Unser Protokoll wird dazu beitragen, die Auswirkungen von Immunzellinteraktionen auf die Inselfunktionalität zu beantworten. Die Methode des lebenden Pankreasgewebeschnitts ermöglicht es, die Physiologie und Funktion der Inseln zu untersuchen, während die zugrunde liegenden Gewebe und die native Mikroumgebung erhalten bleiben. Diese Methode könnte Einblicke in die Krankheitsprozesse von Pankreaserkrankungen wie Pankreatitis, Typ-I-Diabetes und Typ-II-Diabetes geben.
Ordnen Sie zunächst die Blöcke auf dem Probenhalter so an, dass sie die Klingenbreite nicht überschreiten, um sicherzustellen, dass sich die Klinge bei langsamer Bewegung des Vibratoms so weit wie möglich vorwärts bewegen kann. Tragen Sie eine Linie VonKleber auf den Probenhalter auf, machen Sie eine dünne Schicht mit dem Ende des Leimspenders und drehen Sie dann die Gewebeblöcke auf den Kleber, so dass die Seite in der Nähe des Gewebes nach oben zeigt. Drücken Sie die Blöcke vorsichtig nach unten und lassen Sie den Kleber drei Minuten trocknen.
Als nächstes befestigen Sie die Platte mit einer Schraube am Vibratom und stellen Sie die Klingenhöhe und den zurückgelegten Weg so ein, dass sich die Klinge über die Länge der Blöcke und nur knapp darüber bewegt. Stupsen Sie die Blöcke vorsichtig mit der Pinzette an, um zu überprüfen, ob der Kleber getrocknet ist, und füllen Sie dann die Vibrationsschale mit einer gekühlten extrazellulären Lösung, bis die Klinge bedeckt ist. Stellen Sie das Vibratom ein, um Scheiben von 120 Mikrometer Dicke zu machen und starten Sie es, dann beobachten Sie die Scheiben, die von den Gewebeblöcken kommen.
Heben Sie die Scheiben an, wenn sie vom Block schwimmen, indem Sie einen Pinsel oder eine Pinzette darunter legen und die Scheiben in den Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer legen, der drei Millimolar D-Glucose und Trypsin-Inhibitor enthält. Legen Sie die Platten mit den Scheiben auf eine Wippe und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für eine Stunde bei 25 U / min. Wenn die Scheiben länger aufbewahrt werden müssen, legen Sie die Scheiben in 15 Milliliter Scheibenkulturmedium und legen Sie die Platte in einen Inkubator.
Inkubieren Sie die vorbereiteten Scheiben bei 37 Grad Celsius für Studien am selben Tag oder übertragen Sie die Scheiben, die bei 24 Grad Celsius über Nacht kultiviert werden, mindestens eine Stunde vor dem Experiment auf 37 Grad Celsius. Schalten Sie das Mikroskop mindestens eine Stunde vor der Aufnahme ein und balancieren Sie den Bühnen-Top-Inkubator auf 37 Grad Celsius. Befestigen Sie die Boden petrischale des Deckglases mit der Scheibe auf der Bühne.
Fokussieren Sie das Mikroskop, indem Sie das 10-fache Objektiv in den Hellfeldmodus stellen, und lokalisieren Sie die Inseln im Hellfeldmodus, indem Sie nach orangebraun gefärbten Ovalen innerhalb der Scheibe suchen. Schalten Sie das Mikroskop auf konfokale Bildgebung um, indem Sie die CS-Taste auf dem Touchscreen-Controller des Mikroskops drücken. Um die Inseln mit Reflexion zu betrachten, schalten Sie den Laserdetektor 638 und den PMT-Detektor ein.
Stellen Sie die Laserleistung zwischen eins und 2% ein und schalten Sie die Kerbfilter aus. Verwenden Sie den 405-Nanometer-Laser und den PMT-Detektor, um die Nukleinsäurefärbung zu beobachten. Der Hybriddetektor für den CD8-Antikörpernachweis und der 488-Nanometer-Laser und Hybriddetektor zur Betrachtung des Insulintetramers.
Zentrieren Sie die gewünschte Insel im Sichtfeld mit den X- und Y-Reglern des Bühnenreglers. Sobald eine Insel von Interesse gefunden ist, wechseln Sie zum 20-fachen Objektiv und zoomen Sie hinein, so dass die Insel den größten Teil des Bildes einnimmt. Nehmen Sie einen Z-Stapel der Insel und finden Sie dann die besten optischen Abschnitte, in denen die Zellen am Leben sind und alle umgebenden Immunzellen im Fokus stehen.
Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass es im XYZT-Modus aufzeichnet, und optimieren Sie die Einstellungen, um alle 20 Minuten über einen Zeitraum von mehreren Stunden einen Z-Stack der ausgewählten Schritte aufzuzeichnen. Die Inseln in einem Pankreasgewebeschnitt wurden mittels Hellfeld- und Auflichtmikroskopie visualisiert. Das Insulin in den Inseln erhöht die Granularität und verursacht die Absorption großer Mengen an reflektiertem Licht, wodurch die Sichtbarkeit der Inseln erhöht wird.
Die Lebensfähigkeit eines lebenden menschlichen Pankreasgewebeschnitts wurde durch Färbung beurteilt. Die lebenden Zellen sind grün und die toten Zellen blau dargestellt. Ein weiterer positiver Indikator für die Lebensfähigkeit ist die beobachtbare Basalaktivität.
Wenn eine lebende Pankreasscheibe mit einem zelldurchlässigen Kalziumindikator beladen wurde, wurde eine Glukosestimulation sowohl in Maus- als auch in menschlichen Pankreasscheiben beobachtet. Die Fluoreszenz einzelner Zellen während der Glukosestimulation wurde ebenfalls quantifiziert. Intakte und erkrankte Inseln wurden mittels Dithizonfärbung und Auflichtmikroskopie beobachtet.
Die erkrankten Inseln beginnen aufgrund von Immunzellinfiltration und Zelltod an Granularität zu verlieren. Immunzellpopulationen können mittels CD8-Antikörpern und Insulintetramer-Färbung identifiziert werden. Die Co-Färbung zeigt an, dass es sich bei den Zellen um Effektor-T-Zellen handelt, die speziell auf das Insulinantigen abzielen.
Das Wichtigste, woran Sie sich bei diesem Verfahren erinnern sollten, ist, die Scheiben jederzeit in Lösungen proteaseinhibitor zu halten. Nach diesem Verfahren können zahlreiche Funktionalitäten in Immunzellexperimenten durchgeführt werden, die es ermöglichen, die Wirkung von Immunzellinteraktionen und Inselfunktion zu untersuchen.
