably, in addition to affinity maturation, binding to a target can also be achieved without any initial binding affinity. Here, we provide a step-by-step protocol that covers all essential parts of a yeast surface display selection campaign and gives examples of typical yeast surface display results. We demonstrate that yeast surface display is a broadly applicable and robust method that can be established in any molecular biology laboratory with access to flow cytometry.

<meta charset="utf8"></head><body>Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

This protocol describes the essential steps for conducting yeast surface display selection campaigns to enrich protein variants binding to an antigen of interest.

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

Biotechnik

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Genetische und biochemische Ansätze für<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Ein modifiziertes Hefe-ein-Hybrid-System für Heteromere Protein-Komplex-DNA-Interaktionsstudien

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

Verbesserte Hefe One-Hybrid Screens, Transkriptionsfaktor Bindung an menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren

Split-Ubiquitin Basierend Membrane Yeast Two-Hybrid (Mythos) System: Ein wirksames Instrument zur Ermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid-System, um Proteine interagieren mit dem Growth Factor Progranulin Identifizieren

Reverse-Hefe-Zwei-Hybrid-System an Säugetier Nuclear Receptor Rückstände Identifizieren Sie, dass Interagieren Sie mit Liganden und / oder Antagonisten

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Genetische und biochemische Ansätze für

Ein modifiziertes Hefe-ein-Hybrid-System für Heteromere Protein-Komplex-DNA-Interaktionsstudien

Zusammenfassung

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Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

Verbesserte Hefe One-Hybrid Screens, Transkriptionsfaktor Bindung an menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren

Split-Ubiquitin Basierend Membrane Yeast Two-Hybrid (Mythos) System: Ein wirksames Instrument zur Ermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid-System, um Proteine ​​interagieren mit dem Growth Factor Progranulin Identifizieren

Reverse-Hefe-Zwei-Hybrid-System an Säugetier Nuclear Receptor Rückstände Identifizieren Sie, dass Interagieren Sie mit Liganden und / oder Antagonisten

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Genetische und biochemische Ansätze für

Modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid-System, um Proteine interagieren mit dem Growth Factor Progranulin Identifizieren