Die Aufständischen brauchen die Behandlung von Hautwunden. Um Ihre Zielmoleküle für medikamentöse Behandlungen zu identifizieren, sind In-vitro- und In-vivo-Testsysteme erforderlich. Geeignete Systeme sind der In-vitro-Scratch-Assay und die in vivo dorsale Hautfaltkammer.
Beides sind geradlinige Verfahren zur Überwachung der Zellmigration und der Wundheilung der Haut, in Abwesenheit und Vorhandensein von pharmakologisch aktiven Verbindungen. Obwohl beide Techniken geradlinig sind, sollten die Ermittler die Kratzeranwendung üben. Und die dorsale Hautfaltenkammerimplantation, und Wundung, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.
Die Demonstration der Verfahren wird von Dr. Matthias Laschke, Chirurg und Professor am Institut für klinische und experimentelle Chirurgie, durchgeführt. Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, verwenden Sie einen ultrafeinen permanenten Marker, um eine sechs Well-Platte pro Zelltyp zu markieren, mit einer horizontalen Linie an der Unterseite jedes Brunnens, um den Kratzbereich für jede Kultur zu markieren. Next Platte Primärfaser Explosionen isoliert von wilden Typ und Beta 3 mangelhafte Mäuse, in einer sechs Brunnenplatte bei einem 5 mal 10 bis die fünfte Faser Explosionen pro Brunnen Konzentration.
In 2 ml DMEM ergänzt mit 10%fetalem Rinderserum. Beschriften Sie die Platten mit Zelltyp, Genotyp und Datum. Und legen Sie die Platten in den Zellkultur-Inkubator für 24 Stunden.
Am nächsten Morgen fügen Sie 9 Mikroliter jedes lipidbasierten Transfektionsreagenz von Interesse, einzelne Mikrozentrifugenrohre mit 150 Mikroliter reduzierts Serummedium pro Tube. Fügen Sie 1,5 Mikroliter siRNA zu einem zweiten Mikrozentrifugenrohr pro Transfektionsreagenz hinzu, das 150 Mikroliter reduziertes Serummedium pro Tube enthält. Und mischen Sie jede siRNA-Lösung mit einer einzigen Röhre Transfektionsreagenzlösung.
Nach kurzwirbeln der Mischungen bei 21 Grad Celsius für 5 Minuten. Während der Inkubation sorgfältig ersetzen Sie das Supernate in jedem Brunnen. Mit 2,25mL frisches Kulturmedium auf der Seite der Brunnen.
Am Ende der Inkubation 250 Mikroliter der entsprechenden siRNA-Transfektionsreagenzmischung hinzufügen, weise in jeden entsprechenden Bohrkörper der Zellen fallen lassen. Und geben Sie die Platten für 72 Stunden an den Zellkultur-Inkubator zurück. Wenn die Zellen 100% Konfluenz erreicht haben, entsorgen Sie den Kulturüberstand aus jedem Brunnen.
Und verwenden Sie eine 200 Mikroliter Pipettenspitze, um Kratzer in der konfluenten Zellmonolayer zu schaffen. Vertikal zur markierten horizontalen Linie am unteren Rand jedes Brunnens. Dann sorgfältig spülen sie jede verwundet e2 mal mit 2ml PPS pro Wäsche gut.
Um freigesetzte Faktoren aus den beschädigten Zellen, losen Zellen oder Ablagerungen aus dem zerkratzten Bereich zu entfernen. Nach der zweiten Wäsche fügen Sie 2ml Frischzellenkultur Medium mit 1 oder 10 Prozent Serum zu jedem Brunnen ergänzt. Und nehmen Sie Bilder der Wunden in jeder Platte auf der Bühne eines Lichtmikroskops auf.
Unmittelbar nach dem Kratzen bei einer 10-fachen Vergrößerung. Dann geben Sie die Platte an den Zellkultur-Inkubator zurück. Fortsetzung der Aufnahme von Bildern zu den entsprechenden experimentellen Zeitpunkten für die nächsten 30 Stunden.
Am Ende des Experiments quantifizieren Sie den anfänglichen zellfreien Bereich und den verbleibenden Bereich nach 6, 10 und 30 Stunden Kultur. Bestimmen Sie den Prozentsatz des Scratch-Bereichs, der von den migrierenden Zellen relativ zum ursprünglichen Scratch-Bereich neu aufgefüllt wird. Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifen, in der wilden Art oder Beta drei Knockout C57 schwarze sechs Maus, vorsichtig rasieren Sie das Dorsum.
Und Salbe auf die Augen des Tieres auftragen. Tragen Sie Enthaarungscreme auf, um verbleibende Haare zu entfernen. Entfernen Sie die Creme nach 10 Minuten.
Um die Titankammer vorzubereiten, befestigen Sie einen Teil des symmetrischen Titankammerrahmens mit den Verbindungsschrauben mit Muttern. Zur Aufrechterhaltung von 400 bis 500 Mikrometern zwischen den beiden symmetrischen Teilen der Kammer. Um eine Kompression der Blutbläschen in der Haut zu vermeiden.
Desinfizieren Sie die exponierte Haut mit 70% Ethanol. Und greifen Sie eine Hautfalte vor einer Lichtquelle. Positionieren Sie die Mittellinie der doppelten Hautschicht an der Stelle, an der die Titankammer implantiert wird.
Und kranially und kauarisch die Hautfalte mit einer Polypropylen-Nähte fixieren. Ziehen Sie die andere Seite der Naht auf einem Metallgestell an, um die gefaltete Haut zu heben. Und stellen Sie die Höhe des Racks ein, damit die Maus bequem sitzen kann.
Bedecken Sie den ersten Rahmen der Titankammer durch Polypropylen-Nähte auf ihr überlegene Kante zur Rückseite der dorsalen Hautfalte. Nach der erneuten Sedierung verwenden Sie feine Schere, um kleine Schnitte in der Haut zu machen. Und passieren Sie die beiden Verbindungsschrauben, die an der ersten Hälfte der Titankammer befestigt sind, durch die Basis der Hautfalte.
Entfernen Sie die Maus aus dem Rack, und legen Sie das Tier in eine seitliche Position. Legen Sie die zweite kostenlose Hälfte der Titankammer auf die 3 Verbindungsschrauben. Und manuell leichten Druck ausüben, um diese Schrauben durch die zweite Hälfte des Titanrahmens zu passieren.
Die gefaltete Hautschicht ist nun zwischen den beiden symmetrischen Hälften des Titanrahmens eingeklemmt. Dann beide symmetrischen Teile mit Edelstahlmuttern fixieren. Markieren Sie mit einem standardisierten Biopsie-Punch mit 2 ml Durchmesser den Wundbereich in der Hautmitte innerhalb des Beobachtungsfensters der Hautfaltkammer.
Und verwenden Sie feine Zangen und Scheren, um die gesamte Epidermis und Dermis innerhalb der Marke zu entfernen. Um eine kreisförmige Wunde zu erstellen. Reinigen Sie die 3einhalb bis viereinhalb Meter quadratische Wunde mit 0,5 ml steriler Saline.
Und bedecken Sie die Wunde mit einem Glasdeckel. Verwenden Sie die Schnappringzange an der Titankammer, um den Deckelschlupf an Ort und Stelle zu fixieren. Und übertragen Sie die Maus sofort auf die Bildstufe eines Stereomikroskops.
Dann stellen Sie die Wunde bei einer 40-fachen Vergrößerung ab. Bevor Sie die Maus in einen Käfig mit Überwachung bis zur vollständigen Wiederherstellung. Nachdem ein Kratzer mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze erstellt wurde, wie in diesem repräsentativen Experiment gezeigt wurde, wanderten Zellen beider Genotypen in den Kratzbereich und schlossen die Lücke.
Die Zellmigration wurde dann als Prozentsatz der Scratch-Fläche quantifiziert, die 6 Stunden nach dem Durchführen des Scratchs durch migrierende Zellen neu aufgefüllt wurde. In diesem Experiment wurde z. B. cav beta 3-Mangelfaserstrahlen den Kratzbereich deutlich früher geschlossen als Faserstrahlen von Wildtypmäusen. Um den Cav beta 3 abhängigen Effekt zu bestätigen, der in Cav beta 3-Mangelfaserstrahlen beobachtet wurde, wurden Wild-Typ-Faserstrahlen mit siRNA transfiziert, um das Cav beta 3 Protein zu regulieren.
Faserstrahlen, die mit den Cav beta 3 spezifischen siRNAs behandelt wurden, verhielten sich wie Beta-3-Mangelfaserstrahlen. Um die Wundheilung der Haut zwischen beiden Genotypen zu vergleichen, wurde der Wundbereich in der Hautfaltkammer direkt nach der Wunde fotografiert. Und die Wunde wurde in den nächsten 2 Wochen abgebildet.
Die Größe der Wunden wurde auf den Bildern und der Wundfläche gemessen, an einem bestimmten Tag wurde als prozentsatz der ursprünglichen Wundfläche ausgedrückt. Wie erwartet wurde die Rate des Wundverschlusses bei Cav beta 3-Mäusen mit Mangelanmäusen im Vergleich zu Wildtypkontrollen erhöht. Achten Sie darauf, gleichen Druck auf die Pipette Spitze, für jeden Kratzer zu üben und die Kratzer an die markierten Linien auf dem Plattenboden so nah wie möglich zu entsprechen.
Das Beobachtungsfenster der dorsalen Hautfaltkammer kann jederzeit während des Heilungsprozesses geöffnet werden. Die topische Anwendung verschiedener pharmakologisch aktiver Verbindungen ermöglicht. Es ist auch möglich, den verwundeten Bereich in verschiedenen Stadien des Heilungsprozesses zu verbrauchen.
Für molekulare Proteinbiochemische oder histologische Analysen.
