Name: a modified yeast-one hybrid system for heteromeric protein complex-dna interaction studies
Uploaded: 2017-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies at JoVE.com

SS Wang, M. Amar, A. Galla에게 원고를 읽는 것에 대해 감사드립니다. 이 간행물에보고 된 연구는 보너스 번호 RO1GM067837 및 RO1GM056006 (SAK로)하에 국립 보건원 국립 의학 종합 연구소 (National Institute of Health)의 지원을 받았다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 나타내는 것은 아닙니다.

<html> 1. 플라스미드 준비 및 리포터 <ol><li> PCR은 대장균 (TOP10)을 사용하여 진입 벡터에 추가로 클로닝하기 위해 분석 될 표적 DNA의 프로모터 영역 / &quot;단편&quot;(바람직하게 ~ 250-500bp)을 증폭시킨다. </li><li> 시퀀싱 확인시 이전에 설명한 8 , 9 , 10 , 11 과 같이 호환 가능한 pGLacZi 발현 벡터 7 에서 양성 클론을 서브 클론합니다. </li><li> 이전 12 , 13에서 설명한대로 효모 리포터 변형을 생성 pGLacZi의 상 동성 재조합에 의해 발기인 통합 (YM4271)에 대한 효모 변형을 변환합니다. 매체의 제조법과 함께 DNA 영역을 갖는 효모 균주의 형질 전환 및 확인 단계는 단계가 고전적인 Y1H 프로토콜과 유사하기 때문에 여기서 설명하지 않는다ass = &quot;xref&quot;&gt; 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . pEXP - AD502 제어 플라스미드는 정상화 목적으로 사용할 수 있으며 이전에 설명한대로 β - 갈 락토시다 아제 활성을 quantifiying 8 . </li><li> 관심있는 TF 또는 단백질을 클론하고 상호 작용하는 단백질 파트너를 pDEST22 및 pDEST32ΔDBD (pDEST32 마이너스 DNA 결합 도메인) 발현 벡터로 클로닝한다. 형질 전환 된 효모 프로모터 단편 및 TF 클론은 추후에 프로토콜에서 더 사용된다. </li></ol> 2. 수정 된 Y1.5H 프로토콜 <ol><li> 1 일 (오후), 페트리 접시 또는 글리세롤 주식에서 SD - Ura 의 문화의 5 ML로 시작하고 30 ° C 쉐이커에서 밤새 품어. 참고 :이 문화는 신선 줄무늬 접시 또는 효모의 25 % 또는 30 % 글리세롤 주식에서 직접 시작할 수 있습니다DNA 조각으로 복제하십시오. </li><li> 2 일차 (오후)에 YPDA 배지 10 mL에 밤새 배양액 500 μL를 접종하고 30 ° C 쉐이커에서 밤새 배양합니다. </li><li> 3 일차 (아침 일찍 및 오후 내내) : 능력있는 세포 준비 (아침 일찍). <ol><li> 밤새 문화 2 ML와 YPDA 미디어 100 ML을 접종하고 30 ° C의 쉐이 커에서 품어. OD 600 이 0.4-0.8 (3-5 h)에 도달 할 때까지이 신선한 배양 물을 성장시킵니다. 참고 : 하룻밤 문화의 OD 600을 확인하고이 단계의 시작 지점 OD 600 0.1 있는지 확인 - 0.2. 과도한 성장이나 미성숙 된 문화를 사용하면 실험 기간이 길어질 수 있습니다. </li><li> 1000 xg 및 21 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 뜨는 물을 버린다. </li><li> 소용돌이 또는 피펫 팅 (pipetting)을 사용하여 10 mL의 멸균 수로 펠렛을 재생한다. </li><li> 1000 xg 및 21 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 뜨는 물을 버린다. </li><li> 재구성2 mL의 Tris-Ethylenediaminetetraaceticacid (TE) / Lithium acetate (LiAc)에 vortex를 사용하거나 위아래로 pipetting하여 펠렛을 만든다. 참고 : 표 1의 TE / LiAc 제조법을 참조하십시오. </li><li> 1000 xg 및 21 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 뜨는 물을 버린다. </li><li> 4 ML의 TE / LiAc + 400 μL 연어 정자 DNA (10 MG / ML) pipetting 위아래로 펠렛을 다시 일시 중지하고 다음 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 공동 변형 : 세포에 열 충격 (오후 늦게) <ol><li> 96 잘 혼합 접시 (U - 하단)에 잘 당 세포의 20 μL를 배포 할 수 있습니다. </li><li> 우물에 pDEST22 : TF 플라스미드, pDEST32ΔDBD : TF 플라스미드 및 pEXP - AD502 플러스 pDEST32ΔDBD : TF (정상화 제어)를 각각 150 ng (~ 1.5 μL)를 추가합니다. 참고 : ~ 150 ng 각각의 pDEST22 : TF 및 pDEST32ΔDBD : TF 플라스미드로 최적의 결과가 예상됩니다. 구조 및 플라스미드 표현에 따라 달라질 수 있으므로모든 실험마다 최적화해야합니다. 또 다른 컨트롤 인 pDEST22-TF와 pDEST32deltaDBD는 사용자의 재량에 따라 포함될 수 있습니다. </li><li> 웰 당 100 μL의 TE / LiAc / 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 첨가한다 (3 회 혼합 ). 참고 : 표 1의 TE / LiAc / PEG 제조법을 참조하십시오. </li><li> 통기성이있는 뚜껑으로 플레이트를 덮고 30 ° C (교반 필요 없음)에서 20 - 30 분 (더 길어질 수 있음) 동안 배양하십시오. </li><li> 42 ° C에서 20 분 동안 열충격 ( 정밀 ). </li></ol></li><li> 세포를 판다. <ol><li> 1000 xg 및 21 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 멀티 채널 피펫을 사용하여 상징액을 제거하십시오. 110 μL의 TE를 넣고 섞는다. </li><li> 1000 xg 및 21 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 멀티 채널 피펫을 사용하여 뜨는의 100 μL를 제거합니다. 구멍을 뚫어 펠렛을 다시 매달아 라. </li><li> SD - Trp - Leu 한천 플레이트에 세포를 전송합니다. 플레이트를 부화시키다.30 ° C에서 다음 단계까지. </li></ol></li><li> 5 일 (오후) : 펀처 / 마이크로 플레이트 복제기를 사용하여 새 플레이트에 세포를 옮깁니다. <ol><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 멸균 96 - 웰 혼합 판 (U - 하단)에 50 μL의 TE를 채 웁니다. TE의 구멍을 미리 닦으십시오. 참고 :이 단계 전에 그리고 이후 프로토콜에서 펀처 또는 마이크로 플레이트 리플리케이터를 멸균해야합니다. 에 펀치 (100 %, 분자 생물학 등급이 아님)에 담그고 화염에 태우는 것과 같이 구멍을 뚫는 일반적인 방법이 적용될 수 있습니다. 펀처 핀을 식히기 위해 1 분 정도 기다리십시오. 주의 : 벤치에서 살균을 수행하는 경우; 벤치를 에탄올로 사전 청소하고 가연성 물질이 없어야합니다. 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오. </li><li> 식민지를 펀치하고 TE로 채워진 플레이트에 다시 부순다. 참고 : 플레이트에 부드럽게 성장하면 식민지를 직접 펀치 할 수 있습니다TE- 채워진 플레이트 또는 대안으로, 단일 콜로니 (다중 콜로니의 경우)는 TE 채워진 플레이트에 살균 된 이쑤시게를 사용하여 골라야하고,이어서 펀처를 사용하여 다음 단계에 사용할 수 있습니다. </li><li> 최적의 표면 커버리지를 위해 새로운 SD-Trp-Leu 한천 플레이트 로 옮기십시오 . 30 ° C에서 다음 단계까지 플레이트를 배양하십시오. </li></ol></li><li> 7 일 (오후) : β- 갈 락토시다 아제 활성을 측정하기위한 배양을 시작한다. <ol><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 SD - Trp - Leu 미디어 50 μL와 살균 96 - 웰 혼합 판 (U - 하단)을 작성하십시오. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 180 μl의 SD-Trp-Leu 배지로 96 웰 멸균 블록을 채 웁니다. </li><li> 미디어에 구멍을 뚫어 미리 젖혀 놓은 다음 플레이트에서 식민지를 미디어 50 μL로 옮깁니다. </li><li> SD-Trp-Leu 배지 180 μL에 효모 20 μL를 옮기고 통기성이있는 막을 밀봉합니다. 품다30 ° C 쉐이커에서 36 시간 동안. </li></ol></li><li> 9 일째 (아침) : 효소 측정을위한 배양을 시작하십시오. <ol><li> 멸균 96 깊은 우물 블록에서 YPDA 미디어의 500 μL에 문화의 100 μL을 전송합니다. </li><li> 호흡 할 수있는 씰로 멸균 된 깊은 웰 플레이트를 덮고 200 rpm에서 교반하면서 30 ° C에서 3-5 시간 동안 배양합니다 (OD 600 0.3-0.6까지). </li><li> 문화를 다시 일시 중지하고 분광 광도계 플레이트 (측정 OD 600 )에 멀티 채널 피펫을 사용하여 125 μL를 전송합니다. 참고 :주의 : OD 600 이 0.3 - 0.6 미만인 경우 마지막 방울을 분사하지 마십시오. OD 600 이 판독 값에 따라 1 - 2 시간 동안 더 배양하십시오. 이 단계에서 사용 된 125 μL 배양 물은 폐기되거나 사용자의 재량에 따라 원래의 깊은 웰 블록으로 다시 옮길 수 있습니다. </li><li> 3000 XG 및 21 ° C에서 10 분 동안 깊은 우물 블록에 남아있는 세포를 원심 분리기. supernatan 제거t를 반전 시켜서. </li><li> Z 버퍼 및 와동의 200 μL를 추가합니다. 참고 : 표 1 에서 Z 버퍼의 제조법을 참조하십시오. </li><li> 3000 xg 및 21 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 거꾸로하여 뜨는을 제거합니다. </li><li> 20 μL Z-buffer와 vortex를 첨가한다. </li><li> 동결 융해 사이클에 견딜 수있는 밀봉 호일로 플레이트를 덮으십시오. 흄 후드에서 액체 질소를 사용하여 4 사이클의 동결 / 해동을 수행 한 다음 수조에서 42 ℃ (각 2 분)를 수행합니다. </li><li> 200 μL Z 버퍼 / 베타 - 머 캅토 에탄올 (β-ME) / 오르토 니트로 - β 갈 락토 (ONPG)에 추가 (12 ㎖, 21 μL를 8.4 mg을 각각 20 ㎖의 용액을 수득한다; 항상 신선한 준비). 참고 : ONPG는 올바르게 분해하기 위해 약간의 시간이 걸리므로이 단계에 도달하기 전에 1 시간 전에 용액을 준비하십시오. ONPG는 β- 갈 락토시다 아제 활성의 측정을위한 기질 역할을한다. </li><li> 30 ° C에서 최대 17 - 24 시간 동안 배양하십시오. (색상이 이전 pr다음 단계로 넘어가십시오). </li></ol></li><li> 10 일째 (아침) : 반응을 멈추고 측정하십시오. <ol><li> 110 μL 1M Na 2 CO 3 을 첨가하여 반응을 멈추고 시간을 기록하십시오. </li><li> 3000 xg 및 21 ° C에서 10 분 동안 와동과 원심 분리. </li><li> 멀티 채널을 사용하여 125 μl의 상층 액을 취하여 OD 420을 측정하십시오. 참고 : 거품이 발생하지 않도록 마지막 방울을 분사하지 마십시오. </li><li> 스프레드 시트에서 β-gal 활성 : 1000 x OD 420 / (시간 (분) x 체적 (mL) x OD 600) 을 계산한다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+formulations+for+various+two-hybrid+systems.">Media formulations for various two-hybrid systems.</a> Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+one-hybrid+assays:+A+historical+and+technical+perspective.">Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective.</a> Methods. 57 (4), 441-447 (2012).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+Method:+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Gavin, A. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes.">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).</li><li>Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+B-BOX32+interacts+with+CONSTANS-LIKE3+to+regulate+flowering.">Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).</li><li>Helfer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LUX+ARRHYTHMO+encodes+a+nighttime+repressor+of+circadian+gene+expression+in+the+Arabidopsis+core+clock.">LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock.</a> Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).</li><li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors.">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).</li><li>Wanke, D., Harter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plant+Regulatory+DNA+sequences+by+the+Yeast-One-Hybrid+Assay.">Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay.</a> Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).</li><li>Klein, P., Dietz, K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+DNA-Binding+Proteins+and+Protein-Protein+Interactions+by+Yeast+One-Hybrid+and+Yeast+Two-Hybrid+Screen.">Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen.</a> Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).</li><li>Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Arabidopsis+Transcriptional+Regulators+by+Yeast+One-Hybrid+Screens+Using+a+Transcription+Factor+ORFeome.">Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome.</a> Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).</li><li>Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway-Compatible+Yeast+One-Hybrid+Screens.">Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens.</a> CSH Protoc. 2006 (5), (2006).</li><li>Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gateway-compatible+yeast+one-hybrid+system.">A gateway-compatible yeast one-hybrid system.</a> Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).</li></ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

기존의 Y1H 표준 절차는 DNA 미끼에 결합하는 단일 단백질 먹이를 확인하는 데 적합합니다. 다양한 기술적 변경에 따라, 기존의 시스템은 전사 조절 네트워크를 정의하는 데 이용되어왔다. 그러나 TF는 두 개 이상의 TF 또는 단백질을 포함하는 복합체의 일부로 기능하는 것으로 알려져 있으며 TF의 일부만이 DNA에 결합 할 수 있습니다. 단백질 결합 도메인만을 갖고 DNA에 결합하는 능력이 결핍 된 단백...

<html> 일반적으로 단백질 -DNA 상호 작용을 이해하기 위해 Y1H 분석이 실험실 환경에서 성공적으로 사용되는 선호 시스템입니다 1 . 기본적인 Y1H 분석은 두 가지 요소를 포함한다 : a) 리포터 단백질을 코딩하는 유전자의 상류에서 성공적으로 복제 된 관심 DNA를 갖는 리포터 구조; 및 b) 관심있는 TF와 효모 전사 활성화 도메인 (AD) 사이에 융합 단백질을 생성시킬 발현 구조물. 융합 단백질은 &#39;먹이&#39;로 알려진 반면, 관심있는 DNA는 일반적으로 &#39;미끼&#39;라고합니다. 지난 몇 년 동안, Y1H 분석법의 여러 버전이 자신의 장점을 지닌 특정 요구에 맞게 개발되었습니다 2 . 기존 Y1H 분석법은 한 번에 한 단백질의 DNA 미끼와의 상호 작용을 확인하고 확인하기 위해 성공적으로 구현 될 수 있지만 이종이 량체 또는 다중 단백질 단백질 -DNA 상호 작용을 식별 할 수있는 능력이 부족합니다. &quot;여기에 설명 된 방법은 기존 Y1H의 변형 된 버전으로 연구원은 표적 DNA 서열에 결합하는 여러 단백질을 동시에 연구 할 수 있습니다.이 분석의 목표는 활성화 도메인 (pDEST22 : TF)와 상호 작용하는 단백질 파트너 (pDEST32ΔDBD-TF)의 존재 및 / 또는 부재 하에서 리포터에 융합 된 후보 DNA 영역의 활성화를 효모 시스템에서 평가할 수있다. 단백질은 목표의 활성화에 필요합니다. 이것은 GATEWAY 복제 호환 시스템이므로 정기적 인 실험실 환경에서 사용할 수 있습니다.이 프로토콜은 효모 시스템에서 여러 TF의 용이 한 동시 변형을 제공하는 직접 변환을 기반으로합니다. 따라서 in vitro 분자 및 기능 검증을 위해 가능한 DNA 표적에 결합하는 단백질 복합체를 검증하는 것이 유리한 전략이다. f또는 어떤 시스템. Tandem affinity purification (TAP) 방법과 같은 현재의 기술은 값 비싸고 노동 집약적이지만 대규모로 단백질 hetrocomplexes를 검출 할 수 있습니다 3 , 4 , 5 . 이 변형 된 효모 원 하이브리드는 작은 규모의 정규 실험실 환경에서 성공적으로 수행 될 수 있으며 ( 그림 1 ) 또한 비용 효율적입니다. Y1.5H 분석은 이종 시스템을 사용하여 공통 DNA 표적에 결합하는 다중 단백질 복합체의 역할을 정의하는 방향으로 자신의 가설을 테스트하고 검증하기 위해 지역 사회 전체의 연구자를 용이하게 할 수 있습니다. 연구 결과에 따르면이 가설은 바람직한 연구 시스템 에서 생체 내 에서 검증 될 수있다. 최근 우리는이 접근법을 사용하여 TF의 역할과 Arabidopsis 6의 개화를 조절하는 작용 기전을 정의했습니다.

<table><tbody><tr><td>pDEST22 vector</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000101</td><td>Pro-Quest Two hybrid system kit</td></tr><tr><td>pDEST32delatDBD</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000102</td><td>Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain</td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K240020</td><td></td></tr><tr><td>YM4271 Strain</td><td>Clontech</td><td>K1603-1</td><td>MATCHMAKER One-Hybrid System</td></tr><tr><td>pEXP-AD502</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000101</td><td>Pro-Quest Two hybrid system kit</td></tr><tr><td>GATEWAY LR Clonase II enzyme mix</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>YPDA media</td><td>Clontech</td><td>630410</td><td></td></tr><tr><td>SD-Agar</td><td>Clontech</td><td>630412</td><td></td></tr><tr><td>SD minimal media</td><td>Clontech</td><td>630411</td><td></td></tr><tr><td>Uracil DO Supplement</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Tryptophan Do Supplement</td><td>Clontech</td><td>630413</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>LiAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>Saplmon Sperm (10mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>96 well round bottom Plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>650101</td><td></td></tr><tr><td>PEG3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1546547</td><td></td></tr><tr><td>96-deep well block</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2000</td><td></td></tr><tr><td>Sealable Foil</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0110</td><td></td></tr><tr><td>Araseal</td><td>Excel Scientific</td><td>B-100</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>034461-100</td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73660</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223484</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83266</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA54-4</td><td></td></tr><tr><td>Drybath</td><td>Thermo Fischer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voretx</td><td>Thermo Fischer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifgue</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader</td><td>Molecular Device</td><td></td><td>SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Fisher</td><td>Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees</td><td></td></tr><tr><td>Shaker Incubator</td><td>New Brunswick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Thermo Fisher</td><td>IsoTemp 205</td><td></td></tr><tr><td>Puncher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falocn</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flask</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petriplates (150mm)</td><td>Greiner bio-one</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a modified yeast-one hybrid system for heteromeric protein complex-dna interaction studies

지난 수년간 효모 one-hybrid assay는 전사 인자 (TFs)와 DNA 표적과 같은 단백질 간의 물리적 상호 작용을 확인하고 검증하는 중요한 기술로 입증되었습니다. 여기에 제시된 방법은 Y1H의 기본 개념을 사용하지만 대상 DNA에 결합하는 단백질 복합체를 연구하고 검증하기 위해 추가로 변형됩니다. 따라서, 이는 변형 된 효모 일 - 하이브리드 (Y1.5H) 분석으로 지칭된다. 이 분석법은 비용 효과적이며 정기적 인 실험실 환경에서 쉽게 수행 할 수 있습니다. 이종 시스템을 사용 함에도 불구 하고 기술 된 방법은 연구 시스템, 특히 식물 유전체학에서 기능적 유전체학을위한 DNA 표적 (들)에 결합하는 헤테로 성 단백질 복합체를 시험하고 검증하는 유용한 도구가 될 수 있습니다.

관심 단백질 ( 그림 2 )와 효모 세포에서 DNA 영역의 공동 변환을위한 일반적인 플레이트 설정 절차. 플레이트 셋업은 실험의 필요성 및 테스트 된 DNA 영역 / 단편의 수에 따라 수정 될 수있다. 프로토콜의 5 일 이후 well-grown 및 positive plate는 그림 3 과 같이 보여야합니다. 우리의 연구에서, 전사 시작 부위의 시작으로부터 2600 bp 상?...

Watch this Scientific Journal Video about A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies at JoVE.com

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

이성질체 단백질 복합체 -DNA 상호 작용 연구를위한 수정 된 효모 원 하이브리드 시스템

여기에 설명 된 수정 된 효모 하나 - 하이브리드 분석은 기능적 유전체학 연구를위한 이종 시스템에서 헤테로 머 단백질 복합체 - DNA 상호 작용을 연구하고 검증하기위한 고전적인 효모 1- 하이브리드 (Y1H) 분석법의 확장이다.

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

a-modified-yeast-one-hybrid-system-for-heteromeric-protein-complex

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K 조회수.  University of Southern California.  여기에 설명 된 수정 된 효모 하나 - 하이브리드 분석은 기능적 유전체학 연구를위한 이종 시스템에서 헤테로 머 단백질 복합체 - DNA 상호 작용을 연구하고 검증하기위한 고전적인 효모 1- 하이브리드 (Y1H) 분석법의 확장이다. 

비디오: A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

연구

생화학

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

인간의 DNA 시퀀스에 바인딩 전사 요소를 식별 하기 위해 향상 된 효 모 한 하이브리드 화면

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

유전학

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

분할 Ubiquitin 기반 막 효모 두 하이브리드 (신화) 시스템 : 단백질 단백질 상호 작용을 확인을위한 강력한 도구

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

생물학

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

면역학 및 감염병학

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role in a variety of physiologic and disease processes, including early embryogenesis, wound healing 1, inflammation 2, 3, and host defense 4. PGRN also functions as a neurotrophic factor 5, and mutations in the PGRN gene resulting in partial loss of the PGRN protein cause frontotemporal dementia 6, 7. Our recent studies have led to the isolation of PGRN as an important regulator of cartilage development and degradation 8-11. Although PGRN, discovered nearly two decades ago, plays crucial roles in multiple physiological and pathological conditions, efforts to exploit the actions of PGRN and understand the mechanisms involved have been significantly hampered by our inability to identify its binding receptor(s). To address this issue, we developed a modified yeast two-hybrid (MY2H) approach based on the most commonly used GAL4 based 2-hybrid system. Compared with the conventional yeast two-hybrid screen, MY2H dramatically shortens the screen process and reduces the number of false positive clones. In addition, this approach is reproducible and reliable, and we have successfully employed this system in isolating the binding proteins of various baits, including ion channel 12, extracellular matrix protein 10, 13, and growth factor14. In this paper, we describe this MY2H experimental procedure in detail using PGRN as an example that led to the identification of TNFR2 as the first known PGRN-associated receptor 14, 15.

We have modified the conventional yeast two-hybrid screening, an effective genetic tool in identifying protein interaction. This modification markedly shortens the process, reduces the workload, and most importantly, reduces the number of false positives. In addition, this approach is reproducible and reliable.

성장 팩터 Progranulin와 상호 작용하는 단백질을 식별하기 위해 수정된 효모 - 2 하이브리드 시스템

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

포유류의 핵 수용체 잔류를 확인하기 위해 효모 두 하이브리드 시스템을 반전하는 리간드 및 / 또는 길항제와 상호 작용

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

<meta charset="utf8"></head><body>효모 표면 디스플레이 기법을 통한 단백질 기능 최적화

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and versatile tools in the protein engineering field is yeast surface display, where a pool of randomized proteins is expressed on the surface of yeast. The linkage of phenotype (e.g., binding of the yeast-displayed protein to the antigen of interest) and genotype (the plasmid encoding for the protein variant) enables selection of this library for desired properties and subsequent sequencing of enriched variants. By combining magnetic bead selection with flow cytometric sorting, protein variants with enhanced binding to a target antigen can be selected and enriched. Notably, in addition to affinity maturation, binding to a target can also be achieved without any initial binding affinity. Here, we provide a step-by-step protocol that covers all essential parts of a yeast surface display selection campaign and gives examples of typical yeast surface display results. We demonstrate that yeast surface display is a broadly applicable and robust method that can be established in any molecular biology laboratory with access to flow cytometry.

<meta charset="utf8"></head><body>효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

This protocol describes the essential steps for conducting yeast surface display selection campaigns to enrich protein variants binding to an antigen of interest.

효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

생체공학

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

대한 유전 및 생화학 적 접근<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 단백질 올리고머의 평가 다음 Ryanodine 수용체 사례 연구

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

이성질체 단백질 복합체 -DNA 상호 작용 연구를위한 수정 된 효모 원 하이브리드 시스템

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

인간의 DNA 시퀀스에 바인딩 전사 요소를 식별 하기 위해 향상 된 효 모 한 하이브리드 화면

분할 Ubiquitin 기반 막 효모 두 하이브리드 (신화) 시스템 : 단백질 단백질 상호 작용을 확인을위한 강력한 도구

효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

성장 팩터 Progranulin와 상호 작용하는 단백질을 식별하기 위해 수정된 효모 - 2 하이브리드 시스템

포유류의 핵 수용체 잔류를 확인하기 위해 효모 두 하이브리드 시스템을 반전하는 리간드 및 / 또는 길항제와 상호 작용

효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

대한 유전 및 생화학 적 접근