Die ursprüngliche GFP-Pem1 war ein Geschenk von Dr. Lei Li. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der NIH und der Ellison Medical Foundation zu VG und AS unterstützt

In diesem Protokoll beschreiben wir die Methode zur Analyse von DNA-DSB-Reparatur mit chromosomal integrierter Reporter-Konstrukte 1,2, wo DSBs in vivo durch transiente Expression einer seltenen Schneiden Endonuklease I-SceI 3 sind induziert. Der integrierte Test bietet den Vorteil einer Analyse der DSB-Reparatur innerhalb der chromosomalen Kontext. Allerdings erfordert dieses Protokoll verlängert Zelle Passagieren, was problematisch sein kann, wenn die Arbeit mit Primärzellen. Ein alternativer Ansatz ist eine extrachromosomale Test, bei dem Reporter-Konstrukte in vitro mit I-SceI oder HindIII Endonukleasen verdaut werden und dann in die Zellen transfiziert als lineare DNA. Die exctrachromosomal Assayprotokoll 4 ist ähnlich der integrierten Test unten mit den folgenden Modifikationen. Für die extrachromosomale Test weglassen die Integration von Reporter-Konstrukte und statt Co-Transfektion der Zellen mit 0,5 ug NHEJ Reporterplasmid in vitro mit I-SceI oder HindIII und 0,1 ug pDsRed2-N1 als Transfektion Kontrolle linearisiert. Für die HR-Assay Co-Transfektion von 2 pg HR Reporterplasmid linearisiert mit I-SceI oder HindIII und 0,1 ug pDsRed2-N1. Analysieren Sie die Zellen durch FACS 3 Tage nach der Transfektion. Die extrachromosomale Assay ermöglicht die Analyse der DSB-Reparatur in Primär-Isolate, die Vermeidung umfangreicher Zelle Passagierung und die Erleichterung der Analyse von mehreren Zelllinien. 1. Reporter-Konstrukte für NHEJ und HR Die NHEJ Reporter Kassette 5 enthält ein GFP-Gen mit einem technisch 3 kb-Intron des Gens Pem1 (GFP-Pem1). Die Pem1 Intron enthält einen adenoviralen Exon von Erkennungssequenzen für HindIII und I-SceI Endonukleasen (Abbildung 1a) für die Induktion von DSB flankiert. Die I-SceI Seiten sind in umgekehrter Orientierung. I-SceI hat eine nonpalindromic Erkennungssequenz, erzeugen somit zwei invertierte Seiten unvereinbar DNA-Enden (Abbildung 1c). Inkompatible DNA-Enden am besten imitieren die natürlich vorkommenden DSBs. Die intakte NHEJ Kassette GFP negativ, wie die adenoviralen Exon der GFP ORF stört. Nach Induktion von DSB durch I-SceI, ist die adenovirale Exon entfernt und NHEJ wieder Funktion des GFP-Gens (Abbildung 2). Die Besonderheit dieses NHEJ Reporter ist, dass es ein breites Spektrum an NHEJ Ereignisse erkennen, da das Intron Deletionen und Insertionen tolerieren kann. Die HR-Reporter Kassette 1 (Abbildung 1b) ist ebenfalls auf der GFP-Pem1 basiert. In der HR-Kassette enthält die erste Exon des GFP-Pem1 einem 22 bp-Deletion mit der Aufnahme von drei Restriktionsschnittstellen, I-SceI/HindIII/I-SceI kombiniert. Die Löschung wird sichergestellt, dass GFP nicht durch eine NHEJ Veranstaltung aufgelöst werden. Die beiden I-SceI Seiten sind in umgekehrter Orientierung, so dass I-SceI Verdauung unvereinbar Enden (Abbildung 1c) verläßt. Das erste Exemplar des GFP-Pem1 wird durch eine promoter-less/ATG-less ersten Exon-und Intron des GFP-Pem1 gefolgt. Die intakte Konstrukt GFP-negativ. Nach Induktion einer DSB durch I-SceI Verdauung der funktionellen GFP-Gen wird durch intra-oder intermolekularen Genkonversion zwischen den beiden mutierten Kopien der ersten GFP-Pem1 Exon rekonstituiert. Da die zweite Kopie des GFP-Gens fehlt das erste ATG-Codon und das zweite Exon, überqueren oder Einzelstrang-Glühen wird nicht zur Wiederherstellung der GFP-Aktivität. Dieses Design ermöglicht die ausschließliche Detektion von Gen-Umwandlung, die die vorherrschende HR Weg in Säugerzellen (Abbildung 3). 2. Integration der Reporter-Konstrukte in das Genom <ol><li> Machen Sie eine qualitativ hochwertige Vorbereitung NHEJ oder HR-Reporter-Plasmid. Für beste Ergebnisse verwenden Qiagen Endo Free Kit. Messen Sie Plasmid-Konzentration und Reinheit durch Absorption bei 260/280 nm. </li><li> Linearisieren 10 ug des Reporter-Plasmid durch Verdau mit 50 U der NheI in 50 ul (Gesamtvolumen der Reaktion) für 6 Stunden in 37 ° C Inkubator (benutzen Sie nicht die trockene Block, um Verdunstung zu verhindern). Purify DNA aus der Aufschlusslösung mit Qiagen QIAExII Kit, eluieren DNA in 20 ul 10 mM Tris-HCl pH 8,0. Messen DNA-Konzentration und Reinheit durch Absorption bei 260/280 nm. In der Regel werden Sie 20-30% der DNA während der Reinigung zu verlieren. Bestätigen Sie die Ausbeute und die Verdauung, indem Sie ein kleines Aliquot (2 ul) auf einem Gel zusammen mit einer unverdauten Reporter-Konstrukt. Das gereinigte linearisiert Reporter-Konstrukt kann bei 20 ° C gelagert werden </li><li> In Vorbereitung für die Transfektion, bringen die Zellen, die besten Wachstumsbedingungen. Wenn ab einem gefrorenen Fläschchen, spaltete sich die Zellen zweimal vor der Transfektion. Wenn ab einer Platte von konfluenten Zellen, teilen Sie sie einmal. </li><li> Wachsen die Zellen zu 70-80% Konfluenz (in der Regel zwei Tage, wenn verchromt 5x10 5 Zellen/100 mm-Platte, für die normale menschliche Fibroblasten). Es ist entscheidend für die beste Transfektionseffizienz der Zellen in logarithmischem Wachstum zu bringen. Aktiv wachsende Kultur enthält Zellen in M-Stadium (gesehen als abgerundete Zellen an der Oberfläche). </li><li> Transfect die Zellen mit Amaxa Nucleofector folgenden Empfehlungen des Herstellers. Für Fibroblasten verwenden NHDF Lösung und Programm U20. Für die Transfektion Ernte der Zellen von zwei 100 mm-Platten (~ 2x10 6 Zellen). Es ist wichtig, nicht über trypsinize den Zellen. Stoppen Trypsinierung, sobald 80% der Zellen von der Platte abgelöst. Resuspendieren der Zellen in NHDF Lösung. Die Zellen sind empfindlich gegen NHDF Lösung, daher Minimierung der Inkubationszeit und mischen Sie die Zellen vorsichtig. Transfizieren die Zellen mit 0,5 ug linearisierte Reporter-Konstrukt. Diese Transfektionsbedingungen, wenn sie mit normalen menschlichen Fibroblasten Ergebnis in der Integration einer einzigen Kopie eines Reporters verwendet für die Mehrheit der Integranten konstruieren. </li><li> Markieren Sie die Zellen mit chromosomal integrierter Reporter-Konstrukte durch Zugabe von 1 mg / mL Geneticin (G418) 24 Stunden nach der Transfektion. Weiter Auswahl für 7-10 Tage. </li><li> Wählen Sie das G418-resistente Kolonien (Sie können einzelne Kolonien oder den Pool der resistenten Klone holen). Erweitern Sie die Kultur auf etwa fünf 100-mm-Platten. Einfrieren drei Platten für die zukünftige Verwendung und erweitern verbleibenden zwei Platten auf die gewünschte Zellzahl (in der Regel zehn 100-mm-Platten sind für fünf Transfektionen ausreichend). </li><li> Wenn die Zellen 70-80% Konfluenz (zwei Tage nach dem Ausplattieren 5x10 5 Zellen pro 100 mm-Platte für Fibroblasten) zu erreichen, werden die Zellen bereit, mit I-SceI exprimierenden Plasmid transfiziert werden. </li></ol> 3. Induktion von DSB durch transiente Expression von I-SceI Endonuclease <ol><li> Transfizieren ~ 2x10 6 Zellen (zwei Platten) von logarithmisch wachsenden Kultur mit einer Mischung aus 5 ug I-SceI exprimierenden Plasmid und 0,1 ug pDsRed2-N1 (Clontech) als Transfektionseffizienz Kontrolle über Amaxa Nucleofector (Verwendung NHDF Lösung und U20-Programm für Fibroblasten ). </li><li> Zur gleichen Zeit bereiten dreimaligem Kalibrier-Kontrollen für FACS durch trasfecting ~ 2x10 6 Zellen mit (i) 5 pg EGFP-exprimierenden Plasmid, (ii) 5 pg pDsRed2-N1, (iii) 5 ug eines Kontroll-Plasmid, das äußert sich nicht fluoreszierendes Protein (wir sind mit einem Plasmid kodiert HPRT Minigen). </li><li> Wachsen die Zellen für vier Tage, um genügend Zeit für die Expression von GFP und DsRed Proteine ​​liefern. </li><li> (Optional) Drei Tage nach der Transfektion überprüft die Effizienz der Transfektion und Expression von GFP und DsRed Proteine ​​mit fluoreszierenden inversen Mikroskop mit Filtern zur Detektion von GFP und DsRed. </li></ol> 4. Die Analyse der GFP + und + DsRed Zellen mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Vier Tage nach der Transfektion Ernte I-SceI transfizierten Zellen und den Kontrollzellen. Resuspendieren der Zellen in 500 ul PBS und Transfer-Zellen, die FACS-Röhrchen. In diesem Stadium ist es wichtig, auf alle Zellen ernten und haben Zellen von runder Form. Um dies zu erreichen, ist es empfehlenswert, eine längere Zeit Trypsinierung oder eine stärkere Trypsin verwenden. Bestätigen Sie, dass 99% der Zellen von der Platte abgelöst und haben runde Form durch die Beobachtung der Zellen unter dem Mikroskop. Halten Sie die Zellen auf Eis lichtgeschützt (Deckel Eiskübel mit Folie). Es ist möglich, die Zellen auf Eis für ein paar Stunden zu speichern. Für die besten Ergebnisse analysieren die Zellen unmittelbar nach der Ernte. </li><li> Kalibrieren FACS mit GFP, DsRed, und den negativen Kontrollen. Passen Sie Spannung und Farbkompensation, um alle die fluoreszierenden Zellen in der Analyse (Abbildung 4) enthalten. Beachten Sie, dass die Fluoreszenzintensität der experimentellen Proben wird niedriger sein als die der Kontrollen. </li><li> Analysieren I-SceI transfizierten Zellen durch FACS. Wir zählen mindestens 20.000 Zellen für jede Behandlung. Um mögliche Interferenzen zwischen GFP und DsRed-Fluoreszenz ist es empfehlenswert, der prozentuale Anteil der GFP + oder DsRed + Zellen unter 25% zu halten. Verhindern Wenn der Anteil der DsRed + oder GFP +-Zellen ist höher reduzieren die Menge der pDsRed2-N1 oder I-SceI Plasmid. In unseren Experimenten haben wir nur benötigt, um die Menge der pDsRed2-N1-Plasmid anpassen, aber nicht von der I-SceI Plasmid. </li><li> Der prozentuale Anteil der GFP +-Zellen entspricht der Effizienz der DNA-DSB-Reparatur und der prozentuale Anteil der DsRed +-Zellen zeigt die Effizienz der Transfektion. Berechnen Sie die relative Effizienz der DNA-DSB-Reparatur als das Verhältnis der GFP + Zellen DsRed + Zellen. </li><li> Das reparierte Ende Kreuzungen kann sequenziert, um die Genauigkeit der Reparatur zu testen. Der Reporter-Konstrukte enthalten E.coli Replikationsursprung und Kanamycin-Resistenz-Genen (Abbildung 1). Dies ermöglicht die Rettung der Konstrukte durch Verdau genomischer DNA mit EcoRI Enzym, Rezirkularisierung und Transformation in kompetente E. coli-Zellen. Die geretteten Plasmide werden dann durch Restriktionsverdau und Sequenzierung analysiert. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Typische FACS Ergebnisse der Kontrolle Transfektionen und NHEJ und HR Experimente sind in den Abbildungen 4 und 5 dargestellt. Fluoreszenzintensität und der Anzahl der fluoreszierenden Zellen niedriger sein wird in der I-SceI transfizierten Zellen mit inteed NHEJ und HR-Konstrukte (Abbildung 5) zu den Kontrollen (Abbildung 4) aufgrund der Differenz in der Kopienzahl von GFP und DsRed Konstrukte in diesen Zellen verglichen. Jede Zelle in dem Experiment enthält nur eine Kopie des integrierten Reporter-Konstrukt wird somit erfolgreicher Reparatur Ereignisse rekonstruieren das GFP-Gen in einem Bruchteil der Zellen. Die Transfektion mit 0,1 ug pDsRed2-N1 in menschlichen Fibroblasten liefert ca. 1 Plasmid Kopie pro Zelle. Die Effizienz der NHEJ und HR wird als Verhältnis von GFP + / DsRed + Zellen berechnet. NHEJ ist ein effizienter Prozess als HR in menschlichen Zellen 2. In menschlichen Fibroblasten der NHEJ Effizienz ist in der Regel 0,6 bis 1,3, und HR-Effizienz ist 0,05-0,3. Da DSB Effizienz als Verhältnis GFP gemessen + / DsRed + Zellen Schwankungen in der Mischung aus I-SceI und DsRed2-N1 Plasmide können das Ergebnis beeinflussen. Die Plasmid-Qualität kann auch Auswirkungen auf die Ergebnisse, indem Transfektionseffizienz. Deshalb, um konsistente Messungen zu erhalten, ist es wichtig, die gleichen Plasmid-Mix in einem Experiment zu verwenden. Darüber hinaus ist der DSB-Reparatur Effizienz durch Zelltyp, Zellzyklus-Phase und chromosomale Lage der integrierten Konstrukte betroffen. <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Reporter-Konstrukte für die Analyse von DNA DSB-Reparatur durch NHEJ (A) und HR (B). (C) Inkompatible DNA-Enden erzeugt durch Verdauung von zwei invertierten I-SceI Websites SD, Splice-Donor, SA, Splice-Akzeptor; schattige Plätze, Polyadenylierungsstellen; Neo / Kana, einzelne ORF durch zwei Promotoren gesteuert:. SV40 verleihen Neomycinresistenz in Säugetierzellen Zellen und β-Lactamase-Verleihung kanamicyn Widerstand in E. coli; Ori, E. Coli pUC Replikationsursprung. <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Reporter für die Analyse von NHEJ konstruieren In diesem Konstrukt das GFP-Gen inaktiv ist;. Aber bei Induktion eines DSB und erfolgreiche NHEJ das Konstrukt wird GFP +. Unten ist eine Reparatur Produkt dieser Reporter von NHEJ. <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Reporter für die Analyse von HR durch Genkonversion konstruieren. Nach Induktion der DSBs durch I-SceI, HR durch Gen-Konversion (GC) wieder her eine aktive GFP-Gen. Hier findest du reparieren Produkte dieser Reporter von den großen DNA-Reparatur-Reaktionswege: GC, Crossing-over (X-over), Einzelstrang Annealing (SSA) und NHEJ. X-over Reparatur Produkt für intramolekulare Rekombination angezeigt wird, wird exramolecular Rekombination das gleiche Produkt, sondern befindet sich auf einem Chromosom. Gene aktiv GFP-Protein (GFP +) sind durch grüne Farbe angezeigt. <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Die Kalibrierung der Parameter für die FACS-Analyse. (A) Fibroblasten mit dem pHPRT transfiziert, verwendet als negative Kontrolle für den Ausschluss von auto fluoreszierenden Zellen. (B) Fibroblasten mit pEGFP Plasmid transfiziert, verwendet für die Einstellung der Gating für GFP +-Zellen (grüner Bereich). (C) Fibroblasten mit pDsRed2-N1-Plasmid, zur Einstellung der Gating für DsRed +-Zellen (rote Fläche) verwendet transfiziert. <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Typische Ergebnisse der Analyse der NHEJ (A) und HR (B) in normale menschliche Fibroblasten mit chromosomal integrierter Reporter-Konstrukte.

<ol>
	<li>Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF2+is+required+for+repair+of+nontelomeric+DNA+double-strand+breaks+by+homologous+recombination.">TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).</li><li>Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+nonhomologous+end+joining+and+homologous+recombination+in+human+cells.">Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells.</a> DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).</li><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+site-specific+endonuclease+stimulates+homologous+recombination+in+mammalian+cells.">Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).</li><li>Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+by+homologous+recombination,+but+not+by+nonhomologous+end+joining,+is+elevated+in+breast+cancer+cells.">DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells.</a> Neoplasia. 11, 683-691 (2009).</li><li>Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+end+joining+becomes+less+efficient+and+more+error-prone+during+cellular+senescence.">DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).</li><li>Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+by+nonhomologous+end+joining+and+homologous+recombination+during+cell+cycle+in+human+cells.">DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells.</a> Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).</li></ol>

Die fluoreszierenden NHEJ und HR-Reporter-Assays bieten eine quantitative Weise gesondert Messen jeder DSB-Reparatur-Weg in vivo. Die Assays sind sehr empfindlich, wie FACS zuverlässig erkennen können 10 GFP +-Zellen in 20.000 Zellen. Die Tests können zur Messung der Reparatur Ereignisse in &quot;real time&quot; durch den Nachweis der Auftritt von GFP +-Zellen innerhalb von Minuten oder Stunden nach der Induktion von DSB 2 angepasst werden. Darüber hinaus ist die Analyse der GFP +-Zellen nicht au...

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>EndoFree Plasmid Maxi kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12362</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Qiaex II Gel Extraction Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>20021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amaxa Nucleofector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>AAD-1001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Geneticin (G418)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11811-031</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pDsRed2-N1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clontech</td>
<td>632406</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Round bottom tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352058</td>
<td>FACS tubes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of dna double-strand break (dsb) repair in mammalian cells

DNA-Doppelstrangbrüche sind die gefährlichsten DNA-Läsionen, die zu einem massiven Verlust an genetischer Information und Zelltod führen kann. Zellen zu reparieren DSBs mit zwei Hauptwege: homologe Ende (NHEJ) und homologe Rekombination (HR). Störungen der NHEJ und HR sind oft mit vorzeitiger Alterung und Tumorgenese verbunden, daher ist es wichtig, eine quantitative Methode zur Messung der einzelnen DSB-Reparatur-Weg haben. Unser Labor hat fluoreszierenden Reporter-Konstrukte, die empfindliche und quantitative Messung der NHEJ und HR erlauben entwickelt. Die Konstrukte werden auf ein konstruiertes GFP-Gen enthält Erkennungsstellen für eine selten-Schneiden I-SceI-Endonuklease für die Induktion von DSB basieren. Der Ausgangspunkt Konstrukte GFP negativ, wie das GFP-Gen durch ein zusätzliches Exon inaktiviert wird, oder durch Mutationen. Erfolgreiche Reparatur der I-SceI-induzierten bricht durch NHEJ oder HR stellt die funktionelle GFP-Gen. Die Zahl der GFP-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie gezählt bietet quantitatives Maß für NHEJ oder HR-Effizienz.

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Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Dieser Artikel beschreibt, GFP-basierte Fluoreszenz-<em&gt; In vivo</em&gt; Assays, die separat homologe Rekombination zu quantifizieren und homologe end joining in Säugetierzellen.

Die Analyse der DNA-Doppelstrang Break (DSB) Reparatur in Säugerzellen

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

analysis-of-dna-double-strand-break-dsb-repair-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

31.5K Aufrufe.  University of Rochester. Dieser Artikel beschreibt, GFP-basierte Fluoreszenz- In vivo Assays, die separat homologe Rekombination zu quantifizieren und homologe end joining in Säugetierzellen.

Serie: Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

DNA Transfektion von Säuger Skelettmuskulatur mit In Vivo Elektroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Forschung

Biologie

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

Intranukleäre Mikroinjektion von DNA in Dissoziierte Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulse-Chase-Analyse von N-verknüpften Zuckerketten von Glykoproteinen in Säugerzellen

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Analyse von Schwann-Astrozyten Wechselwirkungen mit In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Die Messung der Hämsynthese Levels in Säugerzellen

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

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Die Analyse der DNA-Doppelstrang Break (DSB) Reparatur in Säugerzellen