Name: oral biofilm sampling for microbiome analysis in healthy children
Uploaded: 2017-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children at JoVE.com

Die Autoren sind dankbar für die hervorragende technische Unterstützung in der Videoproduktion und Monica Farrell (Forschungsmanagement, medizinische Universität Graz) als Sprecher Joachim Theussl (Zentrum für medizinische Forschung, medizinische Universität Graz).

Protokoll und video-Aufnahmen wurden von der institutionellen Review Board der medizinischen Universität Graz (Votum 27-126ex14/15) genehmigt. Schriftlicher Zustimmung für dieses video wurde von dem Kind und ihrer Eltern erhalten.
1. Instrumente und Materialien
<ol>
	<li>Schnitt kalibriert (ISO 015/02) und steriler Papierspitzen, verwendet in der Regel in der endodontischen Therapie, bei der ersten Ring-Markierung um ihre Länge (Abbildung 1) zu standardisieren.</li>
	<li>Anwendung von UV-Licht-Bestrahlung bei 260 nm für 30 min zur Vermeidung von DNA und RNA Kontamination von Papierspitzen (Abbildung 2).</li>
	<li>Autoklaven der Rohre für die Lagerung bei 120 ° C und 1,2 bar für 20 min und UV bestrahlen sie sowie oder beschäftigen Ready-to-Use Gamma bestrahlt Röhren.</li>
</ol>
2. Vorbereitung des Probanden
Hinweis: Schriftliche Einwilligungserklärung wurde von Kind und Eltern vor der Einschreibung erhalten.
<ol>
	<li>Kakaobutter auf die Lippen auftragen</li>
	<li>Montieren Sie die Wange und Zunge Retraktor für vollen Zugriff auf beide dental Bögen.</li>
	<li>Führen Sie der Zahnbelag mit Plaque Offenlegung zu Flecken.</li>
	<li>Entfernen Sie den trockenen Bereich Apparat.</li>
	<li>Spülen Sie den Mund mit Wasser, bis das Wasser farblos ist.</li>
	<li>Putzen Sie die Zähne gründlich mit einer elektrischen Zahnbürste auf 45° Winkelung. Geben Sie Wasser nur aber keine Zahnpasta den oralen Biofilm verändern würde.</li>
	<li>Montieren Sie den trockenen Bereich Apparat wieder, einschließlich der Zunge Guard um den Mund offen und trocken zu halten.</li>
	<li>Sauber und trocken zeigen die Index-Zähne mit sterilen Wattestäbchen, Aufnahme von supragingivale Flüssigkeit bei Papier zu vermeiden Probenahme.</li>
</ol>
(3) Biofilm Sampling
<ol>
	<li>Papier Punkt Probenahme von subgingivalen sulcus
	<ol>
		<li>Greifen Sie die Papierspitzen mit sterilen zahnärztliche Pinzette.</li>
		<li>Legen Sie Papier Punkte tangential bis zu einer definierten Länge von 4 mm. Besondere Vorsicht nicht zu traumatisieren die Knoten Epithel (Abbildung 3).</li>
		<li>Entfernen Sie Papierspitzen nach 20 s.</li>
		<li>Papierspitzen direkt in vorbereiteten Röhren sammeln: setzen Sie die Papier-Punkt-Spitze direkt in einem sterilen und DNA-freie Fläschchen, und schneiden Sie es bei der dritten Marke auf eine einheitliche Länge von 4 mm (Abbildung 4).</li>
		<li>Wenn durch die Studienprotokolle angezeigt, legen Sie zwei Papierspitzen parallel und gleichzeitig am selben Standort (Abb. 5A).</li>
		<li>Papierspitzen alternativ von mehreren Seiten zu sammeln, wenn das Studienprotokoll "gepoolte Proben" erfordert (Abb. 5 b).</li>
		<li>Entfernen Sie die trockenen Bereich Vorrichtung zur Schleimhaut und Speichel Sampling.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Schleimhaut Papier Punkt Probenahme
	<ol>
		<li>Papierspitzen auf die vestibuläre Falte die obere Backe (Abbildung 6) anwenden.</li>
		<li>Schließen Sie die Wange und massieren Sie es kurz.</li>
		<li>Öffnen Sie die Wange und entfernen Sie die Papierspitzen nach 20 s.</li>
		<li>Schneiden Sie Papierspitzen bei der dritten Marke und legen Sie sie in ein steriles Röhrchen wie für subgingivalen Probenahme angegeben.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Speichel sampling
	<ol>
		<li>Lassen Sie das Kind spucken unstimulierte Speichel in eine sterilisierte Sammelbehälter (Abbildung 7).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Übertragung und Speicherung
<ol>
	<li>Sammeln Sie Papierspitzen als Einzel-, gebündelt oder parallel Proben je nach Studiendesign (Abbildung 8).</li>
	<li>Anwenden einer farbcodierten Speichersystem um Probenverwaltung (Abbildung 9) weiter zu erleichtern.</li>
	<li>Schließlich speichern Sie die Proben bei −80 ° C bis Microbiome Analyse.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Paster, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Diversity+in+Human+Subgingival+Plaque.">Bacterial Diversity in Human Subgingival Plaque.</a> J Bacteriol. 183 (12), 3770-3783 (2001).</li><li>Aas, J., Paster, B., Stokes, L., Olsen, I., Dewhirst, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Normal+Bacterial+Flora+of+the+Oral+Cavity.">Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity.</a> J Clin Microbiol. 43 (11), 5721-5732 (2005).</li><li>Ledder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Analysis+of+the+Subgingival+Microbiota+in+Health+and+Disease.">Molecular Analysis of the Subgingival Microbiota in Health and Disease.</a> Appl Environ Microb. 73 (2), 516-523 (2007).</li><li>Zaura, E., Keijser, B., Huse, S., Crielaard, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+healthy+'core+microbiome'+of+oral+microbial+communities.">Defining the healthy 'core microbiome' of oral microbial communities.</a> BMC Microbiol. 9 (259), 1-12 (2009).</li><li>Alcaraz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+a+healthy+oral+microbiome+through+metagenomics.">Identifying a healthy oral microbiome through metagenomics.</a> Clin Microbiol Infec. 18 (11), 54-57 (2012).</li><li>Dewhirst, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Oral+Microbiome.">The Human Oral Microbiome.</a> J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).</li><li>Keijser, B. J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+analysis+of+the+Oral+Microflora+of+healthy+adults.">Pyrosequencing analysis of the Oral Microflora of healthy adults.</a> Journal of Dental Research. 87, 1016-1020 (2008).</li><li>K&#246;n&#246;nen, E., M&#252;ller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiology+of+aggressive+periodontitis.">Microbiology of aggressive periodontitis.</a> Periodontol 2000. 65 (1), 46-78 (2014).</li><li>Nasidze, I., Li, J., Quinque, D., Tang, K., Stoneking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+diversity+in+the+human+salivary+microbiome.">Global diversity in the human salivary microbiome.</a> Biotechfor. 19 (4), 636-643 (2009).</li><li>Jerv&#248;e-Storm, P. M., Koltzscher, M., Falk, W., D&#246;rfler, A., Jepsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+culture+and+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+five+putative+periopathogenic+bacteria+in+subgingival+plaque+samples.">Comparison of culture and real-time PCR for detection and quantification of five putative periopathogenic bacteria in subgingival plaque samples.</a> J Clin Periodontol. 32 (7), 778-783 (2005).</li><li>Ouhara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibilities+of+periopathogenic+and+cariogenic+bacteria+to+antibacterial+peptides,+&#946;-defensins+and+LL37,+produced+by+human+epithelial+cells.">Susceptibilities of periopathogenic and cariogenic bacteria to antibacterial peptides, &#946;-defensins and LL37, produced by human epithelial cells.</a> J Antimicrob Chemoth. 55, 888-896 (2005).</li><li>Belda-Ferre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oral+metagenome+in+health+and+disease.">The oral metagenome in health and disease.</a> ISME J. 6 (1), 46-56 (2011).</li><li>Holt, S., Ebersole, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porphyromonas+gingivalis,+Treponema+denticola,+and+Tannerella+forsythia:+the+'red+complex',+a+prototype+polybacterial+pathogenic+consortium+in+periodontitis.">Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia: the 'red complex', a prototype polybacterial pathogenic consortium in periodontitis.</a> Periodontol 2000. 38, 72-122 (2005).</li><li>Gomez, A., Nelson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oral+Microbiome+of+Children:+Development,+Disease,+and+Implications+Beyond+Oral+Health.">The Oral Microbiome of Children: Development, Disease, and Implications Beyond Oral Health.</a> Microb Ecol. 73 (2), 492-503 (2017).</li><li>Klug, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Biofilm+Analysis+of+Palatal+Expanders+by+Fluorescence+In-Situ+Hybridization+and+Confocal+Laser+Scanning+Microscopy.">Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy.</a> J Vis Exp. , e2967 (2011).</li><li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms.">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> J Vis Exp. , (2016).</li><li>Kilian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oral+microbiome+-+an+update+for+oral+healthcare+professionals.">The oral microbiome - an update for oral healthcare professionals.</a> British Dental Journal. 221 (10), 657-666 (2016).</li><li>Razzouk, S., Termechi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+genome,+epigenome,+and+oral+microbiome+interactions:+toward+personalized+periodontal+therapy.">Host genome, epigenome, and oral microbiome interactions: toward personalized periodontal therapy.</a> J Periodontol. 84 (9), 1266-1271 (2012).</li><li>De Freitas, A., Marquezan, M., da Nojima, M., Alviano, D., Maia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+orthodontic+fixed+appliances+on+the+oral+microbiota:+A+systematic+review.">The influence of orthodontic fixed appliances on the oral microbiota: A systematic review.</a> Dent Press J Orthod. 19 (2), 46-55 (2014).</li><li>Akin, M., Tezcan, M., Ileri, Z., Ayhan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+white+spot+lesions+among+patients+treated+with+self-+and+conventional+ligation+systems.">Incidence of white spot lesions among patients treated with self- and conventional ligation systems.</a> Clin Oral Invest. 19 (6), 1501-1506 (2015).</li><li>Ren, Y., Jongsma, M., Mei, L., van der Mei, H., Busscher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthodontic+treatment+with+fixed+appliances+and+biofilm+formation-a+potential+public+health+threat?.">Orthodontic treatment with fixed appliances and biofilm formation-a potential public health threat?.</a> Clin Oral Invest. 18 (7), 1711-1718 (2014).</li><li>Santigli, E., Trajanoski, S., Eberhard, K., Klug, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+Modification+Effects+in+the+Subgingival+Microbiome+Profile+of+Healthy+Children.">Sampling Modification Effects in the Subgingival Microbiome Profile of Healthy Children.</a> Frontiers Microbiol. 7, 2142 (2017).</li><li>Klug, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Mouth+to+Model:+Combining+in+vivo+and+in+vitro+Oral+Biofilm+Growth.">From Mouth to Model: Combining in vivo and in vitro Oral Biofilm Growth.</a> Frontiers Microbiol. 7, 1448 (2016).</li><li>Xim&#233;nez-Fyvie, L., Haffajee, A., Socransky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+composition+of+supra-+and+subgingival+plaque+in+subjects+with+adult+periodontitis.">Microbial composition of supra- and subgingival plaque in subjects with adult periodontitis.</a> J Clin Periodontol. 27 (10), 722-732 (2000).</li><li>Zijnge, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Biofilm+Architecture+on+Natural+Teeth.">Oral Biofilm Architecture on Natural Teeth.</a> PLoS ONE. 5 (2), e9321 (2010).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+high+throughput+sequencing+to+explore+the+biodiversity+in+oral+bacterial+communities.">Using high throughput sequencing to explore the biodiversity in oral bacterial communities.</a> Mol Oral Microbiol. 27 (3), 182-201 (2012).</li><li>Goode, M., Cheong, S., Li, N., Ray, W., Bartlett, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+and+extraction+of+saliva+DNA+for+next+generation+sequencing.">Collection and extraction of saliva DNA for next generation sequencing.</a> J Vis Exp. , (2014).</li><li>Hodgson, N., Granger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting+saliva+and+measuring+salivary+cortisol+and+alpha-amylase+in+frail+community+residing+older+adults+via+family+caregivers.">Collecting saliva and measuring salivary cortisol and alpha-amylase in frail community residing older adults via family caregivers.</a> J Vis Exp. , e50815 (2013).</li><li>Luo, A. H., Yang, D. Q., Xin, B. C., Paster , B. J., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+profiles+in+saliva+from+children+with+and+without+caries+in+mixed+dentition.">Microbial profiles in saliva from children with and without caries in mixed dentition.</a> Oral Dis. 18 (6), 595-601 (2012).</li><li>Nasidze, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+human+saliva+microbiome+diversity+by+barcoded+pyrosequencing+and+cloning+approaches.">Comparative analysis of human saliva microbiome diversity by barcoded pyrosequencing and cloning approaches.</a> Anal Biochem. 391 (1), 64-68 (2009).</li><li>Pfaffe, T., Cooper-White, J., Beyerlein, P., Kostner, K., Punyadeera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+Potential+of+Saliva:+Current+State+and+Future+Applications.">Diagnostic Potential of Saliva: Current State and Future Applications.</a> Clin Chem. 57 (5), 675-687 (2011).</li><li>Zhu, W., Gallo, R., Huang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+human+indigenous+saliva+peptidome+using+a+lollipop-like+ultrafiltration+probe:+simplify+and+enhance+peptide+detection+for+clinical+mass+spectrometry.">Sampling human indigenous saliva peptidome using a lollipop-like ultrafiltration probe: simplify and enhance peptide detection for clinical mass spectrometry.</a> J Vis Exp. , e4108 (2012).</li><li>Belibasakis, G., Schmidlin, P., Sahrmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+microbiological+evaluation+of+subgingival+biofilm+sampling+by+paper+point+and+curette.">Molecular microbiological evaluation of subgingival biofilm sampling by paper point and curette.</a> Apmis. 122 (4), 347-352 (2014).</li><li>Hayashi, F., Okada, M., Soda, Y., Miura, K., Kozai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgingival+distribution+of+Campylobacter+rectus+and+Tannerella+forsythensis+in+healthy+children+with+primary+dentition.">Subgingival distribution of Campylobacter rectus and Tannerella forsythensis in healthy children with primary dentition.</a> Arch Oral Biol. 51 (1), 10-14 (2006).</li><li>Papaioannou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+on+different+oral+surfaces+in+healthy+children.">The microbiota on different oral surfaces in healthy children.</a> Oral Microbiol Immunol. 24 (3), 183-189 (2009).</li><li>Abusleme, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subgingival+microbiome+in+health+and+periodontitis+and+its+relationship+with+community+biomass+and+inflammation.">The subgingival microbiome in health and periodontitis and its relationship with community biomass and inflammation.</a> ISME J. 7 (5), 1016-1025 (2013).</li><li>Griffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+complex+bacterial+profiles+in+human+periodontitis+and+health+revealed+by+16S+pyrosequencing.">Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16S pyrosequencing.</a> ISME J. 6 (6), 1176-1185 (2011).</li><li>J&#252;nemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Community+Shift+in+Treated+Periodontitis+Patients+Revealed+by+Ion+Torrent+16S+rRNA+Gene+Amplicon+Sequencing.">Bacterial Community Shift in Treated Periodontitis Patients Revealed by Ion Torrent 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing.</a> PLoS ONE. 7 (8), e41606 (2012).</li><li>Cortelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+periodontal+pathogens+in+newborns+and+children+with+mixed+dentition.">Detection of periodontal pathogens in newborns and children with mixed dentition.</a> European J Clin Microbiol Infect Dis. 31, 1041-1050 (2012).</li><li>Trajanoski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+in+microbiome+analysis:+factors+affecting+reproducibility+of+repeated+biofilm+sampling+of+the+gingival+sulcus+of+children.">Next-generation sequencing in microbiome analysis: factors affecting reproducibility of repeated biofilm sampling of the gingival sulcus of children.</a> JDOCE. 1 (3), 34-46 (2013).</li><li>Jongsma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+on+stainless+steel+and+gold+wires+for+bonded+retainers+in+vitro+and+in+vivo+and+their+susceptibility+to+oral+antimicrobials.">Biofilm formation on stainless steel and gold wires for bonded retainers in vitro and in vivo and their susceptibility to oral antimicrobials.</a> Clin Oral Invest. 17 (4), 1209-1218 (2013).</li></ol>

Die Autoren berichten keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser wissenschaftlichen Videoproduktion.

Bakterien sind an allen Standorten innerhalb der Mundhöhle24,25,26gefunden. Viele Studien konzentrierten sich auf die Verwendung von Speichel als Medium Probenahme mündliche Kolonisation zuordnen, da es leicht entnommen werden kann, durch spucken27,28,29,30,31, 32. Allerdings spiegelt die Speicheldrüsen Biofilm nicht subgingivaler Biofilm Zusammensetzung. So, die Verwendung von anderen Probenahmeverfahren ist entscheidend für das ganze Bild zu schaffen und neue Diskussionen in der zahnmedizinischen Forschung wecken wird. Mehrere Artikel vergleichen die Verwendung von Zigarretten und Papierspitzen zur subgingivalen Probenahme von periodontally erkrankten Probanden8,33,34. Noch ist keine Forschungsgruppe bekannt, auf die Anwendung von standardisierten Probenahmegeräte für verschiedene Altersgruppen, vor allem für Kinder19konzentriert haben.
In diesem Video präsentiert oralen Biofilm Probenahme von drei mündliche Lebensräume bei gesunden Kindern.
Modifikationen und Fehlerbehebung:
Das Ziel des Manuskripts konzentriert sich auf das klinische Protokoll für subgingivaler Biofilm Probenahme von gesunden Kindern. Die Methode der Wahl bezieht sich auf solide subgingivalen Furchen wo Platzmangel macht Probenahme besonders anspruchsvoll. In diesem Video wurde die Methode zur frühen permanente Gebiss angewendet. Es kann auch gemischt oder Reife Gebiss und Kinder und/oder Erwachsene angewendet werden. Unsere Sampling-Methode ermöglicht Modifikationen wie Einzel- oder gepoolten Proben. Letzteres könnte ein entscheidender Faktor für molekulare Analysen aufgrund der geringen Menge der DNA Sammlerstücke aus der gesunden subgingivalen Sulcus geworden. Die Wahl der Index Zähne kann bei Bedarf geändert werden; insbesondere, möglicherweise einem anderen Zahn Stichprobe als eine Alternative, wenn das Epithel traumatisiert ist und Blutungen, wodurch die Papierspitze unbrauchbar. Parallele Probenahmen mit zwei Papierspitzen gleichzeitig an einem Standort macht Probe Wiederholungen in einem Schritt, neben der Verkürzung der Behandlungszeit für Kinder.
Mit geringfügigen Änderungen können erkrankten Zahnfleischtaschen entnommen werden. Papierspitzen müssen hier auf die volle Länge der Tasche eingefügt werden, die bis zu 10 mm erreichen. Die Länge und Conus Papierspitzen sowie die Tiefe der Einfügung der intraoralen Lebensraum von Interesse angepasst werden müssen, sondern sollte immer durch Material und Dimensionen vereinheitlicht werden. Proben können auch die Schleimhaut mit Papierspitzen entnommen werden. Identische Protokolle erlauben Vergleiche der verschiedenen mündlichen Lebensräume und verschiedenen Dentalmaterialien. Patientenvorbereitung und Lagerung der Probe können durchgeführt werden, wie in diesem Video beschrieben. Für die Metatranskriptom Forschung könnte RNA mit der gleichen Methode beprobt werden. Daher sollte nach der Probenahme, die Papierspitzen direkt in RNA Stabilisierung Lösung eingefügt werden.
Grenzen der Technik:
Unabhängig von Änderungen ist die klinische Sampling-Methode, die wir beschreiben beschränkt sich auf die solide subgingivalen Sulcus. Anderen Meßstellen für Beispiel periodontally erkrankten Taschen, waren nicht Teil unserer Studie Design. Papierspitzen sind möglicherweise nicht groß genug, um ausreichend Proben zu sammeln, bei Bedarf Probenahme, die volle Tiefe der solche Taschen. Wenn experimentelle Ziel ist es, Daten von sound subgingivalen Furchen und periodontally erkrankten Taschen abgetastet zu vergleichen, ist es wichtig die inhärente Tendenz bewusst sein, die verschiedenen klinischen Probenahmeverfahren zugeordnet ist. Es ist daher nicht ratsam, solche Daten zu vergleichen.
Eine Einschränkung der hier vorgestellten Methode ist ohne die spätere Verwendung der Propidium Monoazide Probenahme. Durch Hinzufügen dieser Agent direkt nach der Entnahme können für spezifische Analyse nur die lebenden Zellen im Biofilm analysiert. Die hier beschriebene Samplingmethode spiegelt Anzahlen von lebenden und toten Zellen. Für die Forschung von schweren Parodontitis müssen Papierspitzen wahrscheinlich durch Küretten, ersetzt werden da Biofilmbildung in tiefen Taschen stark ist. Papierspitze Probenahme nicht das gesamte Spektrum der mikrobiellen in diesen Fällen widerspiegeln könnte, da ihre Oberfläche zu schnell gesättigt sein könnte.
Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden:
Das vorgeschlagene Manuskript ist das erste seiner Art, subgingivalen Probenahme in der gesunden Sulcus mit Papierspitzen zu standardisieren. Andere Berichte eingegangen, die Verwendung von Metall Küretten35,36 oder Papier 37,38,39Punkte, aber nicht beschreiben, die Prozesse, die vor der Probennahme, statt solche als Plaquekontrolle, Zahnreinigung, Zahn Isolation und trocknen sowie die Prozesse führen, die aus unzureichenden Spezifikationen auf die Entnahmeleitungen Technik und Zeit.
In zwei früheren Artikeln zeigen wir, dass die Verwendung von Papier Punkten eine reproduzierbare Methode zur subgingivaler Biofilm Sampling im Kinder22,40. Aufgrund ihrer Konstruktion sind Zigarretten zu groß für die flachen Sulcus mit wenig Platz und zu scharf für die zarten Knoten Epithel. Es ist entscheidend für die subgingivalen Sulcus zugreifen, ohne das Epithel traumatisierend. Auf diese Weise ist Voreingenommenheit entstehenden Blutungen vermieden. Somit ist die Verwendung von schlank und zart Papierspitzen bevorzugt für diesen Bereich. Papierspitzen sind funktionelle Veränderungen im Biofilm Zusammensetzung während der kieferorthopädischen Behandlung21,41überwachen. Sie sind schlank und flexibel genug, um zwischen den Elementen von festen kieferorthopädischen Geräten passen. Dies ist ein großer Vorteil zu anderen Probenahmeverfahren wie Zigarretten. Atraumatisch Probenahme wird vereinfacht und Probenahme von geringen Mengen von DNA ist möglich.
Zukünftige Anwendungen:
In diesem Video haben wir die Methode auf nicht-erkrankten, frühen, permanente Gebiss gezeigt. Es kann auch auf gemischte oder Reife Gebiss angewendet werden. Mit gewissen Anpassungen ist es möglich, periodontally erkrankten Websites wie Zähne oder Implantate und anderen Nischen durch Dentalmaterialien zu probieren, durch Anschluss an das gleiche Protokoll. Karies-Forschung profitieren von dieser standardisierten Protokoll, insbesondere Studien auf Wurzelkaries. Der wichtigste Vortrag aus unserer video Probenahme ist die Standardisierung der Protokolle zu machen Daten vergleichbar, egal was und wie Proben gemessen werden.Zukunft video-Demonstrationen könnte das Feld der klinischen Probenahme im Allgemeinen verbessern.
Oralen Biofilm erhalten wie im Video gezeigt wird in Kliniken und für wissenschaftliche Untersuchungen verwendet. In Vivo ist eine gute Ergänzung für in-vitro- Molekulare Techniken wie Fluoreszenz in Situ Hybridisierung und konfokale Laser-scanning-Mikroskopie15. NGS Methoden können als die hier gezeigten Pyrosequenzierung angewendet, die gesammelten Biofilm, die Analyse der kompletten Mikrobiota. Berechnung der relativen Häufigkeiten bestimmte Bakterienarten, Behandlungen zu unterstützen oder um verschiedene Patienten oder verschiedenen Behandlungen zu vergleichen lässt. Zusammen mit standardisierten Sequenzierung Protokoll und Sequenz-Analyse-Workflow haben wir zuvor beschrieben40, dieses Sampling-Methode ermöglicht Sequenzanalyse bis auf die Ebene der Gattung. Weitere "Meta"-Studien wie z. B. Metatranscriptomic oder Metabolomic Studien möglich sind anhand der Probenahme-Protokoll in diesem Video vorgestellt.
Wichtige Schritte:
Vermeidung von Kontaminationen ist ein entscheidender Schritt: sterile Instrumente müssen in einer Umgebung unsteril in Vivo angewandt werden. Die Übertragung aus dem Mund an der Werkbank muss schnell und sicher durchgeführt werden, von einem erfahrenen Prüfer Behandlungszeit für Studienteilnehmer so kurz wie möglich zu halten. Der wichtigste Schritt im Protokoll ist das atraumatische Einfügen von Papierspitze in der subgingivalen Sulcus. Störung der Knoten Epithel und absolut Blutungen müssen vermieden werden. Weitere Versorgung muss ergriffen werden, um die Papierspitzen und Lagerung Fläschchen mit exogener DNA oder RNA nicht verunreinigen. Die Lagerung selbst dann ist auch ein wichtiger Schritt. Proben müssen eingefroren werden direkt, am besten bei −80 ° C. Dies vermeidet Änderungen bei der bakteriellen Zusammensetzung Post Probenahme, die Sequenzierung Ergebnisse verfälschen würde.

Menschlichen oralen Biofilm besteht aus einer breiten Community, bestehend hauptsächlich aus Kommensalen und nützlichen Mikroorganismen1,2,3. Zu kolonisieren Arten finden Sie hier alle Nischen, dass die Mundhöhle4,5,6 bietet. Biofilm-Zusammensetzung in diesen Nischen variiert so weit wie die Lebensräume. Speichel wird z. B. verschiedene bakterielle Profile als Plaque Proben. In Plaque Proben von gesunden Erwachsenen ist die relative Häufigkeit der Actinobacteria über 20 %, während weniger als 7 % im Speichel gefunden wird. Bacteroidetes und Firmicuten erscheinen dagegen in viel größerer Zahl im Speichel7. So ist es wichtig, Probe an verschiedenen Standorten in den Mund, um das Gesamtbild zu erhalten. Verschiedener Faktoren wie geographische und ethnische Unterschiede, Alter, Geschlecht und viele andere Faktoren erschweren zusätzlich das allgemeine Regeln für Biofilm Entwicklung und Krankheit Beginn8,9zu identifizieren. Die Untersuchung der Periopathogenic und kariogenen Biofilm hat seit vielen Jahren ein zentrales Anliegen8,10,11,12,13.
In den letzten Jahren hat die Forschung an gesunden Probanden Bedeutung nicht nur für ein umfassenderes Verständnis der Krankheit, sondern auch für die Umsetzung von vorbeugenden Maßnahmen14gewonnen. Neue Technologien und molekulare Analysen weiter aufzuklären, mündliche Biofilmbildung und Funktion15,16, und ermöglichen die komplette Profilierung der mikrobiellen Diversität17,18. Dies wird voraussichtlich auch zu einem neuen Verständnis von mikrobiellen Veränderungen während der kieferorthopädischen Therapie19führen. Auswirkungen auf die Entwicklung der kieferorthopädischen Biomaterialien ist absehbar. Die erweiterte Perspektive beleuchten neue Komplikationen der kieferorthopädischen Therapie verbunden mit Biofilm, wie Emaille Demineralisation und Parodontalerkrankungen12,20,21. Um weltweit Datenvergleiche zu ermöglichen, ist es wichtig, alle Schritte in die Datengenerierung zu standardisieren. Geringfügige Änderungen im Laborverfahren können die Ergebnisse stark beeinflussen. Darüber hinaus kann die Verwendung unterschiedlicher rechnerische Plattformen in der Datenverarbeitung zu nicht vergleichbaren Datensätzen führen. Zu guter Letzt hat die Wahl von statistischen Tests und Korrekturen einen Einfluss auf die Ergebnisse. Jedoch Probenahme Voreingenommenheit kann bereits lange vor jeder Arbeit im Labor auftreten oder Bio-computing beginnt. Nicht-standardisierte Stichprobenverfahren führen zu einer von Natur aus voreingenommenen Studie. Im Hinblick auf geringe bis moderatem Niveau der Standardisierung in den relevanten Studien gibt es wenig Beweise über die Beziehung zwischen Kieferorthopädie und Mikrobiome19. Daher würde die Entwicklung standardisierter Methoden qualifizierter Vergleich der Daten im Feld erleichtern.
Dieser Artikel stellt standardisierte oralen Biofilm Stichprobenverfahren. Das Protokoll soll dazu beitragen, weltweit vergleichbare Sammlungen von mikrobiellen Sequenzdaten generieren. Ein Schritt für Schritt Protokoll zur oralen Biofilm Probenahme bei gesunden Kindern wird vorgestellt. Als die Methode der Wahl sind Papierspitzen eingefügten Zahnimplantat in den Ton subgingivalen Sulcus. Um Lebensraum Vergleiche zu erleichtern, wird die Schleimhaut der Wange nach dem gleichen Protokoll abgetastet. Dieser Artikel beschreibt außerdem parallel und zusammengefasste Probenahme. Darüber hinaus ist Speichel Sampling gezeigt. Eine einfache Farbcodierung Transport und Speichersystem wird ebenfalls dargestellt, Probe-Management zur weiteren Verarbeitung zu erleichtern. Die Wahl der downstream-Aktivitäten bezüglich Speichermedium, metagenomische Analysen und Bioinformatik richtet sich klinische Fragen nach verschiedenen Feldern in der mündlichen Forschung. In diesem Manuskript wurde DNA-Proben für NGS als Beispiel für eine mögliche Anwendung für die kieferorthopädischen Forschung gewählt.

<table><tbody><tr><td>Paper Points Taper .02, sterilised</td><td>VDW Dental</td><td>550 029 015</td><td>http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&amp;amp;cHash=&lt;br/&gt; 1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2</td></tr><tr><td>GC Cocoa Butter, Tube of 10 g</td><td>GC EUROPE N.V.</td><td>000387</td><td>http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22</td></tr><tr><td>Rondells blue</td><td>DIRECTA AB</td><td>Rondell Tablets</td><td>http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767</td></tr><tr><td>Great Lakes Nola Dry Field System</td><td>Great Lakes Ortho</td><td>300-401</td><td>http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626</td></tr><tr><td>tooth brush</td><td>Oral-B</td><td></td><td>http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro</td></tr><tr><td>micro-Ident plus11</td><td>Hain Lifescience GmbH</td><td>23312</td><td>http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html</td></tr><tr><td>ParoCheck</td><td>Greiner Bio One International GmbH</td><td>460020</td><td>https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/</td></tr><tr><td>Carpegen Perio Diagnostik</td><td>Carpegen GmbH</td><td></td><td>http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html</td></tr><tr><td>tubes Reaktionsgef&amp;auml;&amp;szlig;e 1,5 ml</td><td>Lactan</td><td>CH77.1&amp;nbsp; to CH81.1</td><td>www.lactan</td></tr><tr><td>cotton swabs</td><td>Henry Schein</td><td>9003182</td><td>www.henryschein.at</td></tr></tbody></table>

oral biofilm sampling for microbiome analysis in healthy children

Oraler Biofilm und seiner molekularen Analyse bilden eine Grundlage für die Untersuchung von verschiedenen zahnmedizinischen Forschung und klinischen Fragestellungen. Kenntnis der Zusammensetzung des Biofilms führt zu einem besseren Verständnis der Mechanismen kariogenen und Periopathogenic. Mikrobielle Veränderungen in der Mundhöhle während der Kindheit sind aus mehreren Gründen interessant. Die Entwicklung des Kindes mündliche Mikrobiota und Verschiebungen in der Zusammensetzung müssen weiter analysiert werden, um zu verstehen und möglicherweise verhindern, dass den Ausbruch der Krankheit. Zur gleichen Zeit braucht man fortgeschrittene Kenntnisse in der natürlichen Zusammensetzung der oralen Biofilm. Frühe Stadien der kariesfreien permanente Gebiss mit gesundem Zahnfleisch bieten einen weitgehend unberührt subgingivalen Lebensraum, der als ein in Situ -Baseline für die Untersuchung der Eigenschaften der oralen Gesundheit und Krankheit dienen kann. Analyse von Kinder oralen Biofilm in einzelnen Phasen im Leben ist daher ein wichtiges Thema im Bereich. Moderne molekulare Analysemethoden bieten umfassende Informationen über die bakteriellen Vielfalt von solchen Biofilmen. Um Mikrobiota Datenvergleich zu ermöglichen, ist es wichtig, jeden Schritt des Verfahrens für molekulare Datengenerierung zu standardisieren. Dieses Verfahren reicht von klinischen Proben, nächste Generation Sequencing (NGS), Bioinformatic Datenverarbeitung, taxonomische Interpretation. Einer der kritischsten Faktoren hier ist Biofilm Probenahme. Probenahme bei Kindern ist noch schwieriger, insbesondere aufgrund der beengten Platzverhältnisse im subgingivalen Bereichen. Wir konzentrieren uns daher auf die Verwendung von Papierspitzen zur subgingivalen Probenahme. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll zur oralen Biofilm Probenahme der subgingivalen Sulcus, Schleimhaut und Speichel bei Kindern.

In der vorliegenden Publikation wird DNA-Proben für NGS als Beispiel für eine mögliche Anwendung für die kieferorthopädischen Forschung demonstriert. Bakterieller DNA wird direkt aus der Papierproben Punkt gewonnen. Diese DNA kann dann verwendet werden, in Studien der mikrobiellen Zusammensetzung für klinische oder Forschungsfragen (wie in Abbildung 10zusammengefasst).
Moderne molekulare Analysemethoden wie die NGS Methode 454-Pyrosequenzierung geben einen Überblick über die komplette Mikrobiota einer Probe. Die DNA von Tausenden von Bakterien wird gleichzeitig auf verschiedenen phylogenetischen Ebenen identifiziert, über die 16 s rRNA Sequenzunterschiede. Bioinformatic Plattformen müssen generiert werden, als ein Mittel zur Strukturierung in Clustern, die die Informationen aus den großen Datensätzen abgerufen. Statistische Analyse kann dann auf Mikrobiota Datasets angewendet werden.
Insgesamt relative Häufigkeit bestimmter Bakterienarten kann analysiert werden, wie Verschiebungen in der Mikrobiota aufgrund veränderter Lebensbedingungen können. Balkendiagramme (Abbildung 11) und Heatmaps (Abbildung 12) anzeigen die subgingivalen bakterielle Zusammensetzung Phylum Ebene oder auf Auftragsebene. Verschiedenen Personen und Behandlungen können von beschreibenden und schlussfolgernde Statistik verglichen werden. Abbildung 13 zeigt einen Histogramm-Vergleich von zwei Modi der subgingivalen Papierspitze Probenahme auf verschiedenen taxonomischen Ebenen. Tabelle 1 zeigt die Verschiebung im Biofilm Zusammensetzung während einer in-vitro- Studie vergleicht zwei Zeitpunkten (T1 und T3). Statistisch signifikante Veränderungen wurden mit Wilcoxon unterzeichnet-Rank-Test und folgende Bonferroni-Korrektur von 454-Pyrosequenzierung Daten berechnet.
Zu guter Letzt ermöglicht Principal Coordinate Analyse (HKoA) 3D Direktvergleich operative taxonomische Einheit (OTU) Ebene wie in verschiedenen Proben identifiziert. HKoA Grundstücke in Abbildung 14 zeigt Intra - und inter - individuelle Unterschiede der subgingivalen Microbiome in einer Fallserie von fünf Kindern. Abbildung 15 zeigt die Ergebnisse einer kieferorthopädischen Fall-Kontroll-Studie: rosa bis roten Punkte sind die Fälle, hell bis dunkel blauen Punkte sind die Kontrollen, alle aufgenommenen wiederholt über einen Zeitraum von vier Monaten. Ein klares clustering der Fälle nach der kieferorthopädischen Intervention (rote Punkte), stellt eine Verschiebung der Microbiome. Blaue Punkte repräsentieren die Kontrollgruppe sind gleichmäßig verteilt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig1.jpg"> 
Abbildung 1 : Bereiten Sie Papierspitzen standardisierte Länge. Kalibrierten steriler Papierspitzen werden an der ersten Ring-Marke zu standardisieren ihre Länge geschnitten. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig2.jpg"> 
Abbildung 2 : Sterilisation und kostenlose Papierspitzen aus DNA. Standardisierte Papierspitzen werden sterilisiert und UV Bestrahlung in einem sauberen Werkbank. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig3.jpg"> 
Abbildung 3 : Subgingivalen Papier Punkt einfügen. Kalibrierten steriler Papierspitzen werden tangential in der subgingivalen Sulcus eingefügt, bis 4 mm Ring Mark für 20 s.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig4.jpg"> 
Abbildung 4 : Papierspitze in Rohr schneiden. Unmittelbar nach der Probenahme, werden Papierspitzen am dritten Ring Mark (4 mm) in eine sterile und DNA-freie 1,5 mL Fläschchen geschnitten. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig5.jpg"> 
Abbildung 5 : Gebündelt und parallel Probenahme. Zwei Papierspitzen werden gleichzeitig in der subgingivalen Sulcus (A) ein Zahn oder mehrere Papierspitzen in der subgingivalen Furchen von mehreren Zähnen (B) eingefügt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig6.jpg"> 
Abbildung 6 : Schleimhaut Probenahme. Kalibrierten steriler Papierspitzen werden in die Schleimhaut der vestibuläre Falte gelegt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig7.jpg"> 
Abbildung 7 : Speichel Sammlung. Unstimulierte Speichel in ein steriles Becherglas zu spucken. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig8.jpg"> 
Abbildung 8 : Stichprobenplan. Proben können als Single (linke Seite, einen Zahn), zusammengefasst (mehrere zu aller Couleur in einer Ampulle) oder Parallel (blaue Streifen, zwei Papierspitzen an einem Zahn) Proben gesammelt werden. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig9.jpg"> 
Abbildung 9 : Farblich Lagerung. Vorlegende Farbcode für Bettwäsche und Fläschchen erleichtert weiter probieren Handhabung.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig10.jpg"> 
Abbildung 10 : Analyse subgingivaler Biofilm. Schematische Darstellung der klinischen Biofilm Probenahme (A), DNA-Extraktion (B) und verschiedene NGS Technologien (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig11.jpg"> 
Abbildung 11 : Balkendiagramm. Zeigt relative Häufigkeit von Bakterien auf Phylum Ebene mit 454-Pyrosequenzierung analysiert. Bild von Santigli Et Al. geändert 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig11large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig12.jpg"> 
Abbildung 12 : Heatmap. Zeigt relative Häufigkeiten der bakteriellen Bestellungen analysiert mit 454-Pyrosequenzierung. Dunkelblaues Rot steht für eine hohe relative Häufigkeit (&#62; 10 %). Dunkelblau stellt einen sehr geringen keine relative Häufigkeit der jeweiligen bakterielle Bestellung dar. Bild von Santigli Et Al. geändert 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig12large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig13.jpg"> 
Abbildung 13 : Histogramm. Vergleich von zwei Modi des Papiers Punkt Probenahme (Modi A und B) auf verschiedenen taxonomischen Ebenen. Mit 454-Pyrosequenzierung generierte Daten. Bild von Santigli Et Al. geändert 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig13large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig14.jpg"> 
Abbildung 14 : 2D HKoA Plot. Eine Fallserie (n = 5) zeigt intra individuelle und interindividuelle Unterschiede durch zwei subgingivalen Probenahmeverfahren (1 Farbe ist 1 Thema). Mit 454-Pyrosequenzierung generierte Daten. Bild von Santigli Et Al. geändert 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig14large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig15.jpg"> 
Abbildung 15 : Momentaufnahme der HKoA Handlung 3D-Animation. Zeigt subgingivalen Microbiome verschiebt sich in einer kieferorthopädischen Fall-Kontroll-Studie (n = 16; jeder Gruppe, 3 Punkte in der Zeit; Fällen: rosa bis rot, Kontrollen: leichte bis dunkelblau). Mit 454-Pyrosequenzierung generierte Daten.Unveröffentlichte Daten aus Arbeitsgruppe Santigli. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig15large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Taxon: Bakterien</td>
			<td colspan="3">Zeitpunkt 1 [%]</td>
			<td colspan="3">Zeitpunkt 3 [%]</td>
			<td colspan="2">Wilcoxon-unterzeichnet-Rank-test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Phylum/Gattung</td>
			<td>25.</td>
			<td>Median</td>
			<td>75.</td>
			<td>25.</td>
			<td>Median</td>
			<td>75.</td>
			<td>p-Wert</td>
			<td>p-Wert angepasst #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Andere</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Andere</td>
			<td>0.70</td>
			<td>1.07</td>
			<td>1.28</td>
			<td>1.32</td>
			<td>1,63</td>
			<td>1.93</td>
			<td>.000</td>
			<td>.005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Actinobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Actinomyces</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0,06</td>
			<td>0,30</td>
			<td>0,97</td>
			<td>.001</td>
			<td>.021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Rothia</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.05</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0,32</td>
			<td>.001</td>
			<td>.009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bacteroidetes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Prevotella</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0,22</td>
			<td>0,15</td>
			<td>1.02</td>
			<td>2.44</td>
			<td>.000</td>
			<td>.006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Firmicuten</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Andere (Bazillen)</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0,06</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0.10</td>
			<td>.706</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Staphylokokken</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,07</td>
			<td>0,17</td>
			<td>.548</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(Gemellaceae)</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,07</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0,77</td>
			<td>1.24</td>
			<td>.005</td>
			<td>.091</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(Lactobacillales)</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.12</td>
			<td>1.50</td>
			<td>.004</td>
			<td>.073</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Granulicatella</td>
			<td>0,09</td>
			<td>0,23</td>
			<td>0,37</td>
			<td>0.64</td>
			<td>1.59</td>
			<td>2.28</td>
			<td>.000</td>
			<td>.003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Lactobacillus</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.18</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>.700</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Andere (Streptococcaceae)</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.10</td>
			<td>0,19</td>
			<td>.768</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(Streptococcaceae)</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0.10</td>
			<td>0,23</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0,37</td>
			<td>0.69</td>
			<td>.005</td>
			<td>.083</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Streptokokken</td>
			<td>53.42</td>
			<td>61,96</td>
			<td>88.38</td>
			<td>48.44</td>
			<td>60.83</td>
			<td>73.97</td>
			<td>.055</td>
			<td>.930</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Andere (Lachnospiraceae)</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,11</td>
			<td>.003</td>
			<td>.058</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dialister</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>.240</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Veillonella</td>
			<td>3.43</td>
			<td>27.15</td>
			<td>42.78</td>
			<td>6,69</td>
			<td>13,38</td>
			<td>27.05.</td>
			<td>.157</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Proteobakterien</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Haemophilus</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,03</td>
			<td>0,31</td>
			<td>0,84</td>
			<td>2.38</td>
			<td>.000</td>
			<td>.008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="10">#p-Wert Wilcoxon unterzeichnet-Rang-Test angepasst nach Bonferroni-Korrektur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="10">Eine p &#60; 0.0026 galt als bedeutende</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Statistische Analyse. Unterschiede in der mündlichen Microbiome von gesunden Kindern an zwei Punkten in der Zeit. Mit 454-Pyrosequenzierung generierte Daten. Bild von Klug Et Al. geändert 23

Watch this Scientific Journal Video about Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children at JoVE.com

Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children

Änderungen in der mündlichen Microbiome während der gesamten Kindheit sind von wachsendem Interesse. Vergleich der verschiedenen Microbiome Studien zeigt einen Mangel an standardisierten Probenahme Protokolle. Begrenzten Raum macht Probenahme Ton subgingivalen Sulcus von schwierigen Kindern. Papier Punkt Probenahme präsentiert sich hier im Detail als die Methode der Wahl für diesen Bereich.

Oralen Biofilm Sampling für Microbiome Analyse bei gesunden Kindern

Oral biofilm and its molecular analysis provide a basis for investigating various dental research and clinical questions. Knowledge of biofilm composition ...

oral-biofilm-sampling-for-microbiome-analysis-in-healthy-children

Research

JoVE Journal

Medicine

17.0K Aufrufe.  Medical University of Graz. Änderungen in der mündlichen Microbiome während der gesamten Kindheit sind von wachsendem Interesse. Vergleich der verschiedenen Microbiome Studien zeigt einen Mangel an standardisierten Probenahme Protokolle. Begrenzten Raum macht Probenahme Ton subgingivalen Sulcus von schwierigen Kindern. Papier Punkt Probenahme präsentiert sich hier im Detail als die Methode der Wahl für diesen Bereich.

Serie: Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

Ein analytisches Werkzeug-Box für umfassende biochemische, strukturelle und Transkriptom Evaluation of Oral Biofilme von Mutans Streptokokken Mediated

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of them being fluorescence in situ hybridization (FISH).1,2 We performed a pilot study in which oral biofilm samples collected from fixed orthodontic appliances (palatal expanders) were stained by FISH, the objective being to assess the three-dimensional organization of natural biofilm and plaque accumulation.3,4 FISH creates an opportunity to stain cells in their native biofilm environment by the use of fluorescently labeled 16S rRNA-targeting probes.4-7,19 Compared to alternative techniques like immunofluorescent labeling, this is an inexpensive, precise and straightforward labeling technique to investigate different bacterial groups in mixed biofilm consortia.18,20 General probes were used that bind to Eubacteria (EUB338 + EUB338II + EUB338III; hereafter EUBmix),8-10 Firmicutes (LGC354 A-C; hereafter LGCmix),9,10 and Bacteroidetes (Bac303).11 In addition, specific probes binding to Streptococcus mutans (MUT590)12,13 and Porphyromonas gingivalis (POGI)13,14 were used. The extreme hardness of the surface materials involved (stainless steel and acrylic resin) compelled us to find new ways of preparing the biofilm. As these surface materials could not be readily cut with a cryotome, various sampling methods were explored to obtain intact oral biofilm. The most workable of these approaches is presented in this communication. Small flakes of the biofilm-carrying acrylic resin were scraped off with a sterile scalpel, taking care not to damage the biofilm structure. Forceps were used to collect biofilm from the steel surfaces. Once collected, the samples were fixed and placed directly on polysine coated glass slides. FISH was performed directly on these slides with the probes mentioned above. Various FISH protocols were combined and modified to create a new protocol that was easy to handle.5,10,14,15 Subsequently the samples were analyzed by confocal laser scanning microscopy. Well-known configurations3,4,16,17 could be visualized, including mushroom-style formations and clusters of coccoid bacteria pervaded by channels. In addition, the bacterial composition of these typical biofilm structures were analyzed and 2D and 3D images created.

We present a protocol for structural and compositional analysis of natural oral biofilm from orthodontic appliances with in situ hybridization (FISH) and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Oral biofilm samples were collected from palatal expanders, scraping acrylic-resin flakes off their surface and referring them for molecular processing.

Oral Biofilm Analyse Palatal Expander durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung und konfokale Laser Scanning Mikroskopie

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

Medizin

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

Verwendung eines Hochdurchsatz-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Biotechnik

Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, tuberculosis, lung cancer, and liver disease. This protocol describes a reproducible method for sampling breath in children and then stabilizing breath samples for further analysis with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The goal of this method is to establish a standardized protocol for the acquisition of breath samples for further chemical analysis, from children aged 4-15 years. First, breath is sampled using a cardboard mouthpiece attached to a 2-way valve, which is connected to a 3 L bag. Breath analytes are then transferred to a thermal desorption tube and stored at 4-5 &#176;C until analysis. This technique has been previously used to capture breath of children with malaria for successful breath biomarker identification. Subsequently, we have successfully applied this technique to additional pediatric cohorts. The advantage of this method is that it requires minimal cooperation on part of the patient (of particular value in pediatric populations), has a short collection period, does not require trained staff, and can be performed with portable equipment in resource-limited field settings.

This protocol describes a simple method for the acquisition of breath samples from children. Briefly, samples of mixed air are pre-concentrated in sorbent tubes prior to gas chromatography-mass spectrometry analysis. Breath biomarkers of infectious and non-infectious diseases can be identified using this breath collection method.

Atem-Sammlung von Kindern für Krankheit Entdeckung von Biomarkern

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, ...

Chemie

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Nicht-invasive Probenahme von Schleimhaut-Flüssigkeit für die Quantifizierung von In Vivo oberen Atemwegen immun-Mediator-Level

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, periodontitis, mucosal infections and, most notably, early childhood caries. In all of these conditions, the pH in the biofilm matrix impacts microbe-host interactions and thus the disease progression. The present protocol describes a confocal microscopy-based method to monitor pH dynamics inside cross-kingdom biofilms comprising Candida albicans and Streptococcus mutans. The pH-dependent dual-emission spectrum and the staining properties of the ratiometric probe C-SNARF-4 are exploited to determine drops in pH in extracellular areas of the biofilms. Use of pH ratiometry with the probe requires a meticulous choice of imaging parameters, a thorough calibration of the dye, and careful, threshold-based post-processing of the image data. When used correctly, the technique allows for the rapid assessment of extracellular pH in different areas of a biofilm and thus the monitoring of both horizontal and vertical pH gradients over time. While the use of confocal microscopy limits Z-profiling to thin biofilms of 75 &#181;m or less, the use of pH ratiometry is ideally suited for the noninvasive study of an important virulence factor in cross-kingdom biofilms.

The protocol describes the cultivation of cross-kingdom biofilms consisting of Candida albicans and Streptococcus mutans and presents a confocal microscopy-based method for the monitoring of extracellular pH inside these biofilms.

Überwachung des extrazellulären pH-Werts in cross-kingdom Biofilmen mit Konfokalmikroskopie

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low microbial adhesion may reduce the prevalence and progression of peri-implant diseases. In view of the oral environment complexity and oral biofilm heterogeneity, microscopy techniques are needed that can enable a biofilm analysis of the surfaces of teeth and dental materials. This article describes a series of protocols implemented for comparing oral biofilm formation on titanium and ceramic materials for prosthetic abutments, as well as the methods involved in oral biofilms analyses at the morphological and cellular levels. The in situ model to evaluate oral biofilm formation on titanium and zirconia materials for dental prosthesis abutments as described in this study provides a satisfactory preservation of the 48 h biofilm, thereby demonstrating methodological adequacy. Multiphoton microscopy allows the analysis of an area representative of the biofilm formed on the test materials. In addition, the use of fluorophores and the processing of the images using multiphoton microscopy allows the analysis of the bacterial viability in a very heterogeneous population of microorganisms. The preparation of biological specimens for electron microscopy promotes the structural preservation of biofilm, images with good resolution, and no artifacts.

Here, we present a protocol to evaluate oral biofilm formation on titanium and zirconia materials for dental prosthesis abutments, including the analysis of bacterial cells viability and morphological characteristics. An in situ model associated with powerful microscopy techniques is used for the oral biofilm analysis.

Mündliche Biofilmbildung auf unterschiedlichen Materialien für Zahnimplantate

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low ...

Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active compounds from plants are challenging because of the complex plant matrix and time-consuming isolation and identification procedures. Therefore, a stepwise approach for screening natural compounds from plants, including the isolation and identification of potentially active molecules, is presented. It includes the collection of the plant material; preparation and fractionation of crude extracts; chromatography and spectrometry (UHPLC-DAD-HRMS and NMR) approaches for analysis and compounds identification; bioassays (antimicrobial and antibiofilm activities; bacterial &#34;adhesion strength&#34; to the salivary pellicle and initial glucan matrix treated with selected treatments); and data analysis. The model is simple, reproducible, and allows high-throughput screening of multiple compounds, concentrations, and treatment steps can be consistently controlled. The data obtained provide the foundation for future studies, including formulations with the most active extracts and/or fractions, isolation of molecules, modeling molecules to specific targets in microbial cells and biofilms. For example, one target to control cariogenic biofilm is to inhibit the activity of Streptococcus mutans glucosyltransferases that synthesize the extracellular matrix&#8217; glucans. The inhibition of those enzymes prevents the biofilm build-up, decreasing its virulence.

Natural products represent promising starting points for the development of new drugs and therapeutic agents. However, due to the high chemical diversity, finding new therapeutic compounds from plants is a challenging and time-consuming task. We describe a simplified approach to identify antimicrobial and antibiofilm molecules from plant extracts and fractions.

Systematischer Ansatz zur Identifizierung neuartiger antimikrobieller und Antibiofilmmoleküle aus Pflanzenextrakten und -fraktionen zur Vorbeugung von Zahnkaries

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active ...

Biologie

Specimen Collection and Analysis of the Duodenal Microbiome

Shifts in the microbiome have been correlated with the physiology and pathophysiology of many organ systems both in humans and in mouse models. The gut microbiome has been typically studied through fecal specimen collections. The ease of obtaining fecal samples has resulted in many studies that have revealed information concerning the distal luminal gastrointestinal tract. However, few studies have addressed the importance of the microbiome in the proximal gut. Given that the duodenum is a major site for digestion and absorption, its microbiome is relevant to nutrition and liver disease and warrants further investigation. Here we detail a novel method for sampling the proximal luminal and mucosal gut microbiome in human subjects undergoing upper endoscopy by obtaining duodenal aspirate and biopsies. Specimen procurement is facile and unaffected by artifacts such as patient preparatory adherence, as might be the case in obtaining colonic samples during colonoscopy. The preliminary results show that the luminal and mucosal microbiomes differ significantly, which is likely related to environmental conditions and barrier functions. Therefore, a combination of duodenal aspirate and biopsies reveal a more comprehensive picture of the microbiome in the duodenum. Biopsies are obtained from the descending and horizontal segments of the duodenum, which are anatomically close to the liver and biliary tree. This is important in studying the role of bile acid biology and the gut-liver axis in liver disease. Biopsies and aspirate can be used for 16S ribosomal RNA sequencing, metabolomics, and other similar applications.

In this manuscript, we discuss a novel method to sample and analyze the duodenal microbiome. This method provides an accurate depiction of microbial diversity and composition in the duodenum and could be useful for further investigation of the duodenal microbiome.

Shifts in the microbiome have been correlated with the physiology and pathophysiology of many organ systems both in humans and in mouse models. The gut ...