Name: generation of a gene-disrupted streptococcus mutans strain without gene cloning
Uploaded: 2017-10-23T14:00:00.000+00:00
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この作業は、[許可番号 16 K 15860 へ曲がらなければなりません、15 K 15777 ニューハンプシャー] 学術振興会によって支えられました。

1 プライマー デザイン <ol><li>遺伝子破壊の検証と融合 2 ステップ PCR のプライマーを準備します。 。
	注: 表 1 は、このプロトコルで使われるプライマー シーケンスを示しています。S. mutans Δ gtfC を生成するために使用 2 段フュージョン PCR 法の模式図を 図 1 に示します。
	<ol><li>スペクチノマイシン耐性遺伝子 (spc r) 7 をゲノムのターゲット領域の交換用プライマーを設計します。このプロトコルは spc r gtfC 遺伝子のコーディング領域の全体を置き換えます</li>。
		<li>には 5 に 15 拠点 spc r の上部と下部の両端に相補的なが含まれて &#39; を逆の地域とそれぞれのプライマーをダウン-フォワード。同様に、5 に 15 拠点 gtfC の上流の並ぶ領域の下端および gtfC の下流の並ぶ領域の上部の端に補足を含める &#39; spc r の地域-前方および spc r-プライマーをそれぞれ反転 ( 図 1 a). 
		注: シーケンスを逆、ダウン-前方の spc r - 前方、および spc r - 逆プライマー、中断構築定款のサイトによって自動的に決まります</li>。
		<li>設計を構成するまで進むと上下逆プライマー &#62; 上流と下流に並ぶ gtfC 遺伝子の領域がそれぞれ 1 kb。最大フォワードの融解温度 (T m) を設定し、ダウン前後を逆プライマーの溶ける温度に従ってプライマーをそれぞれ上下逆 ( 図 1 a). 
		注: T m を決定する次の数式を参照して: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5、* N はプライマー ヌクレオチド (A、T、C、または G) 指定した id の数を表します</li>。
		<li>デザイン 2 nd PCR ( 図 1 b) の入り込まれたプライマー (N_up リバース N_up 前後). 
		注: 最も外側のプライマー (アップ前方と上下逆) は、2 nd PCR のプライマーとして使用することがあります、ただし、入り込まれたプライマー (N_up リバース N_up 前後) はこのプロトコルで設計されました。入り込まれたプライマーが 2 nd PCR、代表結果 に示すとおりの頻繁に要求します</li>。
		<li>Spc r 特定設計プライマー。GtfC 混乱の画面にコロニー PCR のプライマーを使用します</li>。
		<li>GtfC の検証のための設計プライマー中断します 。
		注: これらのプライマーを使用して増幅される PCR の製品は、gtfC または spc r 上流または下流の並ぶ gtfC の領域との境界を跨ぐ。プライマー セット &#39; gtfC 最大フォワードと gtfC を逆 &#39; と &#39; gtfC ダウン-前方および gtfC ダウン逆 &#39;、gtfC と &#39; gtfC 最大フォワードと spc r 2-逆 &#39; と &#39; spc r 2 前方および gtfC ダウン逆 &#39; spc r 固有です</li>。
	</ol></li></ol> 2。ゲノム DNA の抽出 , S. mutans <ol><li>連勝株式 s. 変異体 の UA159 脳心臓注入 (BHI) 寒天プレート上に。嫌気条件下 37 ° C で一晩プレートをインキュベートします</li>。
	<li>滅菌つまようじを使用して単一コロニーをピックアップし、5 mL BHI ブイヨンに接種します。嫌気条件下 37 ° C で一晩 s. 変異体 の文化をインキュベートします</li>。
	<li>2,000 × g. で 15 分間遠心する細菌の細胞培養は、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 5 mL の細胞ペレットを再懸濁します</li>。
	<li>2,000 × g に 15 分間の遠心分離は、200 μ L の PBS で細胞ペレットを再懸濁します</li>。
	<li>製造元によって提供される指示に従ってビード暴行ベース ゲノム DNA 抽出キットを使用して懸濁液からゲノム DNA を抽出します。
	<ol><li>転送懸濁液 2.0 mL のサンプル チューブ ガラス ビーズ (キットに付属) を含みます。細胞懸濁液に溶解液 (キットに付属) の 750 μ L を追加します</li>。
		<li>は、しっかりとキャップし、ビーズの破壊装置のチューブ ホルダーでチューブを対称的に配置。5 分間最大速度で処理。スピン フィルター (キットに付属) 2.0 mL 管で 7,000 × g . で 1 分間遠心 10,000 × g に 1 分間遠心ビーズ殴られてサンプル転送清</li>
		<li>DNA 結合の追加 1,200 μ 濾液のバッファー (キットに付属)。2.0 mL 管および遠心 10,000 × g に 1 分間に 800 μ L の混合物 (キットに付属) スピン列を転送</li>
		<li>フローから破棄追加予備洗浄バッファー (キットに付属) を 200 μ l 添加スピン列を列行列を洗って、10,000 × g の流れを破棄に 1 分間遠心、スピンを 500 μ L の洗浄バッファー (キットに付属) を追加します。列に列行列を洗浄し、10,000 × g に 1 分間遠心</li>
		<li>スピン列を新しい 1.5 mL 遠心チューブに配置し、列のマトリックスに 100 μ L の溶出バッファー (キットに付属) を追加します</li>。
		<li>30 の遠心分離機 s 10,000 × g ゲノム DNA を溶出します。260 で吸光度を測定することによって DNA 濃度・純度を推定 nm と 280 nmusing 分光光度計 A 260/A 280 比が 1.8 より大きいことを確認します</li>。
	</ol></li></ol> 3。PCR 増幅 <ol><li>1 st PCR テンプレート (表 1 参照) として s. 変異体 の WT ゲノムおよび合成 spc r 遺伝子を使用して PCR を実行します。GtfC 遺伝子の上流の並ぶ領域、gtfC 遺伝子のプライマーとして 1 ( 図 1 a)、上記の 3 つのセットを使用して spc r 遺伝子下流並ぶ領域を増幅します。表 2 および 表 3. 
	注: PCR のプライマーおよび試薬、増幅サイクルが要約 表 1 表 2、および 表 3 にそれぞれします</li>。
	<li>1% アガロースゲルの各 PCR の製品を分別し、ゲルのバンド カッターを使用して対応するバンドをです</li>。
	<li>回転カラムとシリカ膜ベースのゲル抽出キットを使用してゲルから各増幅 DNA 製品を浄化します。
	<ol><li>転送きれいな遠心にゲルのスライスはチューブし、500 μ L (キットに付属) バッファーをバインドのミックスします。ゲルのスライスを完全に溶解するまでに 55 ° C 15 分で混合物をインキュベートします</li>。
		<li>(キットに付属) コレクション チューブ (キットに付属) スピン列に配置、スピンの列にサンプルをロードし、30 の遠心分離機 11,000 × g で s。流れを破棄、シリカ膜を洗浄し、30 の遠心分離機回転カラムを洗浄バッファー (キットに付属) の 600 μ L を追加 11,000 × g で s.</li>
		<li>フロー ・ スルーとシリカ膜を乾燥する 11,000 × g で 2 分間遠心を破棄します</li>。
		<li>スピン列を新しい 1.5 mL 遠心チューブに配置、50 μ l 添加溶出バッファー (キットに付属)、2 分間室温でインキュベートして</li>
		増幅された DNA を溶出する <li>11,000 で 2 分間遠心分離機 × g。260 で吸光度を測定することによって DNA 濃度・純度を推定 nm と 280 nmusing 分光光度計 A 260/A 280 比が 1.8 より大きいことを確認します</li>。
	</ol></li> <li>実行、2 nd 2 段階核融合 表 2 に従って、PCR のテンプレートとして 3 つの約モルの断片を用いた PCR の PCR </st栄 > および 表 3. 
	注: これらのフラグメント増幅された、ネストされたプライマーを使用して融着接続 &#39; N_up 進むと N_down リバース &#39; または最も外側のプライマー &#39; を前方と上下逆 &#39; ( 図 1 b)。PCR のプライマーおよび試薬、増幅サイクルはそれぞれ 表 1 表 2、および 表 3 に要約が</li>。
	<li>0.8% の agarose のゲルの PCR 反応混合物 (5 μ L) の 10 分の 1 をロードし、適切な増幅 ( 図 1) の生成を確認する期待されるバンドのサイズの増幅バンドのサイズを比較します</li>。
	<li>残り最終的な PCR の製品を精製することがなくエタノール沈殿物によって集中。
	<ol><li>追加 55 μ L の超純粋な水 100 µL.Add に全体の音量を調整する残りの PCR の混合物 3 M 酢酸ナトリウム (10 μ L)、pH 5.2、100% エタノール (250 μ L) の 2.5 倍量の順の 10 分の 1 のボリューム。混合し、-80 で 30 分間凍結 ° C</li>
		<li>4 ° C で 15,000 × g で 20 分間遠心管の底にペレットをチェック、上澄みを廃棄します。70% エタノール、4 ° C で 15,000 × g で 5 分間遠心の 1 mL にペレットを洗浄し、上澄みを廃棄します。約 30 分のペレットを風乾、10 μ L の超純水で溶解する</li>。
	</ol></li></ol> 4。有能なセルの準備および細胞形質転換 <ol><li>連勝株式 s. 変異体 の UA159 BHI 寒天培地プレート上に。嫌気条件下 37 ° C で一晩プレートをインキュベートします</li>。
	<li>滅菌つまようじを使用して単一コロニーをピックアップし、5 mL BHI ブイヨンに接種します。嫌気条件下 37 ° C で一晩 s. 変異体 の文化をインキュベートします</li>。
	<li>BHI スープ 50 mL に 2 mL の変異体米 の文化を転送し、600 の光学濃度 37 ° C で 6-8 時間インキュベート嫌気条件下で 0.2 0.4 nm (外径 600).</li>
	<li>4 ° C で 2,000 × g で 15 分の細胞を遠心分離機、上澄みを廃棄、40 mL の 10% グリセロールの 40 mL に続いて冷たい水で二回セルを洗浄しています 。
	注: 残留物質に影響を与える後続エレクトロポレーション</li>。
	<li>は、10% のグリセロールの細胞ペレットの付着を低減、パスツール ピペットと慎重に上清を吸引します。新鮮な 10% のグリセロールの 1 mL の細胞を再懸濁します、各 1.5 mL 遠心チューブに懸濁液の 50 μ L を分注、使用直前まで-80 ° C で保存します</li>。
	<li>は、冷たいの有能なセルのセクション 3 で説明した中断のコンストラクトの 5 μ L の 50 μ L 約数をミックスします。エレクトロポレーション キュベット (電極間の 0.2 cm 距離) の混合物に追加します。黄色ブドウ球菌 モードを採用 (1.8 kV、600 Ω、10 μ F、1 パルス) electroporate エレクトロポレーション装置の</li>。
	<li>エレクトロポレーションの直後に BHI ブイヨンの 500 μ L のセルを中断し、スペクチノマイシン含む BHI 寒天培地プレートに懸濁液の 50 μ L を追加します 。
	注: 余分な培養時間後電気穿孔法は必須ではありません。ただし、エレクトロポレーション後 1-2 時間インキュベーションは、変換効率が向上します</li>。
	<li>嫌気条件下 37 ° C で 2-6 日のプレートをインキュベートします 。
	注: 上記のよう に, S. mutans Δ gtfB が構築されます。GtfB 遺伝子のコーディング領域の全体は , S. mutans Δ のエリスロマイシン耐性遺伝子 8 に置き換えられます gtfB。各 , S. mutans 緊張は嫌気条件下 37 ° C で BHI ブイヨンで培養です</li>。
</ol> 5。遺伝子破壊と記憶域の検証 <ol><li>ランダムなコロニーをピックアップし、コロニー の表 2 および 表 3 に従って PCR を実行する pcr にそれらを接種します。PCR のプライマーおよび試薬、増幅サイクルはそれぞれ 表 1 表 2、および 表 3 に要約が</li>。
	<li>Spc r を確認する 1% の agarose のゲルの PCR 反応混合物をロード-特定の DNA バンド</li>。
	<li>嫌気条件下 37 ° C で 2 日間スープ滅菌つまようじとスペクチノマイシン含む BHI の 10 mL のサブカルチャーのセルを使用して肯定的なコロニーを拾う</li>。
	<li>, S. mutans Δ の生成を確認 gtfC。
	<ol><li>は、細胞懸濁液を均等に分割します。上記で説明した細胞からゲノム DNA を抽出 (ステップ 2.3。 2.5.5 に。)。表 2 および 表 3 に従って gtfC 中断 (表 1) の検証のためのプライマーを用いて PCR のテンプレートとしてゲノム DNA を PCR を実行します 。
		注: PCR のプライマー、試薬、および増幅サイクルのとおり 表 1 表 2、および 表 3 にそれぞれします</li>。
		<li>2% の agarose のゲルの pcr を読み込み、適切な増幅 。 の生成を確認する期待されるバンドのサイズの増幅バンド サイズを比較</li>
		<li>2,000 × g で 15 分の残りの細胞懸濁液を遠心分離機で 4 ° C は、5 mL の PBS で細胞ペレットを再懸濁します</li>。
		<li>4 で 2,000 × g で 15 分間遠心する C. セル 25% グリセロールを含んで BHI ブイヨン 1.5 mL にペレットし、-80 ° Cor-20 ° C で保存を再懸濁します °</li>
	</ol></li></ol> 6。表現型解析 BHI 寒天培地プレート上に <ol><li>連勝各 変異体米 のひずみ。嫌気条件下 37 ° C で一晩プレートをインキュベートします</li>。
	<li>滅菌つまようじを使用して単一コロニーをピックアップし、BHI ブイヨン適切な抗生物質の有無の 2 mL に接種します。嫌気条件下 37 ° C で一晩インキュベートします</li>。
	<li>ガラス試験管に抗生物質がない 1% や 5% のショ糖を含む BHI 培地 2 mL に一晩文化懸濁液 20 μ L を接種する; 試験管、嫌気条件下 37 ° C で一晩傾斜した位置の細胞の培養します</li>。
	<li>渦ガラス試験管 10 s 文化懸濁液をデカントし、。3 回蒸溜水で試験管を洗います。0.25% クマシーブリリアント管壁にバイオ フィルムを染色する (CBB) を青し、し、1 分間インキュベートの 1 mL を追加</li>
	<li>染色液をデカント、3 回、蒸留水を試験管を洗うし、試験管をドライします</li>。
	<li>色密度と、CBB 染色-バイオ フィルムの表現型解析におけるバイオ フィルム形成能の決定を視覚的に拡張機能を評価します</li>。
</ol>

<ol>
	<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Kuwayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+generation+of+a+gene+disruption+construct+without+the+use+of+DNA+ligase+and+plasmid+vectors.">PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors.</a> Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).</li><li>Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digalactosyldiacylglycerol+is+required+for+stabilization+of+the+oxygen-evolving+complex+in+photosystem+II.">Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II.</a> Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).</li><li>Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+Streptococcus+mutans+glucosyltransferase+gene+coding+for+insoluble+glucan+synthesis.">Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis.</a> Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutans+gtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cloning+vector+able+to+replicate+in+Escherichia+coli+and+Streptococcus+sanguis.">A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis.</a> Gene. 19 (3), 345-353 (1982).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li></ol>

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現在のプロトコルの上流と下流の並ぶゲノムのターゲット領域の領域に約 1 kb を増幅する 1st PCR のためのプライマーを設計されなければなりません。このような長い並ぶシーケンスは相同組換えの効率を改善する必要があります。
プライマーのシーケンス (逆アップ、ダウン-フォワード、 spcr-前方、およびspcr-逆) このプロトコルで?...

遺伝子機能解析は通常興味の特定の遺伝子が崩壊したひずみと野生型株の表現型の比較を行います。この遺伝子破壊法は、イチイ、哺乳類に細菌からの広い範囲で遺伝子機能解析のために利用されています。遺伝子破壊ひずみ; の生成に必要な遺伝子破壊コンストラクトとはこのデオキシリボ核酸 (DNA) の構築は上流と下流の並ぶターゲット遺伝子の領域を融合した抗生物質耐性マーカー遺伝子から成り、相同組換えによってゲノムに組み込まれています。遺伝子破壊ひずみは、抗生物質を含んでいる選択的なメディアを使用して分離することが。遺伝子破壊株の建設に使用される従来の方法ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)、適切なプラスミドの制限の消化に遺伝子の結紮によるターゲット遺伝子の増幅などの複雑な手順が必要酵素、および抗生物質耐性マーカー遺伝子を挿入する桿菌。このプロセスは時間がかかり、各ステップの成功に応じて、数週間に数日を取るです。さらに、混乱の構造のデザインはターゲット遺伝子の制限酵素サイトに依存です。これらの問題を解決するには DNA の PCR によるスプライシング方法1,2遺伝子破壊変異体キイロタマホコリカビ3と阻害の sp PCC68034のデザインが報告されています。本研究では混乱の建設のため (融合 2 ステップ PCR を指定) 変更された PCR ベース法を活用、比較的簡易、迅速かつ安価な方法で遺伝子破壊の連鎖球菌株を生成する方法を開発しました。構築および形質転換をエレクトロポレーション。
PCR ゲノム DNA、抗生物質耐性マーカー遺伝子 PCR のテンプレートとして、4 つのペアを適切に必要な 2 段階核融合には、オリゴヌクレオチドのプライマーが設計されています。最初のステップ (1st PCR)、ターゲット遺伝子、ターゲット 1 kb の並ぶ下流域の 1 kb の並ぶ上流域と抗生物質耐性マーカー遺伝子は PCR によって増幅されます。逆のプライマーの前方のプライマーは、増幅の上流と下流の 5' 領域には並ぶ領域、それぞれ、15 拠点マーカー遺伝子の両端に相補的なが含まれます。マーカー遺伝子増幅の前方および逆のプライマーの 5' 領域は同様に 15 拠点の標的遺伝子の上流の並ぶ領域の下端およびターゲット遺伝子の下流の並ぶ領域の上部の端に補足を含めるそれぞれ。したがって、3 つの増幅されたフラグメントは融合サイトで重複する 30 塩基対の領域を含みます。2 番目のステップ (2nd PCR)、1st PCR テンプレートとしてによって増幅される 3 つの断片を使用して入れ子になった、PCR のプライマーと PCR が行われます。テンプレートの相補的な領域はさらに、2nd PCR によって互いにリンクされます。最後に、相同組換えの構造は、電気穿孔法による野生型株に導入です。成功した遺伝子破壊は、特異的プライマーを用いた PCR による検証可能性があります。中断構築は高忠実度 DNA ポリメラーゼを使用して増幅される DNA の ligation または DNA 消化など、追加の酵素反応は構成要素を生成する必要ありません。さらに、ゲノム上の削除または保存領域はプライマー デザインに応じて柔軟に選択されるかもしれない。
現在の仕事では、連鎖球菌種の迅速で簡単な遺伝子の中断方法を示すことミュータンス連鎖球菌グルコシルトランスフェラーゼをエンコード、 gtfC遺伝子のコーディングの地域の全体の削除を行った。さらに、 gtfB-破壊ひずみは、同じ方法で生成されました。GtfCとgtfBの両方でエンコードされた花色は、齲蝕原性歯科バイオ フィルム開発5,6に貢献します。野生型のバイオ フィルム形成能力ひずみ (s.mutans WT) gtfC-ひずみ (, S. mutans ΔgtfC)、およびgtfBを中断-中断ひずみ (, S. mutans ΔgtfB) を評価しました。比較の表現型解析。このプロトコルは、追加種に遺伝子破壊の二段階法のアプリケーションを拡張し、幅広い分類群の遺伝子機能の研究の変更可能性があります。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Streptococus mutans&lt;/em&gt;</td><td>Stock strain in the lab.</td><td></td><td>Wild-type strain (Strain UA159)</td></tr><tr><td>Genomic DNA extraction kit</td><td>Zymo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>Bead-beating disruption apparatus</td><td>Taitec</td><td>GM-01</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic genes</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Custom-ordered</td><td>Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene</td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>Astec</td><td>PC-708</td><td></td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Custom-ordered</td><td>35 bases in length</td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Takara</td><td>R045A</td><td>High-fidelity DNA polymerase</td></tr><tr><td>Gel extraction kit</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>DNA extraction from agarose gel</td></tr><tr><td>Gel band cutter</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>DU 800</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Bio-rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation cuvette</td><td>Bio-rad</td><td>1652086</td><td>0.2-cm gap</td></tr><tr><td>Anaeropack</td><td>Mitsubishi Gas Chemical</td><td>A-03</td><td>Anaerobic culture system</td></tr><tr><td>Brain heart infusion broth</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>Bacterial culture media</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Erythromycin</td><td>Wako</td><td>057-07151</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>For biofilm development</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>For biofilm staining</td></tr></tbody></table>

generation of a gene-disrupted streptococcus mutans strain without gene cloning

特定遺伝子の機能解明のための典型的な方法は、野生型株および興味の遺伝子が崩壊したひずみの比較の表現型解析を含みます。適切な抗生物質耐性マーカー遺伝子を含む遺伝子破壊 DNA コンストラクトは細菌の遺伝子破壊株の生成に役立ちます。しかし、遺伝子クローンの手順を必要とする従来の工法は、複雑で時間のかかるプロトコルを伴います。ここでは、比較的簡易、迅速かつコスト効果の高いミュータンス連鎖球菌の遺伝子破壊法を説明します。2 段階核融合ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 中断構築および形質転換をエレクトロポレーションを生成する方式します。このメソッドは、PCR 以外の酵素反応を必要としませんし、また中断構築のデザインの面での柔軟性を提供しています。エレクトロポレーションの雇用は有能なセルの準備を容易に、変換効率を向上します。本法は、様々 な種の遺伝子破壊系統の世代の適応可能性があります。

図 2は 1st PCR からそれぞれの製品のサイズを示す 1% の agarose のゲルの観察、良いと一致した予測サイズ約 1 kb の。図 3は、2nd PCR の製品のゲルの電気泳動分析を示しています。図 4は、 , S. mutansコロニー破壊コンストラクトとコロニー PCR の製品のゲルの電気泳動分析変換を示し?...

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Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌の世代の簡易・迅速かつ比較的安価な手法について述べる株;この手法は、様々 な種の遺伝子破壊系統の世代の適応可能性があります。

遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

generation-gene-disrupted-streptococcus-mutans-strain-without-gene

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

7.6K ビュー.  Tsurumi University School of Dental Medicine. 遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌の世代の簡易・迅速かつ比較的安価な手法について述べる株;この手法は、様々 な種の遺伝子破壊系統の世代の適応可能性があります。

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From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different conditions often leads to the production of new compounds. Therefore, production cultures of the strains are extracted with ethyl acetate and the crude extracts are analyzed by HPLC. Furthermore, the extracts are tested for their bioactivity by different assays. For structure elucidation the compound of interest is purified by a combination of different chromatography methods.
Genome sequencing coupled with genome mining allows the identification of a natural product biosynthetic gene cluster using different computer programs. To confirm that the correct gene cluster has been identified, gene inactivation experiments have to be performed. The resulting mutants are analyzed for the production of the particular natural product. Once the correct gene cluster has been inactivated, the strain should fail to produce the compound.
The workflow is shown for the antibacterial compound polyketomycin produced by Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028. Around ten years ago, when genome sequencing was still very expensive, the cloning and identification of a gene cluster was a very time-consuming process. Fast genome sequencing combined with genome mining accelerates the trial of cluster identification and opens up new ways to explore biosynthesis and to generate novel natural products by genetic methods. The protocol described in this paper can be assigned to any other compound derived from a Streptomyces strain or another microorganism.

Here we present a detailed protocol of (A) the identification of a natural product with antibiotic activity, (B) the purification of the compound, (C) the first model of its biosynthesis, (D) genome sequencing/-mining and the (E) verification of the biosynthetic gene cluster.

からPolyketomycinを使用したデモンストレーション：天然物からの生合成遺伝子クラスターへ<em&gt;ストレプトミセスdiastatochromogenes</em&gt;Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

遺伝学

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a particular genetic background or environmental condition1,2. There are examples where many genes need to be deleted to unmask hidden gene functions3,4. Despite the potential for important discoveries, genetic interactions involving three or more genes are largely unexplored. Exhaustive searches of multi-mutant interactions would be impractical due to the sheer number of possible combinations of deletions. However, studies of selected sets of genes, such as sets of paralogs with a greater a priori chance of sharing a common function, would be informative.
In the yeast Saccharomyces cerevisiae, gene knockout is accomplished by replacing a gene with a selectable marker via homologous recombination. Because the number of markers is limited, methods have been developed for removing and reusing the same marker5,6,7,8,9,10. However, sequentially engineering multiple mutations using these methods is time-consuming because the time required scales linearly with the number of deletions to be generated.
Here we describe the Green Monster method for routinely engineering multiple deletions in yeast11. In this method, a green fluorescent protein (GFP) reporter integrated into deletions is used to quantitatively label strains according to the number of deletions contained in each strain (Figure 1). Repeated rounds of assortment of GFP-marked deletions via yeast mating and meiosis coupled with flow-cytometric enrichment of strains carrying more of these deletions lead to the accumulation of deletions in strains (Figure 2). Performing multiple processes in parallel, with each process incorporating one or more deletions per round, reduces the time required for strain construction.
The first step is to prepare haploid single-mutants termed 'ProMonsters,' each of which carries a GFP reporter in a deleted locus and one of the 'toolkit' loci&#x2014;either Green Monster GMToolkit-a or GMToolkit-&alpha; at the can1&Delta; locus (Figure 3). Using strains from the yeast deletion collection12, GFP-marked deletions can be conveniently generated by replacing the common KanMX4 cassette existing in these strains with a universal GFP-URA3 fragment. Each GMToolkit contains: either the a- or &alpha;-mating-type-specific haploid selection marker1 and exactly one of the two markers that, when both GMToolkits are present, collectively allow for selection of diploids.
The second step is to carry out the sexual cycling through which deletion loci can be combined within a single cell by the random assortment and/or meiotic recombination that accompanies each cycle of mating and sporulation.

The Green Monster method enables the rapid assembly of multiple deletions marked with a reporter gene encoding green fluorescent protein. This method is based on driving yeast strains through repeated cycles of sexual assortment of deletions and fluorescence-based enrichment of cells carrying more deletions.

複数の遺伝子欠失を持つ酵母菌株の世代のためのグリーンモンスタープロセス

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

生物学

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

連鎖球菌変異体における高分子塊タンパク質の精製

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

免疫・感染学

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

緑膿菌におけるフレーム内遺伝子欠失変異体の生成と感染の単純マウスモデルにおける毒性減衰の試験

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in elucidating the mechanisms that C. trachomatis use to create and maintain a privileged intracellular niche has been limited due to a lack of genetic tools. Fortunately, there have recently been several new advances in genetic manipulation techniques. Among these is the development of fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis (FRAEM). This method allows targeted gene deletion coupled with insertion of a selection cassette encoding antibiotic resistance and green fluorescent protein (GFP). Reliance on this strategy can be complicated when targeting genes within polycistronic operons due to the potential of polar effects on downstream genes. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), the protocol for which is described here, was developed to alleviate cassette-induced polar effects. FLAEM utilizes Cre-loxP genome editing to remove the selection cassette after targeted deletion by allelic exchange. The resulting strains contain markerless gene deletions of one or more coding sequences. This technique facilitates direct assessment of gene function and expands the repertoire of tools for genetic manipulation in C. trachomatis.

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Described here is a method for targeted, markerless gene deletion in Chlamydia trachomatis using floxed cassette allelic exchange mutagenesis, FLAEM.

クラミジア・トラコマティスにおけるフロキセカセットアレリック交換変異誘発によるマーカーレス遺伝子欠失

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in ...

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, studies in this serotype have been hindered by the lack of genetic tools to modify it. In this study, we describe a method to genetically modify a serotype 1 clinical isolate (strain 519/43). Interestingly, this was achieved by exploiting the Pneumococcus&#8217; ability to naturally acquire DNA. However, unlike most pneumococci, the use of linear DNA was not successful; to mutate this important strain, a suicide plasmid had to be used. This methodology has provided the means for a deeper understanding of this elusive serotype, both in terms of its biology and pathogenicity. To validate the method, the major known pneumococcal toxin, pneumolysin, was mutated because it has a well-known and easy to follow phenotype. We showed that the mutant, as expected, lost its ability to lyse red blood cells. By being able to mutate an important gene in the serotype of interest, we were able to observe different phenotypes for loss of function mutants upon intraperitoneal and intranasal infections from the ones observed for other serotypes. In summary, this study proves that strain 519/43 (serotype 1) can be genetically modified.

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Here, we describe a S. pneumoniae serotype 1 strain 519/43 that can be genetically modified by using its ability to naturally acquire DNA and a suicide-plasmid. As proof of principle, an isogenic mutant in the pneumolysin (ply) gene was made.

血清型1肺 炎球 菌519/43株における変異体の構築

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

細菌の運動性における細菌の糖転移酵素の役割を解明するためのヌル変異体の生成

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

の世代<em&gt;エンテロバクター</em&gt;エスピー。 YSU要求株にはトランスポゾン突然変異誘発を用いて

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of 'escape' of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.

Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

モデルシアノバクテリア種のマークとマーカーレス変異体の生成

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成

要約

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からPolyketomycinを使用したデモンストレーション：天然物からの生合成遺伝子クラスターへ

複数の遺伝子欠失を持つ酵母菌株の世代のためのグリーンモンスタープロセス

連鎖球菌変異体における高分子塊タンパク質の精製

ゲノムワイドな遺伝子欠失で

緑膿菌におけるフレーム内遺伝子欠失変異体の生成と感染の単純マウスモデルにおける毒性減衰の試験

クラミジア・トラコマティスにおけるフロキセカセットアレリック交換変異誘発によるマーカーレス遺伝子欠失

血清型1肺炎球菌519/43株における変異体の構築

細菌の運動性における細菌の糖転移酵素の役割を解明するためのヌル変異体の生成

の世代

モデルシアノバクテリア種のマークとマーカーレス変異体の生成

遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成

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複数の遺伝子欠失を持つ酵母菌株の世代のためのグリーンモンスタープロセス

連鎖球菌変異体における高分子塊タンパク質の精製

ゲノムワイドな遺伝子欠失で

緑膿菌におけるフレーム内遺伝子欠失変異体の生成と感染の単純マウスモデルにおける毒性減衰の試験

クラミジア・トラコマティスにおけるフロキセカセットアレリック交換変異誘発によるマーカーレス遺伝子欠失

血清型1肺 炎球 菌519/43株における変異体の構築

細菌の運動性における細菌の糖転移酵素の役割を解明するためのヌル変異体の生成

の世代

モデルシアノバクテリア種のマークとマーカーレス変異体の生成

血清型1肺炎球菌519/43株における変異体の構築