Name: oral biofilm sampling for microbiome analysis in healthy children
Uploaded: 2017-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children at JoVE.com

저자는 요 아 킴 Theussl (의료 연구 센터, 의료 그라츠 대학)에 우수한 기술 지원에 대해 모니카 파렐 (연구 관리, 그라츠의 의학 대학)와 비디오 제작에 음성 재능으로 감사.

프로토콜 및 비디오 촬영은 그라츠의 의학 대학 (Votum 27-126ex14/15)의 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. 이 비디오 게시에 대 한 서 면된 동의 자녀와 그녀의 부모에서 얻은 했다.
1. 기기 및 재료
<ol>
	<li>컷 보정 (ISO 015/02) 고 메 마른 종이 포인트, 그들의 길이 (그림 1)을 표준화 하기 위해 첫 번째 링 마크에 endodontic 치료에 주로 사용 됩니다.</li>
	<li>260에 자외선 빛 방사선 적용 종이 포인트 (그림 2)의 DNA와 RNA 오염을 방지 하기 위하여 30 분 nm.</li>
	<li>고압 튜브 120 ° C와 1.2 저장용 바 20 분 및 UV 비추는 그들 뿐만 또는 고용 준비-사용 감마 방사선 튜브.</li>
</ol>
2입니다. 과목의 준비
참고: 서 면된 동의 자녀와 등록 전에 그녀의 부모에서 얻은 했다.
<ol>
	<li>입술에 코코아 버터를 적용 됩니다.</li>
	<li>뺨을 탑재 하 고 혀를 두 치과 아치에 대 한 전체 액세스에 대 한 견인.</li>
	<li>플 라크 공개와 함께 치과 플 라크를 착 색.</li>
	<li>건조 필드 장치를 제거 합니다.</li>
	<li>물 무색이 될 때까지 물으로 입을 헹 구 십시오.</li>
	<li>브러쉬 철저 하 게 45 ° angulation에서 전기 칫 솔과 치아. 이 구두 biofilm를 변경할 것 이다 아무 치약, 하지만 물을 적용 합니다.</li>
	<li>혀 가드 입 오픈 하 고 건조 유지를 포함 하 여 다시 건조 필드 장치를 탑재 합니다.</li>
	<li>깨끗 하 고 마른 종이 동안 supragingival 액체의 흡수를 피하기 위해 멸 균 면봉으로 인덱스 치아 샘플링 포인트.</li>
</ol>
3. Biofilm 샘플링
<ol>
	<li>Subgingival 고 랑의 포인트 샘플링 종이
	<ol>
		<li>살 균 치과 핀셋으로 종이 포인트를 파악.</li>
		<li>접선 최대 4mm의 정의 된 길이에 종이 포인트를 삽입 합니다. 접합 상피 (그림 3)에 게 충격을 하지 특별 한 주의 분리 했습니다.</li>
		<li>20 후 제거 하는 종이 포인트 s.</li>
		<li>준비 된 튜브에 직접 종이 포인트를 수집: 종이 포인트 팁 직접 살 균 하 고 DNA 유리병에 놓고 4 mm (그림 4)의 표준된 길이를 3 마크에 잘라.</li>
		<li>연구 프로토콜에 지정 된 경우 두 종이 포인트 병렬 및 동시에 같은 사이트 (그림 5A)에 삽입 합니다.</li>
		<li>연구 프로토콜 "풀링된 샘플"에서 요구 하는 경우 또는 여러 사이트에서 종이 포인트 수집 (그림 5B).</li>
		<li>건조 필드 장치 제거 점 막과 침 샘플링.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>점 막 종이 포인트 샘플링
	<ol>
		<li>(그림 6) 위 뺨의 vestibular 배 종이 포인트 적용.</li>
		<li>뺨을 닫고 짧게 마사지 합니다.</li>
		<li>뺨을 열고 20 후 제거 하는 종이 포인트 s.</li>
		<li>3 마크에 종이 포인트를 잘라내어 subgingival 샘플링 된 무 균 튜브에 넣어.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>침 샘플링
	<ol>
		<li>자녀가 소독된 컬렉션 그릇 (그림 7)에 unstimulated 타 액을 뱉 어 봅시다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 전송 및 저장
<ol>
	<li>연구 설계 (그림 8)에 따라 단일, 풀, 또는 병렬 샘플으로 종이 포인트를 수집 합니다.</li>
	<li>샘플 관리 (그림 9)를 더 촉진 하기 위해 색으로 구분 된 스토리지 시스템을 적용 합니다.</li>
	<li>마지막으로, 미생물 분석 중인 −80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자가 과학 비디오 제작에 관련 된 충돌의 관심을 보고.

박테리아는 구강24,,2526내의 모든 사이트에서 발견 된다. 많은 연구27,,2829,30,31, 침 통해 쉽게 샘플링할 수 수로 구두 식민지를 지도 하는 샘플링 매체로 타 액의 사용에 초점을 맞춘합니다 32. 그러나, 침 biofilm subgingival biofilm 구성을 반영 하지 않습니다. 따라서, 다른 샘플링 방법의 사용은 전체 그림을 만들기 위한 매우 중요 하 고 치과 연구에 새로운 토론을 연상 됩니다. 몇 가지 기사 periodontally 질병 과목8,,3334의 subgingival 샘플링에 대 한 curettes 및 종이의 사용을 비교합니다. 아직 아무 연구 그룹은 특히 어린이19에 대 한 서로 다른 연령 그룹에 대 한 표준화 된 샘플링 장치 응용 프로그램에 초점을 맞춘 것 알려져 있다.
이 비디오에서는, 건강 한 아이 들에 있는 3 개의 구두 서식 지의 구두 biofilm 샘플링 제공 됩니다.
수정 및 문제 해결:
원고의 목표는 건강 한 어린이의 subgingival biofilm 샘플링에 대 한 임상 프로토콜에 중점을 둡니다. 방법의 선택 소리 subgingival sulci를 제한 된 공간 만드는 특히 도전 샘플링을 말합니다. 이 비디오에서는 메서드가 영구 치열 초기에 적용 되었습니다. 그것은 또한 혼합 또는 성숙한 치열 하 고 아이 들 또는 성인을 적용할 수 있습니다. 우리의 샘플링 방법을 하나 또는 풀링된 샘플 등 수정 할 수 있습니다. 후자의 건강 한 subgingival 고 랑에서 수집 DNA의 작은 금액으로 인해 분자 분석에 대 한 중요 한 요인이 될 수 있습니다. 인덱스의 선택에; 수정할 수 있습니다. 특히, 다른 치아 상피 충격 때 대신 샘플 및 출혈, 따라서 종이 포인트를 사용할 수 없게 만드는 수 있습니다. 한 사이트에서 동시에 두 개의 종이 포인트를 사용 하 여 병렬 샘플링 샘플 복제 어린이 들을 위한의 자 시간을 단축 하는 것 외에도 한 번에 렌더링 합니다.
약간의 수정으로 병 치 주 주머니를 샘플링할 수 있다. 여기 종이 포인트 최대 10 m m를 도달할 수 있는 주머니의 전체 길이를 삽입 해야 합니다. 길이 삽입의 깊이 뿐만 아니라 종이 포인트 conus 관심의 intraoral 서식 지에 적응 해야 하지만 항상 재료와 크기에 의해 표준화 되어야 한다. 샘플은 또한 종이 포인트를 사용 하 여 점 막에서 반입할 수 있습니다. 동일한 프로토콜 다른 구두 서식 지와 다양 한 치과 재료의 비교를 허용 한다. 환자 준비 및 샘플 저장이이 비디오에 설명 된 대로 수행할 수 있습니다. Metatranscriptome 연구에 대 한 RNA 같은 방법으로 샘플링 될 수 있습니다. 따라서, 샘플링, 후 종이 포인트는 RNA 안정화 솔루션에 직접 삽입 해야 합니다.
기술의 한계:
수정에 설명 임상 샘플링 방법 사운드 subgingival 고 랑으로 제한 됩니다. 예 periodontally 병 주머니에 관해서는 다른 샘플링 사이트의 우리의 연구 설계 되지 않았습니다. 이러한 주머니의 전체 깊이를 샘플링을 필요에 따라 종이 포인트 충분히 샘플을 수집 하기에 충분 하지 않을 수 있습니다. 실험 목표 하는 경우 사운드 subgingival sulci 및 periodontally 병 주머니에서 샘플링 한 데이터를 비교, 그것은 다른 임상 샘플링 방법와 연결 된 고유한 바이어스에 자각 하는 것이 중요. 그것은 따라서 이러한 데이터를 비교 하는 것이 좋습니다입니다.
여기에 제시 된 방법의 한계는 propidium monoazide의 후속 사용 없이 샘플링 됩니다. 샘플링 후 직접이 에이전트를 추가 분석 하는 biofilm에서 살아있는 세포만의 특정 분석에 대 한 수 있습니다. 여기 설명 하는 샘플링 방법을 생활과 죽은 세포의 수를 반영 합니다. 심한 치 주 염의 연구, 종이 포인트 깊은 주머니에 biofilm 형성은 강력한 아마 curettes, 교체 필요 합니다. 종이 포인트 샘플링 그들의 표면으로 이러한 경우에, 전체 미생물 스펙트럼을 반영 하지 않을 수도 있습니다 너무 빨리 포화 될 수 있습니다.
기존의 방법에 관하여 의미:
제안 된 원고 종이 포인트와 함께 건강 한 고 랑에 subgingival 샘플링을 표준화 하는 그것의 종류의 첫번째 이다. 다른 보고서는 금속 curettes35,36 의 사용 또는 종이 37,,3839, 가리키지만 샘플링, 이전 수행 하는 프로세스를 설명 하지 않았다 등 플 라크 컨트롤로 치아 치아 격리, 청소 및 건조, 샘플링 기술과 시간 라인에 부적당 한 사양에서 발생 하는 프로세스 뿐만 아니라.
두 이전 기사에서 우리는 종이 포인트를 사용 하 여 어린이22,40subgingival biofilm 샘플링에 대 한 재현 방법입니다 보여줍니다. 때문에 그들의 디자인, curettes는 제한 된 공간 얕은 고 랑에 대 한 너무 크고 너무 부드러운 접합 상피에 대 한 날카로운. 그것은 subgingival 고 랑 상피 traumatizing 없이 액세스할 수 중요 합니다. 이 방법에서는, 바이어스 출혈에서 발생 하는 피 한다. 따라서, 슬림 하 고 부드러운 종이 포인트의 사용은이 지역에 대 한 선호. 종이 포인트 교정 치료21,41동안 biofilm 구성 변경 사항을 모니터링 하는 기능입니다. 그들은 슬림 하 고 고정 교정 기기 요소 사이 맞게 충분히 유연입니다. 이것은 curettes 같은 다른 샘플링 방법에 중요 한 이점은 이다. Atraumatic 샘플링 간소화 하 고 DNA의 적은 양의 샘플링 가능 하다.
미래의 응용 프로그램:
이 비디오에서 우리는 비 병에 걸리는, 초기, 영구 치열에 메서드 시연. 그것은 또한 혼합 또는 성숙한 치열에 적용할 수 있습니다. 일부 각 색 같은 프로토콜에 따라 치아 나 임 플 란 트 및 치과 재료 때문 다른 틈새 같은 periodontally 질병 사이트 샘플 가능 하다. 카 리에 스 연구는 뿌리 카 리에 스에 대 한 특정 연구에이 표준화 된 프로토콜에서 유익할 수 있었다. 데이터 비교, 아무리 무엇을 하 고 샘플을 측정 하는 방법을 수 있도록 프로토콜의 표준화는 우리의 샘플링 비디오에서 가장 중요 한 강의입니다.미래의 비디오 데모의 일반적 임상 샘플링 필드 향상 시킬 수 있습니다.
비디오와 같이 얻은 구두 biofilm 과학적 조사에 대 한 클리닉에 사용 됩니다. Vivo에서 이렇게 형광 제자리에서 교 잡, confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법15등 생체 외에서 분자 기법에 대 한 좋은 추가 나타냅니다. NGS 방법, 그림과, pyrosequencing로 전체 microbiota의 분석 수 수집된 biofilm에 적용. 또는 치료를 지 원하는 다른 환자 또는 다른 처리를 비교 하 여 특정 세균성 종 상대 나타났는데 계산을 사용할 수 있습니다. 표준화 된 시퀀싱 프로토콜 및 시퀀스 분석 워크플로 함께 우리는 이전40설명,이 샘플링 방법 속 수준 시퀀스 분석을 수 있습니다. "메타" 추가-연구가이 비디오에 제시 샘플링 프로토콜에 기반 하는 metatranscriptomic 또는 metabolomic 수 있습니다.
중요 한 단계:
중요 한 단계는 오염 방지: 무 균 악기 비 살 균 비보에 환경에 적용할 수 있다. 벤치에는 입에서 전송 가능한 연구 참여자에 대 한의 자 시간을 유지 하는 경험 있는 심사 관에 의해 신속 하 고 안전 하 게 수행할 수 있다. 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 subgingival 고 랑에 종이 포인트의 atraumatic 삽입입니다. 접합 상피 및 절대적으로 출혈의 방해를 피할 수 있다. 추가 관리 종이 포인트 및 스토리지 튜브 외 인 DNA 또는 RNA를 오염 하지 위해서는 주의가 있다. 스토리지 자체 다음 또한 중요 한 단계 이다. 샘플은 −80 ° c.에서 직접, 기껏해야 얼 필요가 이 시퀀싱 결과 위조 것 세균성 구성 게시물 샘플링에 변화를 방지 합니다.

인간의 구강 biofilm 공생의 유익한 미생물1,,23주로 구성 된 광범위 한 지역 사회를 함유 한다. 여기 종 식민지 모든 틈새는 구강4,,56을 제공 하는 것. 이러한 틈새에서 Biofilm 구성으로 서식 지로 널리 다릅니다. 타 액은 예 패 샘플 보다 다른 세균 프로필을 표시합니다. 건강 한 성인의 패 샘플, Actinobacteria 의 상대 풍부한에서는 이상 20%, 7% 미만 타 액에서 발견 되는 동안입니다. Bacteroidetes 및 Firmicutes 반면 타 액7에 훨씬 더 높은 숫자에 표시 됩니다. 따라서, 전체 그림을 얻기 위하여 입에서 서로 다른 위치에 샘플을 중요 하다. 또한, 지리적, 민족적인 차이, 나이, 성별, 그리고 다른 많은 요인 등 다양 한 요인을 확인 biofilm 개발 및 질병 발병8,9에 대 한 일반적인 규칙을 식별 하기가 어렵습니다. 몇 년 동안 periopathogenic 및 cariogenic biofilm의 조사는 중앙 우려8,10,11,,1213되었습니다.
최근 몇 년 동안, 건강 한 과목에 대 한 연구 뿐만 아니라 질병의 광범위 한 이해 뿐만 아니라 예방 조치14의 구현에 대 한 중요성을 얻고 있다. 새로운 기술 및 분자 분석 또한 구두 biofilm 형성 및 기능15,16, 명료 하 고 미생물 다양성17,18의 완전 한 프로 파일링을 활성화 합니다. 이 또한 교정 치료19동안 미생물 변화의 새로운 이해로 이어질 예정 이다. 교정 생체 재료의 개발에 영향 예측 이다. 향상 된 관점 biofilm에 나 멜 demineralization 등 치 주 질환12,,2021와 관련 된 교정 치료의 합병증에 새로운 빛 창 고 것입니다. 전세계 데이터 비교를 허용 하려면 데이터 생성에서 모든 단계를 표준화 하기 결정적 이다. 실험실 절차에 사소한 변화 강력 하 게 결과 좌우할 수 있다. 또한, 다양 한 데이터 처리에 컴퓨터 플랫폼의 사용 비 비교 데이터 집합 발생할 수 있습니다. 마지막으로, 통계적 테스트 및 교정의 결과에 영향이 있다. 그러나, 이미 오래 전에 어떤 실험실 작업 발생 수 샘플링 바이어스 또는 개시 바이오 컴퓨팅. 비 표준화 된 샘플링 메서드는 본질적으로 편 파 연구 이어질. 표준화 관련 연구에서의 적당 한 수준 낮은, 보기 작은 증거 교정 및 microbiomes19사이의 관계에 존재합니다. 따라서, 표준화 된 방법의 개발 용이 하 게 하는 필드에 데이터의 자격된 비교 것입니다.
이 문서는 표준화 된 구강 biofilm 샘플링 절차를 선물 한다. 프로토콜은 세계적으로 대 등 한 미생물 시퀀스 데이터 컬렉션을 생성 하는 쪽으로 기여 하는 위한 것입니다. 건강 한 아이 들에 있는 구두 biofilm 샘플링에 대 한 단계별 프로토콜 제공 됩니다. 선택 하는 방법으로 종이 포인트 삽입된 들은 사운드 subgingival 고 랑에는. 서식 지 비교를 촉진 하기 위하여 뺨 점 막 같은 프로토콜에 따라 샘플링 됩니다. 이 문서는 또한 병렬 및 풀링된 샘플링을 보여 줍니다. 또한, 침 샘플링 표시 됩니다. 간단한 색 전송 및 스토리지 시스템도 추가 처리를 위해 표본 관리를 용이 하 게 제공 됩니다. 저장 매체, metagenomic 분석과 생물 정보학에 관한 다운스트림 작업의 임상 질문 구두 연구에 다른 분야에 의해 제기에 따라 달라 집니다. 이 원고에서 NGS의 DNA 샘플링 교정 연구 가능한 응용 프로그램의 예제로 선정 되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Paper Points Taper .02, sterilised</td><td>VDW Dental</td><td>550 029 015</td><td>http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&amp;amp;cHash=&lt;br/&gt; 1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2</td></tr><tr><td>GC Cocoa Butter, Tube of 10 g</td><td>GC EUROPE N.V.</td><td>000387</td><td>http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22</td></tr><tr><td>Rondells blue</td><td>DIRECTA AB</td><td>Rondell Tablets</td><td>http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767</td></tr><tr><td>Great Lakes Nola Dry Field System</td><td>Great Lakes Ortho</td><td>300-401</td><td>http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626</td></tr><tr><td>tooth brush</td><td>Oral-B</td><td></td><td>http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro</td></tr><tr><td>micro-Ident plus11</td><td>Hain Lifescience GmbH</td><td>23312</td><td>http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html</td></tr><tr><td>ParoCheck</td><td>Greiner Bio One International GmbH</td><td>460020</td><td>https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/</td></tr><tr><td>Carpegen Perio Diagnostik</td><td>Carpegen GmbH</td><td></td><td>http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html</td></tr><tr><td>tubes Reaktionsgef&amp;auml;&amp;szlig;e 1,5 ml</td><td>Lactan</td><td>CH77.1&amp;nbsp; to CH81.1</td><td>www.lactan</td></tr><tr><td>cotton swabs</td><td>Henry Schein</td><td>9003182</td><td>www.henryschein.at</td></tr></tbody></table>

oral biofilm sampling for microbiome analysis in healthy children

구두 biofilm 및 분자 분석 조사 하는 다양 한 치과 연구와 임상 질문에 대 한 기초를 제공 합니다. Biofilm 구성의 기술 cariogenic와 periopathogenic 메커니즘의 더 나은 이해에 지도 한다. 미생물 변화는 구강에서 어린 시절 동안 관심의 여러 가지 이유로 있습니다. 아동 구두 microbiota와 그것의 구성의 변화에의 진화 이해 하 고 질병의 발병을 예방할 가능성이 더 분석할 필요가 있다. 같은 시간에 구두 biofilm의 천연 성분의 고급 지식이 필요 합니다. 건강 한 잇 몸 가진 카 리에 스 프리 영구 치열의 초기 단계는 널리 영향을 받지 않는 subgingival 구강 건강 및 질병의 특징을 공부에 대 한 현장에서 기준으로 사용할 수 있는 서식 지를 제공 합니다. 인생에서 다른 단계 동안 어린이 구강 biofilm의 분석은 따라서 분야에서 중요 한 테마 이다. 현대 분자 분석 방법 같은 biofilms의 세균성 다양성에 대 한 포괄적인 정보를 제공할 수 있습니다. Microbiota 데이터 비교를 사용 하려면 그것은 분자 데이터 생성 과정의 각 단계를 표준화 하는 것이 중요입니다. 이 절차는 분류학 해석에 임상 샘플링, 다음 세대 시퀀싱 (NGS), bioinformatic 데이터 처리에서 걸쳐. 여기에 가장 중요 한 요소 중 하나는 biofilm 샘플링입니다. 아이 들에 있는 샘플링은 subgingival 지역에서 제한 된 공간 때문에 특히 더 많은 도전. 우리는 따라서 subgingival 샘플링에 대 한 종이 포인트의 사용에 집중 한다. 이 문서는 subgingival 고 랑, 점 막, 그리고 아이 들에 있는 타 액의 구강 biofilm 샘플링에 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

현재 발행물에서 NGS의 DNA 샘플링은 교정 연구 가능한 응용 프로그램의 예를 들어 설명 했다. 세균성 DNA는 종이 포인트 샘플에서 직접 추출 됩니다. 이 DNA에 대 한 미생물 구성의 연구에 사용할 수 있습니다 임상 질문 ( 그림10에서) 요약를 연구 또는.
NGS 방법 454-pyrosequencing 같은 현대 분자 분석 방법 샘플의 완전 한 microbiota에 대 한 개요를 제공합니다. 박테리아의 수천의 DNA 식별 동시에 서로 다른 계통 발생 수준에서는 16 이상 rRNA 순서 차이. Bioinformatic 플랫폼 정보 큰 데이터 집합에서 검색 된 클러스터로 구축 하는 수단으로 생성 될 필요가 있다. 통계 분석은 다음 microbiota 데이터 집합에 적용할 수 있습니다.
서식 지 조건 변경 인해 microbiota에 교대를 할 수 있는 특정 세균 종의 전반적으로 관계 되는 풍부를 분석할 수 있습니다. 가로 막대형 차트 (그림 11) 및 heatmaps (그림 12) 주문 수준 또는 문 수준에서 subgingival 세균성 구성을 표시 됩니다. 다양 한 개인 및 치료 설명 및 날개 식 통계에 의해 비교할 수 있습니다. 그림 13 subgingival 종이 포인트 서로 다른 분류학 수준에서 샘플링의 두 가지 모드의 히스토그램 비교를 제공 합니다. 표 1 은 생체 외에서 연구를 비교 하는 두 시간 포인트 (T1 및 T3) 동안 biofilm 구성에 변화를 보여준다. 통계적으로 유의 한 변화는 Wilcoxon 서명 순위 테스트와 454-pyrosequencing 데이터에서 다음 Bonferroni 보정 계산 했다.
마지막으로, 주 좌표 분석 (PCoA)로 다른 샘플에서 확인 된 조작 상 분류학 단위 (OTU) 수준에서 직접 3D 비교 수 있습니다. 그림 14에서 PCoA 플롯 5 어린이의 케이스 시리즈에서 subgingival 미생물의 내부와 통해 개인 차이 표시합니다. 그림 15 는 교정 사례 제어 연구의 결과 보여줍니다: 분홍색 빨간 점 경우, 빛이 어두운 파란색 점들은 컨트롤, 4 개월의 기간 동안 반복 해 서 모든 샘플된. (빨간 점) 교정 개입 후의 경우 분명 클러스터링은 미생물에 변화가 나타냅니다. 컨트롤 그룹을 나타내는 파란색 점 균등 하 게 배포 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig1.jpg"> 
그림 1 : 표준된 길이의 종이 포인트 준비. 살 균 된 종이 포인트 그들의 길이 표준화 하기 위한 첫 번째 링 마크에서 잘립니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig2.jpg"> 
그림 2 : Sterilize 및 DNA에서 무료 포인트. 표준화 된 종이 포인트는 소독 하 고 깨끗 한 벤치에 UV 방사선. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig3.jpg"> 
그림 3 : Subgingival 종이 포인트 삽입. 살 균 된 종이 포인트 20 4 m m 링 마크까지 subgingival 고 랑에 접선 삽입 됩니다 s.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig4.jpg"> 
그림 4 : 종이 포인트 튜브로 절단. 직접 샘플링, 후 종이 포인트 3 링 마크 (4mm)에 살 균 및 DNA-무료 1.5 mL 유리병에 잘라. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig5.jpg"> 
그림 5 : 풀링된 및 병렬 샘플링. 두 종이 포인트는 하나의 치아 (A) 또는 여러 치아 (B)의 subgingival sulci로 여러 종이 포인트의 subgingival 고 랑에 동시에 삽입 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig6.jpg"> 
그림 6 : 점 막 샘플링. 살 균 된 종이 포인트는 vestibular의 점 막에 누워 있습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig7.jpg"> 
그림 7 : 타 액 컬렉션. Unstimulated 타 액 살 균 비 커에 침을 이다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig8.jpg"> 
그림 8 : 샘플링 계획. 단일 (왼쪽, 1 개의 치아), 풀링 (여러 한 유리병에 모든 줄무늬), 또는 병렬 (블루 줄무늬, 하나의 치아에 두 종이 포인트) 샘플 샘플을 수집할 수 있습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig9.jpg"> 
그림 9 : 스토리지 색. 추천 색상 코드 시트와 튜브를 용이 하 게 위한 추가 처리 샘플.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig10.jpg"> 
그림 10 : Subgingival biofilm 분석. 임상 biofilm 샘플링 (A), DNA 추출 (B), 및 다른 NGS 기술 (C)의 도식 프리젠테이션. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig10large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig11.jpg"> 
그림 11 : 바 차트. 보기 454-pyrosequencing를 사용 하 여 분석 하는 문 수준에서 박테리아의 관계 되는 풍부. Santigli 그 외 여러분 에서 수정 이미지 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig11large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig12.jpg"> 
그림 12 : Heatmap. 보기 세균성 명령 사용 하 여 분석의 상대적 나타났는데 454-pyrosequencing. 진한 빨간색 높은 관계 되는 풍부를 나타냅니다 (&#62; 10%). 진한 파란색 각각 세균 순서의 아무 상대적 풍요에는 매우 낮은 나타냅니다. Santigli 그 외 여러분 에서 수정 이미지 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig12large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig13.jpg"> 
그림 13 : 히스토그램. 종이의 두 가지 모드의 비교 포인트 샘플링 (A와 B 모드) 다른 분류학 수준에. 454 pyrosequencing로 생성 된 데이터입니다. Santigli 그 외 여러분 에서 수정 이미지 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig13large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig14.jpg"> 
그림 14 : 2D PCoA 음모. 케이스 시리즈 (n = 5) (1 개의 색깔은 1 주제) 두 subgingival 샘플링 방법 결과로 내 개인과 개인 간 차이 보여주는. 454 pyrosequencing로 생성 된 데이터입니다. Santigli 그 외 여러분 에서 수정 이미지 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig14large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig15.jpg"> 
그림 15 : 3D PCoA 작 애니메이션의 스냅숏. 표시 subgingival 미생물 이동 교정 케이스 컨트롤 연구에서 (n = 16, 각 그룹, 시간;에 3 포인트 경우: 분홍색 빨간색, 컨트롤: 진한 파란색 빛). 454 pyrosequencing로 생성 된 데이터입니다.작업 그룹 Santigli에서에서 게시 되지 않은 데이터입니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig15large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Taxon: Bacteriae</td>
			<td colspan="3">시간 포인트 1 [%]</td>
			<td colspan="3">시간 포인트 3 [%]</td>
			<td colspan="2">Wilcoxon 서명 순위 테스트</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">문/속</td>
			<td>25</td>
			<td>중간</td>
			<td>75</td>
			<td>25</td>
			<td>중간</td>
			<td>75</td>
			<td>p-값</td>
			<td>p-값 조정 #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">다른</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">다른</td>
			<td>0.70</td>
			<td>1.07</td>
			<td>1.28</td>
			<td>1.32</td>
			<td>1.63</td>
			<td>1.93</td>
			<td>.000</td>
			<td>.005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Actinobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">放</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.30</td>
			<td>0.97</td>
			<td>.001</td>
			<td>.021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Rothia</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.05</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.32</td>
			<td>.001</td>
			<td>.009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bacteroidetes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Prevotella</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.22</td>
			<td>0.15</td>
			<td>1.02</td>
			<td>2.44</td>
			<td>.000</td>
			<td>.006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Firmicutes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">다른 (이십시오)</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.10</td>
			<td>.706</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">포도 상 구</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.07</td>
			<td>0.17</td>
			<td>.548</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(Gemellaceae)</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.07</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.77</td>
			<td>1.24</td>
			<td>.005</td>
			<td>.091</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(Lactobacillales)</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.12</td>
			<td>1.50</td>
			<td>.004</td>
			<td>.073</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Granulicatella</td>
			<td>0.09</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.64</td>
			<td>1.59</td>
			<td>2.28</td>
			<td>.000</td>
			<td>.003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">유산 균</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.18</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>.700</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">기타 (Streptococcaceae)</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.10</td>
			<td>0.19</td>
			<td>.768</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(Streptococcaceae)</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.10</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.69</td>
			<td>.005</td>
			<td>.083</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">연쇄 상 구 균</td>
			<td>53.42</td>
			<td>61.96</td>
			<td>88.38</td>
			<td>48.44</td>
			<td>60.83</td>
			<td>73.97</td>
			<td>.055</td>
			<td>.930</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">기타 (Lachnospiraceae)</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.11</td>
			<td>.003</td>
			<td>.058</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dialister</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>.240</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Veillonella</td>
			<td>3.43</td>
			<td>27.15</td>
			<td>42.78</td>
			<td>6.69</td>
			<td>13.38</td>
			<td>27.05</td>
			<td>.157</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Proteobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Haemophilus</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.03</td>
			<td>0.31</td>
			<td>0.84</td>
			<td>2.38</td>
			<td>.000</td>
			<td>.008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="10">#p-값 Wilcoxon 서명 순위 테스트 조정 따라 Bonferroni 보정</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="10">P &#60; 0.0026 중요 하 게 고려 되었다</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 통계 분석. 시간에 두 지점에서 건강 한 어린이의 구강 미생물에 차이. 454 pyrosequencing로 생성 된 데이터입니다. Klug 외 에서 수정 이미지 23

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Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children

어린 시절 내내 구강 미생물에 변화는 성장 하는 관심사의 이다. 다른 미생물 연구의 비교는 표준화 된 샘플링 프로토콜의 부족을 보여준다. 제한 된 공간 샘플링 어려운 이들의 사운드 subgingival 고 랑을 만든다. 종이 포인트 샘플링은이 지역에 대 한 선택의 방법으로 자세히 여기 표시 됩니다.

건강 한 아이에서 미생물 분석을 위한 구두 Biofilm 샘플링

Oral biofilm and its molecular analysis provide a basis for investigating various dental research and clinical questions. Knowledge of biofilm composition ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

17.0K 조회수.  Medical University of Graz. 어린 시절 내내 구강 미생물에 변화는 성장 하는 관심사의 이다. 다른 미생물 연구의 비교는 표준화 된 샘플링 프로토콜의 부족을 보여준다. 제한 된 공간 샘플링 어려운 이들의 사운드 subgingival 고 랑을 만든다. 종이 포인트 샘플링은이 지역에 대 한 선택의 방법으로 자세히 여기 표시 됩니다.

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An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

구강 Biofilms의 종합, 생물 구조 및 Transcriptome 평가를위한 분석 도구 - 상자가 Mutans Streptococci의 중재

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

연구

면역학 및 감염병학

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of them being fluorescence in situ hybridization (FISH).1,2 We performed a pilot study in which oral biofilm samples collected from fixed orthodontic appliances (palatal expanders) were stained by FISH, the objective being to assess the three-dimensional organization of natural biofilm and plaque accumulation.3,4 FISH creates an opportunity to stain cells in their native biofilm environment by the use of fluorescently labeled 16S rRNA-targeting probes.4-7,19 Compared to alternative techniques like immunofluorescent labeling, this is an inexpensive, precise and straightforward labeling technique to investigate different bacterial groups in mixed biofilm consortia.18,20 General probes were used that bind to Eubacteria (EUB338 + EUB338II + EUB338III; hereafter EUBmix),8-10 Firmicutes (LGC354 A-C; hereafter LGCmix),9,10 and Bacteroidetes (Bac303).11 In addition, specific probes binding to Streptococcus mutans (MUT590)12,13 and Porphyromonas gingivalis (POGI)13,14 were used. The extreme hardness of the surface materials involved (stainless steel and acrylic resin) compelled us to find new ways of preparing the biofilm. As these surface materials could not be readily cut with a cryotome, various sampling methods were explored to obtain intact oral biofilm. The most workable of these approaches is presented in this communication. Small flakes of the biofilm-carrying acrylic resin were scraped off with a sterile scalpel, taking care not to damage the biofilm structure. Forceps were used to collect biofilm from the steel surfaces. Once collected, the samples were fixed and placed directly on polysine coated glass slides. FISH was performed directly on these slides with the probes mentioned above. Various FISH protocols were combined and modified to create a new protocol that was easy to handle.5,10,14,15 Subsequently the samples were analyzed by confocal laser scanning microscopy. Well-known configurations3,4,16,17 could be visualized, including mushroom-style formations and clusters of coccoid bacteria pervaded by channels. In addition, the bacterial composition of these typical biofilm structures were analyzed and 2D and 3D images created.

We present a protocol for structural and compositional analysis of natural oral biofilm from orthodontic appliances with in situ hybridization (FISH) and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Oral biofilm samples were collected from palatal expanders, scraping acrylic-resin flakes off their surface and referring them for molecular processing.

형광에 원위치 하이브리드화 및 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 맛이 좋은 확장기의 사정 Biofilm 분석

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

의학

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

높은 처리량의 사용<em&gt; 체외</em&gt; 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

생체공학

Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, tuberculosis, lung cancer, and liver disease. This protocol describes a reproducible method for sampling breath in children and then stabilizing breath samples for further analysis with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The goal of this method is to establish a standardized protocol for the acquisition of breath samples for further chemical analysis, from children aged 4-15 years. First, breath is sampled using a cardboard mouthpiece attached to a 2-way valve, which is connected to a 3 L bag. Breath analytes are then transferred to a thermal desorption tube and stored at 4-5 &#176;C until analysis. This technique has been previously used to capture breath of children with malaria for successful breath biomarker identification. Subsequently, we have successfully applied this technique to additional pediatric cohorts. The advantage of this method is that it requires minimal cooperation on part of the patient (of particular value in pediatric populations), has a short collection period, does not require trained staff, and can be performed with portable equipment in resource-limited field settings.

This protocol describes a simple method for the acquisition of breath samples from children. Briefly, samples of mixed air are pre-concentrated in sorbent tubes prior to gas chromatography-mass spectrometry analysis. Breath biomarkers of infectious and non-infectious diseases can be identified using this breath collection method.

아이 들 질병 바이오 마커 발견에서 호흡 컬렉션

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, ...

화학

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

상부 기도 면역 중재자 수준 Vivo에서 의 정량화에 대 한 점 막 안 대기의 비 침범 성 샘플링

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, periodontitis, mucosal infections and, most notably, early childhood caries. In all of these conditions, the pH in the biofilm matrix impacts microbe-host interactions and thus the disease progression. The present protocol describes a confocal microscopy-based method to monitor pH dynamics inside cross-kingdom biofilms comprising Candida albicans and Streptococcus mutans. The pH-dependent dual-emission spectrum and the staining properties of the ratiometric probe C-SNARF-4 are exploited to determine drops in pH in extracellular areas of the biofilms. Use of pH ratiometry with the probe requires a meticulous choice of imaging parameters, a thorough calibration of the dye, and careful, threshold-based post-processing of the image data. When used correctly, the technique allows for the rapid assessment of extracellular pH in different areas of a biofilm and thus the monitoring of both horizontal and vertical pH gradients over time. While the use of confocal microscopy limits Z-profiling to thin biofilms of 75 &#181;m or less, the use of pH ratiometry is ideally suited for the noninvasive study of an important virulence factor in cross-kingdom biofilms.

The protocol describes the cultivation of cross-kingdom biofilms consisting of Candida albicans and Streptococcus mutans and presents a confocal microscopy-based method for the monitoring of extracellular pH inside these biofilms.

공초점 현미경을 사용하여 크로스 킹덤 생물막에서 세포 외 pH 모니터링

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low microbial adhesion may reduce the prevalence and progression of peri-implant diseases. In view of the oral environment complexity and oral biofilm heterogeneity, microscopy techniques are needed that can enable a biofilm analysis of the surfaces of teeth and dental materials. This article describes a series of protocols implemented for comparing oral biofilm formation on titanium and ceramic materials for prosthetic abutments, as well as the methods involved in oral biofilms analyses at the morphological and cellular levels. The in situ model to evaluate oral biofilm formation on titanium and zirconia materials for dental prosthesis abutments as described in this study provides a satisfactory preservation of the 48 h biofilm, thereby demonstrating methodological adequacy. Multiphoton microscopy allows the analysis of an area representative of the biofilm formed on the test materials. In addition, the use of fluorophores and the processing of the images using multiphoton microscopy allows the analysis of the bacterial viability in a very heterogeneous population of microorganisms. The preparation of biological specimens for electron microscopy promotes the structural preservation of biofilm, images with good resolution, and no artifacts.

Here, we present a protocol to evaluate oral biofilm formation on titanium and zirconia materials for dental prosthesis abutments, including the analysis of bacterial cells viability and morphological characteristics. An in situ model associated with powerful microscopy techniques is used for the oral biofilm analysis.

치과 임 플 란 트에 대 한 다른 자료에 구두 Biofilm 형성

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low ...

Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active compounds from plants are challenging because of the complex plant matrix and time-consuming isolation and identification procedures. Therefore, a stepwise approach for screening natural compounds from plants, including the isolation and identification of potentially active molecules, is presented. It includes the collection of the plant material; preparation and fractionation of crude extracts; chromatography and spectrometry (UHPLC-DAD-HRMS and NMR) approaches for analysis and compounds identification; bioassays (antimicrobial and antibiofilm activities; bacterial &#34;adhesion strength&#34; to the salivary pellicle and initial glucan matrix treated with selected treatments); and data analysis. The model is simple, reproducible, and allows high-throughput screening of multiple compounds, concentrations, and treatment steps can be consistently controlled. The data obtained provide the foundation for future studies, including formulations with the most active extracts and/or fractions, isolation of molecules, modeling molecules to specific targets in microbial cells and biofilms. For example, one target to control cariogenic biofilm is to inhibit the activity of Streptococcus mutans glucosyltransferases that synthesize the extracellular matrix&#8217; glucans. The inhibition of those enzymes prevents the biofilm build-up, decreasing its virulence.

Natural products represent promising starting points for the development of new drugs and therapeutic agents. However, due to the high chemical diversity, finding new therapeutic compounds from plants is a challenging and time-consuming task. We describe a simplified approach to identify antimicrobial and antibiofilm molecules from plant extracts and fractions.

식물의 추출물과 분획에서 새로운 항균 및 항바이오필름 분자를 식별하여 치과 용 충치를 방지하기 위한 체계적인 접근법

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active ...

생물학

Specimen Collection and Analysis of the Duodenal Microbiome

Shifts in the microbiome have been correlated with the physiology and pathophysiology of many organ systems both in humans and in mouse models. The gut microbiome has been typically studied through fecal specimen collections. The ease of obtaining fecal samples has resulted in many studies that have revealed information concerning the distal luminal gastrointestinal tract. However, few studies have addressed the importance of the microbiome in the proximal gut. Given that the duodenum is a major site for digestion and absorption, its microbiome is relevant to nutrition and liver disease and warrants further investigation. Here we detail a novel method for sampling the proximal luminal and mucosal gut microbiome in human subjects undergoing upper endoscopy by obtaining duodenal aspirate and biopsies. Specimen procurement is facile and unaffected by artifacts such as patient preparatory adherence, as might be the case in obtaining colonic samples during colonoscopy. The preliminary results show that the luminal and mucosal microbiomes differ significantly, which is likely related to environmental conditions and barrier functions. Therefore, a combination of duodenal aspirate and biopsies reveal a more comprehensive picture of the microbiome in the duodenum. Biopsies are obtained from the descending and horizontal segments of the duodenum, which are anatomically close to the liver and biliary tree. This is important in studying the role of bile acid biology and the gut-liver axis in liver disease. Biopsies and aspirate can be used for 16S ribosomal RNA sequencing, metabolomics, and other similar applications.

In this manuscript, we discuss a novel method to sample and analyze the duodenal microbiome. This method provides an accurate depiction of microbial diversity and composition in the duodenum and could be useful for further investigation of the duodenal microbiome.

Shifts in the microbiome have been correlated with the physiology and pathophysiology of many organ systems both in humans and in mouse models. The gut ...