Name: leprdb mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets
Uploaded: 2015-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
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This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).

HINWEIS: Alle vorliegenden Experimenten wurden nach den örtlichen Tierethik Verfahren der University of Queensland (von der University of Queensland, Anatomisches Biosciences Ethikkommission genehmigt) durchgeführt. 1. Islet Isolation <ol><li> Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Enzymgemisch, <ol><li> Für die Pankreasverdauung, eine Mischung aus Liberase und Collagenase Typ IV. Verdünnen Liberase TL (Thermo niedrig) 1 Fläschchen 5 mg mit 26 ml DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium). </li><li> Vorbereitung Collagenase Typ IV in Hanks-Puffer bei einer Konzentration von 0,5 mg / ml, mit 5 mM HEPES, 0,5 mM CaCl 2, 0,1 mg / ml DNAse und 1 mg / ml Rinderserumalbumin. </li><li> Mischen den Liberase TL und Collagenase-Lösungen in einem Verhältnis von 4: 1 (nach Volumen), das heißt, 4 ml Liberase TL + 1 ml Kollagenase. Aliquot der Mischung von Enzymen zu jedem und bei -20 ° C 2,5 ml. HINWEIS: Die Gewebe Inkubationszeiten vary ein wenig zwischen den Chargen des Enzyms (30 sec bis 1 min-Differenz). Daher kann ein Batch-Test erforderlich. </li></ol></li><li> RPMI Isolation Medien <ol><li> Lösen Sie eine Phiole mit RPMI 1640-Pulver in 1 l Wasser bei Raumtemperatur und zu ergänzen, mit 2 g NaHCO 3, 4,02 g HEPES. </li><li> Kombinieren Sie die RPMI Isolationsmedien in einer großen Erlenmeyerkolben, der mit einem Magnetrührer mischen, auf pH 7,4 mit NaOH, Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C. </li></ol></li><li> RPMI Kulturmedien </li><li> Verwenden RPMI Kulturmedium, mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Antibiotika (dh, Penicillin 100 U / ml, Streptomycin 100 ug / ml). </li></ol></li><li> Islet Isolation und Kultivierung <ol><li> Tieropfer <ol><li> Opfern Mäuse durch Genickbruch oder CO 2 Ersticken nach Ethik Verfahren der lokalen Institution. Sprühen Sie die Maus Körper gründlich mit 70% Ethanol. </li></ol></li><li> Pancreatic Perfusion <ol><li> Use 2 lange Schnitte seitlich durch die Bauchhaut und Bauchfell, um eine V-förmige Klappe zu machen. Ziehen Sie die Klappe der Haut bis zu den gesamten Bauchraum aufzudecken, beiseite den Darm und die Leber zu halten anstelle von einem gefalteten Seidenpapier, um den Gallengang zu offenbaren (Abbildungen 1 und 2). Setzen Sie das Tier, so dass der Kopf in Richtung der Chirurg und der Schwanz vom Chirurgen. </li><li> Anwenden einer Gefäßklemme an der Ampulle an der Wand, um den Zwölffingerdarm injiziert, Enzyme aus der Eingabe in das Duodenum (Figur 1) zu blockieren. Hinweis: Dies ist ein wichtiger Schritt, da sie bestimmt, ob die injizierten Enzyme werden in den Pankreasgang gehen und durchströmen die Bauchspeicheldrüse oder Rücklauf auf die Injektionsstelle (über Klemme) oder gehen Sie in den Zwölffingerdarm (unter Klemme). </li><li> Kanülieren den Gallengang mit einer 31 G-Nadel in der Nähe der Kreuzung der Ductus hepaticus und cysticus (Abbildung 1) und lassen Raum für eine zweite Injektion, wenn the Pankreas versagt, das erste Mal durchströmen. Langsam (~ 10 sec) zu injizieren etwa 2 ml kaltem Enzymgemisch in die Maus Gallengang. ANMERKUNG: Das Pankreas wird schnell perfundiert, wenn sich die Klammer in der richtigen Position ist. </li><li> Stellen Sie die Klemmposition, wenn die Nadel in den Gallengang, sondern kann die Bauchspeicheldrüse nicht Perfusion (dh., Nach oben die Klammer ein wenig weg von der Leber, wenn überspannt oder verschieben Sie sie ein wenig nach unten in die Leber, wenn im Rahmen eingespannt). HINWEIS: Die Nadel geht manchmal in die umgebende Kapsel eher als das Lumen der Leitung. Eine sinnvolle Zeichen zu überprüfen, ob die Nadel innerhalb der Gallengang ist die Erweiterung des Kanals bei der Injektion. Wenn die Bauchspeicheldrüse nicht zu durchströmen, ist eine Alternative die Enzymmischung konnte auf mehrere Standorte der Bauchspeicheldrüse mit geringeren Ausbeute erwartet injiziert werden. Die Perfusion der linken Seite der Bauchspeicheldrüse (Lobus Splenicus) ist wichtig für die Maximierung der Inselausbeute. </li><li> Nachdem der Bauchspeicheldrüse ist perfused, schnell die Bauchspeicheldrüse zu entfernen, legen Sie sie in einem Fläschchen (~ 20 ml Glas) und Inkubation für ~ 19 min in einem 37 ° C Wasserbad. HINWEIS: Die Inkubationszeit kann ein wenig abhängig von der Mausstamm und Alter variieren. </li><li> Nach der Inkubationszeit, stoppen die Verdauung durch Zugabe von ~ 20 ml kaltem Isolationsmedien. Schütteln Sie die Durchstechflasche vorsichtig, um die Bauchspeicheldrüse zu stören und gießen Sie sie durch eine normale Teesieb (Porendurchmesser von 1 mm) in ein steriles 50 ml Tube. Füllen Sie das Rohr mit Isolierung Medien und Zentrifuge bei 400 xg für 1 min bei 4 ° C mit Bremse ab. </li><li> Lösen Sie das Pellet in der Isolierung Medium erneut und übertragen, um zwei 15-ml-Röhrchen, dann bei 400 xg zentrifugieren für 1 min bei 4 ° C mit Bremse ab. Nach dem Absaugen der Überstand, mischen Sie die beiden Pellets auch mit 6 ml Dichtegradient Zellseparationsmedium (Histopaque 1077 Lösung) pro Röhrchen durch Vortexen oder Auf-und Abpipettieren. Dann vorsichtig hinzu ~ 6 ml der Isolierungsmedien zur Seite des Rohres überDer Dichtegradient Trennmedien und zentrifugiert bei 100 g für 15 min bei 4 ° C mit Bremse ausgeschaltet. </li><li> Sammeln Sie den Überstand in der oberen (Isolationsmedien), mittleren und unteren (Dichtegradienten Zelltrennmedien) Schicht in 3 separate Küche. Interpreten Sie die Inseln in diesen 3 Gerichte, mit einer Pipette unter einem Binokular. HINWEIS: Die mittlere Schicht die meisten der Inseln enthält. Inseln werden als kompakte Strukturen von ~ 50 bis 500 um in der Größe (Figur 3) erkannt wird. Wir erhalten ~ 200 Inseln in WT-Mäusen und 300- &lt;100 Inseln in db / db-Mäusen. </li></ol></li><li> Islet Kultivierung <ol><li> Um die Inseln zu gewinnen aus dem Enzymverdau Kulturgruppen von 40 Inseln in einer 25 cm Petrischale mit 6 ml RPMI-Kulturmedium (10 mM Glukose) bei 37 ° C, 5% / 95% CO 2 / O 2 für 2 Tage vor der Live -Zelle 2-Photonen-Bildgebung. Ändern Sie den Kulturmedien täglich. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Live Cell 2-Photonen-Imaging <ol><li> Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Extrazelluläre Puffer <ol><li> Vorbereitung der extrazellulären Natriumpuffer für die 2-Photonen-Assay mit 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 5 mM NaHCO 3 und 10 mM HEPES. </li></ol></li><li> Extrazelluläre Dye <ol><li> Für die 2-Photonen-Test vorbereiten stock SRB 8 mM in extrazellulären Puffer, aliquoten in kleine Rohre und bei -20 ° C. Von der Stamm SRB 1:10 in frischem extrazellulären Puffer auf eine Arbeitskonzentration von 0,8 mm zu erhalten. </li></ol></li></ol></li><li> Photonen-Imaging <ol><li> Erste, vorge inkubieren 2 Tage kultivierte Inseln in 3 mM Glucose extrazelluläre Puffer für 30 min. HINWEIS: Wir verwenden Inselchen zwischen 2 und 5 Tagen in Kultur. </li><li> Dann legen Sie eine Objektträger auf die auf dem Mikroskoptisch montiert thermo-Steuerkammer. Verwenden Sie Fett auf das Austreten von Lösung zu verhindern. </li><li> Decken Sie die Kammer mit 500 ul extradere Puffer, enthaltend 0,8 mM SRB mit unterschiedlichen Glukosekonzentrationen (3 mm, 6 mm, 15 mm und 20 mM Glucose). </li><li> Als nächstes legen Sie die vorinkubierten kleine Insel in der Mitte der Kammer und konzentrieren sich auf 3-4 Zellschichten in der kleinen Insel, wo, in Nagetier Inselchen, Immunfärbung für Insulin zeigt, dass die meisten Zellen sind beta-Zellen. HINWEIS: Die SRB alle die Zellmembran der Insel schnell zu skizzieren und die kleine Insel ist bereit, image. </li><li> Verwenden Sie eine 2-Photonen-Mikroskop mit einem 60x Ölimmersionsobjektiv (NA 1,42) und Imaging-Software (z. B. scanimage 11). Abbildung 4 zeigt eine typische Anordnung Mikroskopie. Bild Exozytose-Ereignisse mit SRB als Membran impermeante Fluoreszenzextrazellulären Marker durch Femtosekundenlaserpulsen bei 880 nm angeregt, mit Fluoreszenz bei 550-650 nm detektiert. Notieren Sie die Antworten auf die Insel Stimulation. </li><li> Identifizieren Sie einzelne Exozytose-Ereignisse durch das plötzliche Erscheinen eines kleinen fluoreszierenden Flecks (Auflösung 10 Pixel /1, m) und bestätigen Sie mit der schnell ansteigenden Phase des Fluoreszenzsignals über einen Bereich von Interesse (~ 0,78 um 2). </li></ol></li></ol>

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	<li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035.">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).</li><li>Ashcroft, F. M., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus+and+the+beta+cell:+The+last+ten+years.">Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years.</a> Cell. 148, 1160-1171 (2012).</li><li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes.">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53, S16-S21 (2004).</li><li>Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+hyperglycemia,+independent+of+plasma+lipid+levels,+is+sufficient+for+the+loss+of+beta-cell+differentiation+and+secretory+function+in+the+db/db+mouse+model+of+diabetes.">Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes.</a> Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).</li><li>Wang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+type+2+diabetic+rodent+models.">Spontaneous type 2 diabetic rodent models.</a> Journal of Diabetes Research. , (2013).</li><li>Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+a+new+mutation+in+mouse.">Diabetes a new mutation in mouse.</a> Science. 153, 1127-1128 (1966).</li><li>Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretory+deficit+in+islets+from+db/db+mice+is+mainly+due+to+a+loss+of+responding+beta+cells.">The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells.</a> Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).</li><li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+principally+regulates+insulin+secretion+in+mouse+islets+by+controlling+the+numbers+of+granule+fusion+events+per+cell.">Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell.</a> Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).</li><li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet.">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297, 1349-1352 (2002).</li><li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature.">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

Der wichtigste Faktor für die Inselisolierung ist die anfängliche Durchblutung des Pankreas; ein unter perfundierten Pankreas führt zu einem erheblich niedrigeren Inselausbeute. Andere Faktoren, die auch Auswirkungen auf die Isolierung Qualität wie die Aufschlusszeit und der Höhe der Erschütterung, die teilweise für die Höhe der Durchblutung zu kompensieren könnte. Zum Beispiel wird ein voll durchströmten Bauchspeicheldrüse müssen bei 37 ° C für ~ 18 min 30 sec inkubiert werden unter leichtem Schütteln im...

Die Rolle der Betazelldysfunktion bei Krankheiten ist allgemein anerkannt, 3,4. Zelllinien, wie der MIN6 und INS-1 sind nützliche Werkzeuge, um die Biologie von Beta-Zell-Verhalten zu verstehen. Allerdings ist die physiologische Kontrolle der Insulinsekretion findet innerhalb der Langerhans-Inseln. Diese Inseln enthalten Tausenden eng gepackten Beta-Zellen, sowie Blutgefäße und anderen endokrinen Zelltypen. Diese Umgebung innerhalb des Insel beeinflusst Insulinsekretion und dürfte bei Diabetes wichtig. Um daher die physiologischen Kontrolle der Insulinsekretion und die Pathophysiologie der Erkrankung zu verstehen, ist es wichtig, intakte Inseln studieren. Inselisolierung Live menschlichen Inselchen und insbesondere menschlichen Inselzellen vom Typ 2-Diabetes-Patienten sind schwer zu bekommen. Darüber hinaus haben die menschliche Inselzellen begrenzte Möglichkeiten für experimentelle molekulare Manipulation. Forscher haben daher eingesetztekönnen aus Tieren und Tiermodellen des Typ 2 Diabetes. Ein solcher Krankheitsmodell ist der db / db-Maus. Dies ist eine spontane Mutation, die Models Typ-2-Diabetes mit einem Phänotyp Progression, die menschliche Krankheit 5,6 eng Parallelen. Die für die Inselisolierung aus diabetischen db / db Mäusen hier vorgestellten Protokoll hat viele Schritte gemeinsam mit anderen Gruppen mit einigen Verfeinerungen für bessere Ausbeute, Reinigung und verbesserte Insellebens. 2 Photonen-Imaging Die Live-cell 2-Photonen-Assay hier beschriebenen ermöglicht es Forschern, um die Anzahl zu quantifizieren und zu bewerten die Merkmale der einzelnen insulinhaltigen Granulat aus vielen Zellen der diabetischen 7 und Wildtyp-Inselchen 8,9.

<table><tbody><tr><td>Liberase TL 5 mg</td><td>Roche</td><td>-5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type IV-1g</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 500 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (10x) 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R1383</td><td>to prepare isolation media</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (1x) 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21870-076</td><td>to prepare cultured media</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 100 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>to prepare cultured media&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>to prepare cultured media</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11966-025</td><td>to dilute the liberase</td></tr><tr><td>Metamorph program</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td>to analyze the 2-photon images</td></tr></tbody></table>

leprdb mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets

Typ 2-Diabetes ist eine chronische Krankheit, die 382 Millionen Menschen im Jahr 2013 und wird voraussichtlich bis zu 592 Mio. im Jahr 2035 1 steigen. In den letzten 2 Jahrzehnten die Rolle der Beta-Zell-Dysfunktion bei Typ 2 Diabetes wurde klar festgelegt 2. Forschung Fortschritte Methoden zur Isolierung von Langerhans-Inseln erforderlich. Das Protokoll der Inselisolierung hier präsentierten viele gemeinsame Schritte mit Protokollen von anderen Gruppen, mit einigen Änderungen, um die Ausbeute und Qualität der isolierten Inseln sowohl aus dem Wildtyp und diabetischen Lepr db (db / db) Mäusen zu verbessern. Ein Live-Zelle der 2-Photonen-Abbildungsverfahren wird dann präsentiert, die verwendet werden können, um die Kontrolle der Insulinsekretion in Inseln zu untersuchen.

Islet Ausbeute und Reinigung Für eine normale Wildtyp-Maus, werden etwa 200 kleine Inseln erwartet. Gesunde Inseln aussehen hell, rund geformt und haben einen glatten Rand. Eine Über verdaut Isolierung Charge hat in der Regel klein und Fuzzy-Inseln, während ein Unter verdaut Charge hat weniger kleine Inseln und Inselchen Azinuszelltumoren angebracht (Abbildung 3). Für diabetischen db / db-Mäuse, die kleine Insel Ausbeute und Aussehen abhängig von der Krankheitsprogress...

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Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

leprdb-mouse-model-type-2-diabetes-pancreatic-islet-isolation-live

Research

JoVE Journal

Medicine

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

9.4K Aufrufe.  The University of Queensland. We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Serie: Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of pancreatic tissue, such as the rat pancreas, and to increase the number of channels (cell types) that may be studied in a single specimen. We further describe the implementation of a number of computational tools that provide: 1/ accurate positioning of a specimen's (in our case the pancreas) centre of mass (COM) at the axis of rotation (AR)2; 2/ improved algorithms for post-alignment tuning which prevents geometric distortions during the tomographic reconstruction2 and 3/ a protocol for intensity equalization to increase signal to noise ratios in OPT-based BCM determinations3. In addition, we describe a sample holder that minimizes the risk for unintentional movements of the specimen during image acquisition. Together, these protocols enable assessments of BCM distribution and other features, to be performed throughout the volume of intact pancreata or other organs (e.g. in studies of islet transplantation), with a resolution down to the level of individual islets of Langerhans.

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &#946;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

We describe the adaptation of optical projection tomography (OPT)1 to imaging in the near infrared spectrum, and the implementation of a number of computational tools. These protocols enable assessments of pancreatic &beta;-cell mass (BCM) in larger specimens, increase the multichannel capacity of the technique and increase the quality of OPT data.

Near Infrared Optical Projection Tomography für Assessments von β-Zellen Massenverteilung im Diabetes Research

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

Forschung

Medizin

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biologie

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

Beobachtung der Inselfunktion und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen in lebenden Pankreasgewebeschnitten

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Immunologie und Infektion

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology have been developed and utilized in vivo, they are limited in terms of allowing single cell resolution and continuous longitudinal recordings. Because of the transparency of the cornea, the anterior chamber of the eye (ACE) in mice is well suited to study human and mouse pancreatic islet cell biology. Here is a description of how this approach can be used to perform continuous longitudinal recordings of grafting and revascularization of individual human islet grafts. Human islet grafts are inserted into the ACE, using NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mice as recipients. This allows for the investigation of the expansion of recipient versus donor cells and the contribution of recipient cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft. Further, a step-by-step approach for image analysis and quantification of the islet volume or segmented vasculature and islet capsule forming recipient cells is outlined.

The goal of this protocol is to continuously monitor the dynamics of the human pancreatic islet engraftment process and the contributing host versus donor cells. This is accomplished by transplanting human islets into the anterior chamber of the eye (ACE) of an NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mouse recipient followed by repeated 2-photon imaging.

Längsschnitt in Vivo Bildgebung und Quantifizierung der menschlichen Pankreas-Islet-Grafting- und Beitragenden Wirtszellen in der Vorderen Augenkammer

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging study, with an abdominal imaging window, enabled visualization of the cellular dynamics in abdominal organs in vivo. However, due to the soft sheet-like architecture of the mouse pancreas that can be easily influenced by physiologic movement (e.g., peristalsis and respiration), it was difficult to perform stabilized longitudinal in vivo imaging over several weeks at the cellular level to identify, track, and quantify islets or cancer cells in the mouse pancreas. Herein, we describe a method for implanting a novel supporting base, an integrated pancreatic intravital imaging window, that can spatially separate the pancreas from the bowel for longitudinal time-lapse intravital imaging of the pancreas microstructure. Longitudinal in vivo imaging with the imaging window enables stable visualization, allowing for the tracking of islets over a period of 3 weeks and high-resolution three-dimensional imaging of the microstructure, as evidenced here in an orthotopic pancreatic cancer model. With our method, further intravital imaging studies can elucidate the pathophysiology of various diseases involving the pancreas at the cellular level.

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

In vivo high-resolution imaging of the pancreas was facilitated with the pancreatic intravital imaging window.

Stabilisierte longitudinale In Vivo Visualisierung der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene in einem Murinenmodell mit einem Pankreas-Intravital-Bildgebungsfenster

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study insulin granule exocytosis either use electrophysiology or microscopy coupled to the expression of fluorescent reporters. However most of these techniques have been optimized for clonal cell lines or require dissociating pancreatic islets. In contrast, the method presented here allows for real time visualization of insulin granule exocytosis in intact pancreatic islets. In this protocol, we first describe the viral infection of isolated pancreatic islets with adenovirus that encodes a pH-sensitive green fluorescent protein (GFP), pHluorin, coupled to neuropeptide Y (NPY). Second, we describe the confocal imaging of islets five days after viral infection and how to monitor the insulin granule secretion. Briefly, the infected islets are placed on a coverslip on an imaging chamber and imaged under an upright laser-scanning confocal microscope while being continuously perfused with extracellular solution containing various stimuli. Confocal images spanning 50 &#181;m of the islet are acquired as time-lapse recordings using a fast-resonant scanner. The fusion of insulin granules with the plasma membrane can be followed over time. This procedure also allows for testing a battery of stimuli in a single experiment, is compatible with both mouse and human islets, and can be combined with various dyes for functional imaging (e.g., membrane potential or cytosolic calcium dyes).

We describe a protocol for visualization of insulin exocytosis in intact islets using pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein. Isolated islets are infected with adenovirus encoding pHluorin coupled to the vesicle cargo neuropeptide Y. This allows for the detection of insulin granule fusion events by confocal microscopy.

Confocal Imaging von Neuropeptid Y-pHluorin: eine Technik, um Insulin Granulat Exozytose in intakten murinen und menschliche Inseln visualisieren

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet infusion is far from ideal and therefore, the omentum is re-emerging as a potentially valuable site for islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and the implantation of the islets to the diabetic recipients. Transplantation to the omentum requires surgical steps that can be better demonstrated visually. Here, the detailed steps for this procedure are presented. Two methods of mixing the isolated islets with hydrogel before placing the mixture into the omental pouch of diabetic mice are described here. Different hydrogels are used for the different conditions. Blood glucose levels of diabetic mouse recipients of syngeneic islets in the omentum were monitored for up to 35 days. Some animals were sacrificed after 14 days to perform immuno-histochemical analysis. This pre-clinical transplantation approach can be used as preliminary data leading up to translation to clinical transplantation.

A method for the omental transplantation of islets in a mouse is introduced. The isolated islets are mixed with hydrogel and the mixture is placed into the omental pouch of a diabetic mouse. Then, the blood glucose is monitored, and immuno-histochemical analysis is performed.

Eine Methode zur Inselversetzung, Omentum in Maus

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails significantly fewer preparation-induced changes than isolated islets, acini, ducts, or dispersed cells described in typical in vitro studies. By combining the acute pancreatic tissue slice with live-cell calcium imaging in confocal laser scanning microscopy (CLSM), calcium signals can be studied in a large number of endocrine and exocrine cells simultaneously, with a single-cell or even subcellular resolution. The sensitivity permits the detection of changes and enables the study of intercellular waves and functional connectivity as well as the study of the dependence of physiological responses of cells on their localization within the islet and paracrine relationship with other cells. Finally, from the perspective of animal welfare, recording signals from a large number of cells at a time lowers the number of animals required in experiments, contributing to the 3R-replacement, reduction, and refinement-principle.

We present the preparation of acute pancreatic tissue slices and their use in confocal laser scanning microscopy to study calcium dynamics simultaneously in a large number of live cells, over long time periods, and with high spatiotemporal resolution.

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie der Calciumdynamik in akuten Pankreasgewebeschnitten der Maus

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

Grafting Pancreatic Islets: A Method to Implant Pancreatic Islets into the Anterior Chamber of the Mouse Eye for In Vivo Imaging

Source: Nilsson, J.et. al.&#160;<a href="https://www.jove.com/v/61234/" target="_blank">A Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber</a>. J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the protocol for grafting human pancreatic islets into the anterior chamber of the mouse&#8217;s eye to monitor revascularization of human islet grafts in vivo. It also helps to understand the contribution of recipient versus donor cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft.

Transplantation von Pankreasinseln: Eine Methode zur Implantation von Pankreasinseln in die vordere Kammer des Mausauges für die In-vivo-Bildgebung

Source: Nilsson, J.et. al.&#160;A Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Krebsforschung

Pancreatic Cancer

Assays & techniques

Intravital Imaging: A Method for Cellular Level Observation of the Mouse Pancreas Through a Stabilized Imaging Window

Source: Park, I. and Kim, P. <a href="https://www.jove.com/v/62538">Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window.</a> J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we describe the intravital imaging of a mouse pancreas through a stabilized window for long-term visualization of cellular dynamics.

Intravitale Bildgebung: Eine Methode zur Beobachtung der Bauchspeicheldrüse der Maus auf zellulärer Ebene durch ein stabilisiertes Bildgebungsfenster

Source: Park, I. and Kim, P. Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital ...

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