Diese Arbeit wurde von der Japan Society zur Förderung der Wissenschaften [Grant-Nummern 16 K 15860, T.M und 15 K 15777 N.H] unterstützt.

1. besser gekleideteres Design <ol><li>Primer für 2-stufige Fusion PCR und Überprüfung der gen Störung vorzubereiten. 
	Hinweis: Die Tabelle 1 zeigt der Primer-Sequenzen, die in diesem Protokoll verwendeten. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der 2-stufigen Fusion PCR Methode zur Erzeugung von S. Mutans Δ GtfC.
	<ol><li>Design Primer für den Ersatz der Zielregion im Genom mit Spectinomycin-Resistenz-Gen (Spc R) 7. Dieses Protokoll ersetzt die gesamte kodierende Region des Gens GtfC mit Spc R.</li>
		<li>Gehören Komplementär zu den oberen und unteren Enden der Spc R 15 Stützpunkte an der 5 &#39; Regionen des Up-Reverse und Down-Forward Primer, beziehungsweise. Einfügen, ergänzen das untere Ende der vorgelagerten flankierenden Regionen GtfC und das obere Ende der nachgeschalteten flankierenden Regionen GtfC 15 Stützpunkte an der 5 &#39; Regionen des Spc R-vorwärts und Spc r -Primer, bzw. rückgängig zu machen ( Abbildung 1A). 
		Hinweis: Sequenzen von Up-Reverse, Down-Forward, Spc R - vorwärts und Spc R - reverse Primer werden automatisch in Abhängigkeit vom Ort der Gründung des Konstrukts Störung ermittelt.</li>
		<li>Design die bis nach vorne und nach unten-Reverse Primer umfassen &#62; 1-kb upstream und downstream flankierenden Regionen des Gens GtfC bzw.. Legen Sie die Schmelztemperatur (T m) bis nach vorne und nach unten-Reverse Primer im Einklang mit der Schmelztemperatur des Up-Reverse und Down-Forward Primer, bzw. ( Abbildung 1A). 
		Hinweis: Finden Sie die folgende Formel zur Bestimmung von T m: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, wo * N entspricht der Anzahl der Grundierung Nukleotide mit der angegebenen Identität (A, T, C oder G).</li>
		<li>Design verschachtelte Primer (N_up-vorwärts und N_up-Reverse) für die 2 Nd PCR ( Abbildung 1 b). 
		Hinweis: Obwohl die äußerste Primerpaar (bis nach vorne und nach unten-Reverse) als Primer für die 2 Nd PCR verwendet werden können, wurden verschachtelte Primer (N_up-vorwärts und N_up-Reverse) in diesem Protokoll entworfen. Verschachtelte Primer sind häufig erforderlich für die 2 Nd PCR, wie beschrieben in den Vertreter Ergebnisse.</li>
		<li>Design Primer spezifisch für Spc R. Die Primer dienen zur Kolonie PCR zum Bildschirm für GtfC Störung.</li>
		<li>Design-Primer für die Überprüfung der GtfC Störung. 
		Hinweis: Die PCR-Produkte verstärkt mit diesen Primer überspannen die Grenze zwischen GtfC oder Spc R und stromaufwärts oder stromabwärts flankierenden Regionen GtfC. Die Primer-Sets &#39; GtfC bis nach vorne und GtfC Up-Reverse &#39; und &#39; GtfC Down-Forward und GtfC Down-Reverse &#39; sind spezifisch für GtfC und &#39; GtfC bis nach vorne und Spc R 2 -umgekehrte &#39; und &#39; Spc R 2-vorwärts und GtfC Down-Reverse &#39; sind spezifisch für Spc R.</li>
	</ol></li></ol> 2. Genomische DNA-Extraktion von S. Mutans <ol><li>Streak Lager S. Tetris s UA159 auf eine Agarplatte Gehirn Herz Infusion (BHI). Die Platte über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.</li>
	<li>Eine einzige Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher abholen und in 5 mL BHI-Bouillon zu impfen. Kultur der S. Tetris über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.</li>
	<li>Zentrifuge die bakterielle Zellkultur für 15 min auf 2.000 × g. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Zentrifuge für 15 min auf 2.000 × g. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 200 µL PBS.</li>
	<li>Genomischen DNA aus der Suspension mit einem Wulst-Prügel-Base genomische DNA Extraktion Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren.
	<ol><li>Übertragung der Aussetzung zu einer Probe 2,0 mL Röhrchen mit Glasperlen (im Kit enthalten). Die Zellsuspension 750 µL Lyse-Lösung (im Kit enthalten) hinzufügen.</li>
		<li>Kappe fest und setzen die Rohre symmetrisch in den Schlauchhalter der Wulst-schlagende Störung Vorrichtung. Prozess mit der maximalen Geschwindigkeit für 5 Minuten. Zentrifuge die Wulst geschlagen Proben 1 min auf 10.000 × g. übertragen den Überstand zum Spin Filter (im Kit enthalten) in einem 2,0 mL Sammelröhrchen und Zentrifuge für 1 min bei 7.000 × g .</li>
		<li>Fügen Sie 1.200 µL DNA-Bindung Puffer (im Kit enthalten), das Filtrat. Transfer 800 µL der Mischung auf die Spin-Spalte (im Kit enthalten) zu einer 2,0 mL Sammelröhrchen und Zentrifuge für 1 min bei 10.000 × g.</li>
		<li>Verwerfen die Durchströmung der Spin Spalte Waschen die Spalte Matrix und Zentrifugieren für 1 min bei 10.000 × g. verwerfen der durchströmten sowie 500 µL Waschpuffer (im Kit enthalten) auf den Spin 200 µL Vorwäsche Puffer (im Kit enthalten) hinzufügen. Spalte, waschen Sie die Spalte Matrix und Zentrifugieren für 1 min bei 10.000 × g.</li>
		<li>Setzen Sie die Spin-Säule zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Hinzufügen der Spalte Matrix 100 µL der Elution Buffer (im Kit enthalten).</li>
		<li>Zentrifuge für 30 s bei 10.000 × g, die genomische DNA eluieren. Schätzen Sie den DNA-Konzentration und Reinheit durch Messung der Absorption bei 260 nm und 280 Nmusing einem Spektrophotometer und bestätigen, dass die A 260/a 280 Verhältnis größer als 1,8 ist.</li>
	</ol></li></ol> 3. PCR-Amplifikation <ol><li>Perform 1 St PCR mit S. Tetris s WT Genom und das synthetische Spc R gen als PCR-Vorlagen (siehe Tabelle 1). Verstärken der vorgelagerten flankierenden Region des Gens GtfC, der nachgeschalteten flankierenden Region GtfC gen und das Spc-R-gen mit den drei Sätzen von Primer beschrieben ( Abbildung 1A), als pro Tabelle 2 und Tabelle 3. 
	Hinweis: PCR-Primer, Reagenzien und Verstärkung Zyklen sind zusammengefasst in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3, bzw..</li>
	<li>Jeder PCR-Produkt auf einem 1 % Agarose-Gel Fraktionieren und Verbrauchsteuern die entsprechenden Bänder mit einem Gel Band Cutter.</li>
	<li>Reinigen jedes amplifizierten DNA-Produkt aus die Gele mit einem Spin Spalte und Silica Gel Membran-basierte Extraktion Kit.
	<ol><li>Übertragung Gel Scheiben zu einer sauberen Microcentrifuge Rohr und mischen mit 500 µL Puffer (im Kit enthalten) zu binden. Die Mischung bei 55 ° C für 15 min inkubieren, bis die Gel Scheiben vollständig gelöst sind.</li>
		<li>Setzen Sie die Spin-Säule (im Kit enthalten) in ein Sammelrohr (im Kit enthalten), laden Sie die Probe auf die Spin-Säule und Zentrifugieren für 30 s bei 11.000 × g. Verwerfen der durchströmten, fügen Sie die 600 µL Waschpuffer (im Kit enthalten) der Spin Spalte Waschen die Kieselsäure-Membran und Zentrifugieren für 30 s bei 11.000 × g.</li>
		<li>Verwerfen die Durchströmung und Zentrifuge für 2 min bei 11.000 × g Kieselsäure Membran trocknen.</li>
		<li>Legen die Spin-Spalte zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, 50 µL Elution Buffer (im Kit enthalten) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 2 min.</li>
		<li>Zentrifuge für 2 min bei 11.000 × g, die amplifizierte DNA eluieren. Schätzen Sie den DNA-Konzentration und Reinheit durch Messung der Absorption bei 260 nm und 280 Nmusing einem Spektrophotometer und bestätigen, dass die A 260/a 280 Verhältnis größer als 1,8 ist.</li>
	</ol></li> <li>Perform 2 Nd PCR der 2-stufigen Fusion PCR mit den drei etwa äquimolaren Fragmente als PCR-Vorlagen, gem. Tabelle 2 < RichtlinienintervallRong > und Tabelle 3. 
	Hinweis: Diese Fragmente wurden verstärkt und gespleißt mit verschachtelten Primer &#39; N_up vorwärts- und N_down-Reverse &#39; oder die äußerste Primer &#39; bis nach vorne und nach unten-Reverse &#39; ( Abbildung 1 b). PCR-Primer, Reagenzien und Verstärkung Zyklen sind in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3, bzw. zusammengefasst.</li>
	<li>Laden ein Zehntel der PCR Reaktionsmischung (5 µL) auf einem 0,8 % Agarose-Gel und vergleichen Sie die verstärkte Bandgröße mit der erwarteten Bandgröße zu bestätigen, die Generierung von entsprechenden Amplifikate ( Abbildung 1).</li>
	<li>Konzentrieren, das verbleibende Endprodukt PCR durch Ethanol Fällung ohne Reinigung.
	<ol><li>Hinzufügen 55 µL ultrareines Wasser zu den restlichen PCR Mischung die gesamte Lautstärke zu 100 µL.Add ein Zehntel-Volumen von 3 M Natriumacetat (10 µL), pH 5,2, gefolgt von 2,5 Bände von 100 % Ethanol (250 µL). Mischen und Einfrieren für 30 min bei-80 ° c</li>
		<li>Zentrifuge für 20 min bei 15.000 × g bei 4 ° C, überprüfen Sie, ob die Kugel auf der Unterseite des Schlauches und den Überstand verwerfen. Das Pellet mit 1 mL 70 % Ethanol, Zentrifuge für 5 min bei 15.000 × g bei 4 ° C zu waschen und entsorgen des Überstands. Das Pellet für etwa 30 min an der Luft trocknen und mit 10 µL ultrareines Wasser auflösen.</li>
	</ol></li></ol> 4. Kompetente Zellen Vorbereitung und Zelle Transformation <ol><li>Streak Lager S. Tetris s UA159 auf eine Agarplatte BHI. Die Platte über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.</li>
	<li>Eine einzige Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher abholen und in 5 mL BHI-Bouillon zu impfen. Kultur der S. Tetris über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.</li>
	<li>Kultur der S. Tetris 2 mL auf 50 mL BHI-Bouillon übertragen und inkubieren Sie für 6-8 h bei 37 ° C zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) von 0,2-0,4 unter anaeroben Bedingungen.</li>
	<li>Die Zellen für 15 min bei 2.000 × g bei 4 ° C zentrifugiert, überstand verwerfen und waschen die Zellen zweimal mit 40 mL eiskaltes Wasser, gefolgt von 40 mL 10 % Glycerin. 
	Hinweis: Reststoffe Einfluss auf nachfolgende Elektroporation.</li>
	<li>Aspirieren den Überstand vorsichtig mit einer Pasteurpipette, wie die Einhaltung des Pellet-Zelle in 10 % Glycerin reduziert wird. Aufschwemmen der Zellen in 1 mL frisch 10 % Glycerin, 50 µL der Suspension in jeder 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu verzichten und bei-80 ° C bis kurz vor der Verwendung zu speichern.</li>
	<li>Mix der 50 µL Aliquote des eiskalten kompetente Zellen mit 5 µL der Störung Konstrukt oben in Abschnitt 3 beschrieben. Fügen Sie die Mischung zur Elektroporation Küvetten (mit einem 0,2 cm Abstand zwischen den Elektroden). Den Staphylococcus Aureus-Modus beschäftigen (1,8 kV, 600 Ω, 10 µF 1 Impuls) der Elektroporation Vorrichtung, Electroporate.</li>
	<li>Unterbrechen die Zellen in 500 µL der BHI-Bouillon unmittelbar nach Electroporation und Spectinomycin-haltigen BHI-Agarplatten 50 µL der Suspension hinzu. 
	Hinweis: Zusätzliche Inkubation Zeit nach Elektroporation nicht erforderlich ist. Jedoch kann die Inkubation für 1-2 h nach Electroporation Transformationseffizienz verbessern.</li>
	<li>2-6 Tage bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen die Platte inkubieren. 
	Hinweis: S. Mutans Δ GtfB ist aufgebaut wie oben beschrieben. Die gesamte kodierende Region des Gens GtfB wird ersetzt mit dem Erythromycin Widerstand gen 8 in S. Mutans Δ GtfB. Jeder Stamm S. Mutans in BHI Brühe bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen kultiviert wird.</li>
</ol> 5. Überprüfung der Gene Störung und Lagerung <ol><li>Wählen Sie zufällige Kolonien und in die PCR Mischung Kolonie PCR gemäß Tabelle 2 und Tabelle 3 durchführen zu impfen. PCR-Primer, Reagenzien und Verstärkung Zyklen sind in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3, bzw. zusammengefasst.</li>
	<li>Laden die PCR Reaktionsmischung auf einem 1 % Agarosegel, die Spc R zu bestätigen-spezifischen DNA-Band.</li>
	<li>Wählen Sie die positiven Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher und Subkultur Zellen in 10 mL Spectinomycin-haltigen BHI Brühe für 2 Tage bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen.</li>
	<li>Überprüfen die Generation von S. Mutans Δ GtfC.
	<ol><li>Teilen die Zellsuspension gleichermaßen. Genomischen DNA aus den Zellen, die oben beschriebenen zu extrahieren (Schritte 2,3., 2.5.5.). Führen Sie PCR mit genomischer DNA als Vorlage für die PCR, mit Primer für die Überprüfung der GtfC Störungen (Tabelle 1) gemäß Tabelle 2 und Tabelle 3. 
		Hinweis: Die PCR-Primer, Reagenzien und Verstärkung Zyklen sind zusammengefasst in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3, bzw..</li>
		<li>Laden die PCR-Mischung auf einem 2 % Agarose-Gel und vergleichen Sie die verstärkte Bandgröße mit der erwarteten Bandgröße zu bestätigen, die Generierung von entsprechenden Amplifikate .</li>
		<li>Zentrifugieren verbleibende Zellsuspension für 15 min auf 2.000 × g bei 4 ° c Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL PBS.</li>
		<li>Zentrifuge für 15 min auf 2.000 × g bei 4 ° C. Aufschwemmen die Zelle pellet in 1,5 mL BHI-Bouillon mit 25 % Glycerin und speichern in-80 ° ADR-20 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 6. Phänotypische Analyse <ol><li>Streifen jedes S. Tetris s Belastung auf eine Agarplatte BHI. Die Platte über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.</li>
	<li>Eine einzige Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher abholen und in 2 mL BHI-Bouillon mit oder ohne entsprechenden Antibiotikum zu impfen. Inkubation über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen.</li>
	<li>20 µL der Nacht Kultur Suspension in 2 mL BHI-Bouillon mit 1 % oder 5 % Saccharose ohne Antibiotika in ein Reagenzglas zu impfen; mit dem Reagenzglas in eine Schräglage über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen Kulturzellen.</li>
	<li>Vortex das Glas Reagenzgläser für 10 s und dekantieren Kultur Suspensionen. Die Reagenzgläser dreimal mit destilliertem Wasser zu waschen. Fügen Sie 1 mL von 0,25 % Coomassie Brilliant blau (CBB) um die Biofilme Fleck auf der Rohrwand und inkubieren dann 1 min.</li>
	<li>Der Färbelösung zu dekantieren, die Reagenzgläser dreimal mit destilliertem Wasser zu waschen und trocknen die Reagenzgläser.</li>
	<li>Farbdichte und Erweiterung des CBB gebeizt-Biofilms visuell zu bestimmen, die Bildung von Biofilm Fähigkeit in eine phänotypische Analyse bewerten.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Protokoll sind die Primer für die 1St PCR auszulegen, um ca. 1 kb upstream und downstream flankierenden Regionen der Zielregion im Genom zu verstärken. Solche lange flankierenden Sequenzen sind notwendig, um die Effizienz der homologen Rekombination.
Die Sequenzen der Primer (Up-Reverse, Down-Forward, SpcR-vorwärts und SpcR-rückwärts) in diesem Protokoll wurden automatisch ermittelt basierend auf dem Gelände der Einbeziehung de...

Gen Funktionsanalyse umfasst in der Regel einen phänotypische Vergleich zwischen einem Wildtyp Stamm und einem Stamm, in dem ein bestimmtes Gen des Interesses gestört wurde. Diese gen-Störung-Technik ist für die Funktion von Genanalysen in einer Vielzahl von Taxa, von Bakterien bis zu den Säugetieren verwendet worden. Ein Gen-Störung-Konstrukt ist notwendig für die Generation des Stammes gen gestört; Dieses Konstrukt der Desoxyribonukleinsäure (DNA) besteht aus der Antibiotikaresistenz-Marker-gen mit den vor- und nachgelagerten flankierenden Regionen des Zielgens verschmolzen und ist integriert in das Genom durch homologe Rekombination. Die gen-gestört Belastung kann mithilfe von Selektivmedien mit dem Antibiotikum isoliert sein. Die konventionelle Methode verwendet für den Bau des Stammes gen gestört erfordert komplexe Arbeitsschritte, wie die Verstärkung des Zielgens durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Unterbindung des Gens in eine geeignete Plasmid, Verdauung mit Einschränkung Enzyme und Religation Antibiotikaresistenz-Marker-gen eingefügt. Dieser Prozess ist zeitaufwändig, die mehrere Tage bis zu mehreren Wochen, je nach Erfolg der einzelnen Schritte. Darüber hinaus ist das Design der Störung Konstrukte der Beschränkungsenzymsites des Zielgens abhängig. Um diese Probleme zu beheben, wurden DNA-PCR-basierter Spleißen Methoden1,2 für die Gestaltung von gen gestört Mutanten von Dictyostelium Discoideum3 und Synechocystis SP. PCC68034 gemeldet. In der vorliegenden Studie wurde eine Methode entwickelt, um ein Gen gestört Streptokokken Stamm in eine relativ schnelle, einfache und kostengünstige Art und Weise, unter Verwendung einer modifizierten PCR-basierten Methode (2-stufige Fusion PCR bezeichnet) für den Bau der Störung zu erzeugen Konstrukt und Electroporation für gentechnische Transformation.
Die 2-stufige Fusion benötigten PCR genomischer DNA, die Antibiotikaresistenz-Marker-gen als Kopiervorlage PCR und vier Paare von angemessen entworfen Oligonukleotid-Primer. Im ersten Schritt (1St PCR), ein 1-kb upstream flankierenden Region des Zielgens, ein 1-kb downstream flankierenden Region des Ziels werden gen und Antibiotikaresistenz-Marker-gen mittels PCR amplifiziert. Die 5' Regionen der rückwärts-Primer und die forward Primer für Verstärkung von den vorgelagerten und nachgelagerten flankierenden Regionen, bzw. gehören 15 Basen komplementär zu den Enden des Markergens. Die 5' Regionen von forward und reverse Primer für Marker-gen-Amplifikation gehören ebenso 15 Basen komplementär zu der unteren Ende der vorgelagerten flankierenden Region des Zielgens und das obere Ende der nachgeschalteten flankierenden Region des Zielgens, bzw.. Daher enthalten die drei amplifizierten Fragmente überlappende 30 Basenpaare Regionen auf dem Fusion-Gelände. Im zweiten Schritt (2Nd PCR) ist die PCR mit verschachtelten PCR Primer verwenden die drei Fragmente, die durch die 1St PCR als Vorlagen verstärkt durchgeführt. Die komplementäre Regionen der Vorlagen sind zusätzlich über 2Nd PCR miteinander verbunden. Zu guter Letzt wird das Konstrukt für homologe Rekombination der Wildtyp Stamm durch Elektroporation vorgestellt. Erfolgreiche gen Störung kann durch PCR mit spezifischen Primern verifiziert werden. Obwohl die Störung Konstrukt mit High-Fidelity-DNA-Polymerase verstärkt ist, sind zusätzliche enzymatische Reaktionen, wie DNA-Ligatur oder DNA-Verdauung, nicht notwendig, um das Konstrukt zu erzeugen. Darüber hinaus kann eine gelöschte oder erhaltene Region über das Genom nach besser gekleideteres Design flexibel gewählt werden.
In der vorliegenden Arbeit erfolgte Löschung der gesamten kodierenden Region des Gens GtfC , die Glucosyltransferase in Streptococcus Mutanskodiert, um die schnelle, einfache gen Störung Methode in einer Streptokokken-Spezies zu demonstrieren. Darüber hinaus eine GtfB-gestörten Belastung wurde auf die gleiche Weise erzeugt. Die Glucosyltransferases von GtfC und GtfB kodiert tragen zur kariogenen dentale Biofilm Entwicklung5,6. Die Bildung von Biofilm Fähigkeiten der Wildtyp-Stamm (S. Mutans WT), GtfC-Dehnung (S. Mutans ΔGtfC) und GtfBgestört-gestörten Belastung (S. Mutans ΔGtfB) wurden ausgewertet für vergleichende phänotypische Analysen. Dieses Protokoll erweitert die Anwendung eines zweistufigen Verfahrens zur gen Störung einer zusätzlichen Arten und für Studien der Genfunktion in einem breiteren Spektrum von Taxa geändert werden kann.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Streptococus mutans&lt;/em&gt;</td><td>Stock strain in the lab.</td><td></td><td>Wild-type strain (Strain UA159)</td></tr><tr><td>Genomic DNA extraction kit</td><td>Zymo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>Bead-beating disruption apparatus</td><td>Taitec</td><td>GM-01</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic genes</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Custom-ordered</td><td>Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene</td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>Astec</td><td>PC-708</td><td></td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Custom-ordered</td><td>35 bases in length</td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Takara</td><td>R045A</td><td>High-fidelity DNA polymerase</td></tr><tr><td>Gel extraction kit</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>DNA extraction from agarose gel</td></tr><tr><td>Gel band cutter</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>DU 800</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Bio-rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation cuvette</td><td>Bio-rad</td><td>1652086</td><td>0.2-cm gap</td></tr><tr><td>Anaeropack</td><td>Mitsubishi Gas Chemical</td><td>A-03</td><td>Anaerobic culture system</td></tr><tr><td>Brain heart infusion broth</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>Bacterial culture media</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Erythromycin</td><td>Wako</td><td>057-07151</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>For biofilm development</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>For biofilm staining</td></tr></tbody></table>

generation of a gene-disrupted streptococcus mutans strain without gene cloning

Typische Methoden für die Aufklärung der Funktion eines bestimmten Gens beinhalten vergleichende phänotypische Analysen der Wildtyp Stamm und einem Stamm, in dem das gen des Interesses gestört wurde. Ein Gen-Störung DNA-Konstrukt mit einer geeigneten Antibiotika-Resistenz-Markergen eignet sich für die Erzeugung von gen gestört Stämme in Bakterien. Jedoch mit herkömmlichen Bauweisen, die Gene Klonen Schritte erfordern, komplexe und zeitraubende Protokolle verbunden. Hier ist eine relativ einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur gezielten gen Störung in Streptococcus Mutans beschrieben. Die Methode nutzt eine 2-stufige Fusion Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Störung Konstrukt und Electroporation für gentechnische Transformation zu generieren. Diese Methode erfordert keine enzymatische Reaktion als PCR, und bietet zudem mehr Flexibilität hinsichtlich der Gestaltung des Konstrukts Störung. Beschäftigung von Electroporation erleichtert die Vorbereitung der kompetenten Zellen und verbessert die Transformationseffizienz. Das vorliegende Verfahren kann für die Generierung von gen gestört Stämme verschiedener Arten angepasst werden.

Abbildung 2 zeigt, dass die Größe der einzelnen Produkte von der 1St PCR, war wie auf dem 1 % Agarosegel beobachtet, in guter Übereinstimmung mit der prognostizierten Größe von ca. 1 kb. Abbildung 3 zeigt die Gel-Elektrophorese Analyse der Produkte der 2Nd PCR. Abbildung 4 zeigt S. Mutans Kolonien mit der Störung-Konstrukt und ein Gel-Elektrophorese Analyse der Ko...

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Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Wir beschreiben eine einfache, schnelle und relativ kostengünstige Methode zur Erzeugung von gen gestört Streptococcus Mutans Stämme; Diese Technik kann für die Generierung von gen gestört Stämme verschiedener Arten angepasst werden.

Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

generation-gene-disrupted-streptococcus-mutans-strain-without-gene

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

7.6K Aufrufe.  Tsurumi University School of Dental Medicine. Wir beschreiben eine einfache, schnelle und relativ kostengünstige Methode zur Erzeugung von gen gestört Streptococcus Mutans Stämme; Diese Technik kann für die Generierung von gen gestört Stämme verschiedener Arten angepasst werden.

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From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different conditions often leads to the production of new compounds. Therefore, production cultures of the strains are extracted with ethyl acetate and the crude extracts are analyzed by HPLC. Furthermore, the extracts are tested for their bioactivity by different assays. For structure elucidation the compound of interest is purified by a combination of different chromatography methods.
Genome sequencing coupled with genome mining allows the identification of a natural product biosynthetic gene cluster using different computer programs. To confirm that the correct gene cluster has been identified, gene inactivation experiments have to be performed. The resulting mutants are analyzed for the production of the particular natural product. Once the correct gene cluster has been inactivated, the strain should fail to produce the compound.
The workflow is shown for the antibacterial compound polyketomycin produced by Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028. Around ten years ago, when genome sequencing was still very expensive, the cloning and identification of a gene cluster was a very time-consuming process. Fast genome sequencing combined with genome mining accelerates the trial of cluster identification and opens up new ways to explore biosynthesis and to generate novel natural products by genetic methods. The protocol described in this paper can be assigned to any other compound derived from a Streptomyces strain or another microorganism.

Here we present a detailed protocol of (A) the identification of a natural product with antibiotic activity, (B) the purification of the compound, (C) the first model of its biosynthesis, (D) genome sequencing/-mining and the (E) verification of the biosynthetic gene cluster.

Von einem natürlichen Produkt in seine Biosynthesegenclusters: Eine Demonstration Mit Polyketomycin aus<em&gt; Streptomyces diastatochromogenes</em&gt; Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

Forschung

Genetik

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Biologie

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a particular genetic background or environmental condition1,2. There are examples where many genes need to be deleted to unmask hidden gene functions3,4. Despite the potential for important discoveries, genetic interactions involving three or more genes are largely unexplored. Exhaustive searches of multi-mutant interactions would be impractical due to the sheer number of possible combinations of deletions. However, studies of selected sets of genes, such as sets of paralogs with a greater a priori chance of sharing a common function, would be informative.
In the yeast Saccharomyces cerevisiae, gene knockout is accomplished by replacing a gene with a selectable marker via homologous recombination. Because the number of markers is limited, methods have been developed for removing and reusing the same marker5,6,7,8,9,10. However, sequentially engineering multiple mutations using these methods is time-consuming because the time required scales linearly with the number of deletions to be generated.
Here we describe the Green Monster method for routinely engineering multiple deletions in yeast11. In this method, a green fluorescent protein (GFP) reporter integrated into deletions is used to quantitatively label strains according to the number of deletions contained in each strain (Figure 1). Repeated rounds of assortment of GFP-marked deletions via yeast mating and meiosis coupled with flow-cytometric enrichment of strains carrying more of these deletions lead to the accumulation of deletions in strains (Figure 2). Performing multiple processes in parallel, with each process incorporating one or more deletions per round, reduces the time required for strain construction.
The first step is to prepare haploid single-mutants termed 'ProMonsters,' each of which carries a GFP reporter in a deleted locus and one of the 'toolkit' loci&#x2014;either Green Monster GMToolkit-a or GMToolkit-&alpha; at the can1&Delta; locus (Figure 3). Using strains from the yeast deletion collection12, GFP-marked deletions can be conveniently generated by replacing the common KanMX4 cassette existing in these strains with a universal GFP-URA3 fragment. Each GMToolkit contains: either the a- or &alpha;-mating-type-specific haploid selection marker1 and exactly one of the two markers that, when both GMToolkits are present, collectively allow for selection of diploids.
The second step is to carry out the sexual cycling through which deletion loci can be combined within a single cell by the random assortment and/or meiotic recombination that accompanies each cycle of mating and sporulation.

The Green Monster method enables the rapid assembly of multiple deletions marked with a reporter gene encoding green fluorescent protein. This method is based on driving yeast strains through repeated cycles of sexual assortment of deletions and fluorescence-based enrichment of cells carrying more deletions.

The Green Monster Verfahren zur Erzeugung von Hefestämmen Buchwert Multiple Deletionen

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

Reinigung eines hochmolekularen Proteins in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Immunologie und Infektion

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

Generierung von In-Frame-Gen-Deletion Mutanten in Pseudomonas aeruginosa und Tests auf VirulenzDämpfung in einem einfachen Mausmodell der Infektion

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, studies in this serotype have been hindered by the lack of genetic tools to modify it. In this study, we describe a method to genetically modify a serotype 1 clinical isolate (strain 519/43). Interestingly, this was achieved by exploiting the Pneumococcus&#8217; ability to naturally acquire DNA. However, unlike most pneumococci, the use of linear DNA was not successful; to mutate this important strain, a suicide plasmid had to be used. This methodology has provided the means for a deeper understanding of this elusive serotype, both in terms of its biology and pathogenicity. To validate the method, the major known pneumococcal toxin, pneumolysin, was mutated because it has a well-known and easy to follow phenotype. We showed that the mutant, as expected, lost its ability to lyse red blood cells. By being able to mutate an important gene in the serotype of interest, we were able to observe different phenotypes for loss of function mutants upon intraperitoneal and intranasal infections from the ones observed for other serotypes. In summary, this study proves that strain 519/43 (serotype 1) can be genetically modified.

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Here, we describe a S. pneumoniae serotype 1 strain 519/43 that can be genetically modified by using its ability to naturally acquire DNA and a suicide-plasmid. As proof of principle, an isogenic mutant in the pneumolysin (ply) gene was made.

Konstruktion von Mutanten im Serotyp 1 Streptococcus pneumoniae Stamm 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

Erzeugung von Nullmutanten zur Aufklärung der Rolle bakterieller Glykosyltransferasen in der bakteriellen Motilität

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

Erzeugung<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. Ysu Auxotrophe Mit Transposon-Mutagenese

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of 'escape' of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.

Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

Erzeugung von Marked und Markerless Mutants in Modell Cyanobakterienarten

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

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Von einem natürlichen Produkt in seine Biosynthesegenclusters: Eine Demonstration Mit Polyketomycin aus

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in