Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Mikrobiologie zu beantworten, wie z. B. wie ein Genprodukt, das in E.Coli schwer auszudrücken ist, reinigt. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass keine enzymatische Reaktion, außer PCR, der Träger ist und gängige Anwendungen für die Proteinreinigung verwendet werden können. Obwohl diese Methode Einblick in die Proteinreinigung bei Streptokokken-Mutanen geben kann, kann sie auch auf andere Mikrobiota-Arten hingewiesen werden.
Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Mamiko Yamashita, einem Grad-Studenten aus unserem Labor. Nach Primer-Design und genomischer DNA-Extraktion von Streptococcus-Mutanen führen Sie die erste PCR mit den wilden Streptokokkenmutans und GFC-gestörten Streptokokken-Mutans-Genomals als PCR-Vorlagen durch. Verstärken Sie die Regionen, die den nachgelagerten Teil des gtfC-Gens beherbergen, und diejenigen, die das Spectinomycin-Resistenzgen beherbergen, mit dem vorbereiteten gtfC-Forward- und Reverse-Primer und spc r-forward und reverse primer.
Dann elektrophorese jedes PCR-Produkt auf 1%Agarose-Gel. Verwenden Sie einen Gelbandschneider, um die gewünschten DNA-Fragmente von ca. 1.000 Basenpaaren und 2.000 Basenpaaren aus dem Gel in Mikrozentrifugenröhren zu verbrauchen. Fügen Sie 500 Mikroliter Löslichkeitspuffer in jede Röhre und inkubieren Sie sie für 10 Minuten bei 56 Grad Celsius, um die Gelscheiben aufzulösen.
Reinigen Sie die Fragmente mit Derilica-Membran-basierten Gelextraktionsmethode. Führen Sie eine zweite PCR mit den Produkten der ersten PCR als PCR-Vorlagen mit den verschachtelten Vorwärts- und Verschachtelungs-Reverse-Primern aus. Wenn das zweite PCR-Produkt nicht durch Elektrophorese bestätigt werden kann, sollte ein weiteres verschachteltes Primerpaar entworfen werden.
elektrophorese fünf Mikroliter der PCR-Mischung auf dem Agarose-Gel. Bestätigen Sie die Erzeugung des entsprechenden Amplicons von ca. 3.000 Basenpaaren durch Ethidiumbromid-Gel-Färbungsbild und gehen Sie entsprechend dem Manuskript vor. Mischen Sie nun fünf Mikroliter des konzentrierten zweiten PCR-Produkts in das 50-Mikroliter-Aloquot eiskalter, kompetenter Streptokokken-Mutanzellen, die zuvor eingefroren wurden.
Fügen Sie das Gemisch in eine Elektroporationsküvette und legen Sie die Küvette in die Küvettenkammer des Elektroporationsapparates. Geben Sie den Zellen einen einzigen elektrischen Impuls von 1,8 Kilovolt, 600 Ohm und 10 Mikrofaraden für 2,5 Millisekunden. Fügen Sie 500 Mikroliter Hirn-Herz-Infusionsbrühe in die Küvette.
10 bis 100 Mikroliter der Suspension sofort auf Hirn-Herz-Infusionsschneckenplatten, die Spectinomycin enthalten, verteilen. Bebrüte die Teller zwei bis sechs Tage bei 37 Grad Celsius, bis die Kolonien ausreichend gewachsen sind, um abgeholt zu werden. Nach der Generierung von Streptococcus Mutans Polyhistidin Codierung Sequenz enthalten Stamm und über Nacht Impfung ohne Spektinomycin nach dem Manuskript, Zentrifugieren Sie die bakterielle Kultur Suspension für 20 Minuten bei 10 000 mal g bei vier Grad Celsius.
Übertragen Sie den Kulturüberstand in einen Dreiliter-Glasbecher. Um die Proteine aus dem Kulturüberstand zu konzentrieren, legen Sie den Zweiliter-Überstand auf einen magnetischen Rührer und beginnen Sie kräftig zu rühren. 1, 122 Gramm Ammoniumsulfat hinzufügen und den Niederschlag bei vier Grad Celsius über einen Zeitraum von vier Stunden oder über Nacht mit kräftigem Rühren bilden lassen. nächster.
Zentrifugieren Sie die ammoniumsulfat-ausgefällte Lösung bei 15.000 mal g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Dekant den Überstand. Mit einem Spachtel den Niederschlag einsammeln und in ein 200-Milliliter-Glasbecher überführen.
Die Pellets in 35 Milliliter Bindungspuffer wieder aufhängen. Dann übertragen Sie jeweils ca. 25 Milliliter der Suspension in einen regenerierten Zellulosedialyseschlauch. Legen Sie die Dialyseschläuche in 2,5 Liter des Rührbindepuffers auf einen Rührer bei vier Grad Celsius, um die Suspension zu dialysieren.
Ersetzen Sie die Dialyselösung nach zwei Stunden und setzen Sie die Dialyse über Nacht fort. Als nächstes die dialysierte Suspension von den Schläuchen auf Zentrifugenrohre übertragen und die Rohre in der Zentrifuge bei 20.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius platzieren. Mit Abschnittsfiltrationsanlagen den Überstand über einen 0,2-Mikrometer-Membranfilter zum Filtern gießen.
Übertragen Sie das Filtrat in einen 75-Milliliter-Kolben. Um die mit Polyhistidin markierte gtfSI aus der filtrierten Suspension zu fraktionieren, bereiten Sie zunächst eine immobilisierte Metallaffinitätschromatographie vor. Nachdem Sie das Harz gemäß dem Manuskript ausgeglichen haben, schließen Sie den Hoffman-Pinch-Hahn.
Fügen Sie fünf Milliliter der gefilterten Suspension in die Säule ein, um eine Gülle zu bilden. Dann die gesamte Gülle auf die verbleibende gefilterte Suspension geben und die Mischung 30 Minuten bei vier Grad Celsius sanft wirbeln. Laden Sie die Mischung wieder in die Spalte.
Öffnen Sie den Hoffman Pinch Hahn, um die Suspension durch den Schwerkraftfluss zu entfernen. Waschen Sie das IMAC-Harz mit 20 Milliliter Bindungspuffer und dann 20 Milliliter Elutionspuffer, um den rekombinanten gtfSI zu erhalten. Danach das Eluat in ein zentrifugales Ultrafiltrationsrohr laden und die Lösung bei 2.000 mal g für ein bis fünf Minuten zentrifugieren, um die Lösung zu konzentrieren.
Leeren Sie den Filtratbehälter und fügen Sie 15 Milliliter Speicherpuffer in die Röhre ein. Zentrifugieren Sie die Probe erneut und wiederholen Sie den Vorgang zwei weitere Male. Die rekombinante gtfSI-Lösung wird schließlich auf etwa einen Milliliter konzentriert.
Das Konzentrat in ein Mikrozentrifugenrohr geben und bei vier Grad Celsius lagern. Fahren Sie mit dem Rest-Funktionswiederherstellungsprotokoll fort. In diesem Protokoll zeigt die Agarose-Gel-Elektrophorese, dass die Größe jedes Amplicons aus der ersten PCR und der zweiten PCR mit der vorhergesagten Größe übereinstimmte.
Streptococcus mutans Kolonien wurden mit dem zweiten PCR-Produkt transformiert und auf den Hirn-Herz-Infusionsschneckenplatten mit Spektinomycin plattiert. Colony PCR Produkte laufen auf dem Agarose-Gel zeigt, dass jedes Amplicon von der vorhergesagten Größe war. Protein, das mit immobilisierter Metallaffinitätschromatographie gereinigt wurde, wurde von SDS-PAGE als einzelnes Band beobachtet.
Western Blot, der mit dem Antipolyhistidin-Antikörper durchgeführt wurde, bestätigte, dass das beobachtete Band das erwartete Polyhistidin-markierte Protein von 160 Kilodaltonen war. Die saccharoseabgeleitete Biofilmformfähigkeit wurde nur bei Streptokokken-Mutanen vom Wildtyp und Streptococcus-Mutans His-gtfC gesehen, die in Gegenwart von 1%Saccharose einen anhaftenden Biofilm an der Rohrwand bildeten. Dies wurde bei Streptococcus mutans delta gtfC nicht beobachtet.
Die Zugabe von 25 Mikrogramm des rekombinanten gtfSI stellte jedoch die anhaftende Biofilmbildungsfähigkeit in Streptococcus mutans delta gtfC wieder her. Da der Erfolg dieser Methode von der zweiten PCR-Verstärkung abhängt, muss das zweite PCR-Produkt durch Elektrophorese bestätigt werden. Bereits jetzt, Histidin-Typ Protein mit dieser Methode erhalten ist auch zu funktionellen Säuren, wie Protein-Protein-Wechselwirkungen.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik in Kombination mit Genstörungen den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Mikrobiologie, um die Genfunktion zu erforschen.
