Wir sind dankbar, dass Leonie de Boer und Bas Zaat (Academic Medical Centre) für die Bereitstellung der S. epidermidis O-47-Stamm. Wir danken Rico Bongaarts, Francis Smet und Angela Comas (Union Biometrica) um Hilfe und Rat mit der COPAS XL und VAST BioImager Analyse. Wir danken Davy de Witt, Ulrike Nehrdich und Laura van Hulst für Fische Hausmeister und andere Kollegen von der Universität Leiden für hilfreiche Diskussionen. Diese Forschung ist Teil der Projekt P5.03 IBIZA des Forschungsprogramms des Instituts biomedizinischen Materialien, die vom niederländischen Wirtschaftsministerium mitfinanziert, und der Smart-Mix-Programm (NWOA_6QY9BM) des niederländischen Ministeriums für Wirtschaft und des Das niederländische Ministerium für Bildung, Kultur und Wissenschaft. Zusätzliche Unterstützung wurde von dem EU-Projekt ZF-Health (FP7-Health-2009-242048) erhalten, und RMJ wurde von Marie-Curie-Stipendium als erfahrener Forscher in der EU Initial Training Network FishForPharma (PITN-GA-201 unterstützt1-289209). SJR mit Mitteln aus der Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking unter Finanzhilfevereinbarung Nr. 115337, Ressourcen, von denen die finanzielle Beteiligung Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (FP7/2007-2013) und der EFPIA-Unternehmen in Art contribution.The Autoren erkennen weiterhin bestehen finanzielle Unterstützung von der Universität Leiden Fonds (LUF) für Robotik und aus Cyttron, in der Besluit Subventionen Investeringen Kennisinfrastructuur Programm, das wiederum wird finanziell von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung zur Bildgebung Einrichtungen unterstützt. Der Erwerb COPAS System wurde teilweise von der Abteilung für Erd-und Biowissenschaften (ALW) mit finanzieller Hilfe von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO, 834.10.004) unterstützt.

1. Bakterienstämme und Wachstumsbedingungen <ol><li> Bereiten S. epidermidis Inokulum <ol><li> Nehmen Sie mehrere einzelne Kolonien von S. epidermidis-Stamm O-47, enthaltend eine pWVW189 abgeleitet mCherry Expressionsvektor (De Boer L. unveröffentlicht) von einem Luria-Bertani (LB)-Agarplatten mit 10 ug / ml Chloramphenicol und Kultur über Nacht bei 37 ° C in 25 ml ergänzte LB-Medium, ergänzt 10 ug / ml Chloramphenicol Stufe Midlog. </li><li> Zentrifuge 1 ml der Kultur bei 12.000 × g für 1 min und anschließend waschen mit 1 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), 3x mit 0,3% (v / v) Tween-80. </li><li> Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) und verdünnt das Bakteriensuspension bis zu einer OD 600 von 0,3 in 2% (w / v) Polyvinylpyrrolidon 40 (PVP 40) in PBS. Hinweis: eine OD 600 von 0,3 entspricht 1,0 × 10 8 koloniebildenden Einheiten / ml (KBE / ml). </li></ol&gt; </li><li> Bereiten M. marinum Inokulum <ol><li> Nehmen Sie mehrere einzelne Kolonien von M. marinum Stamm M oder E11, die das pSMT3-mCherry Vektor stabil exprimieren mCherry 10 von einer Middlebrook 7H10-Agar-Platte mit 10% (v / v) Middlebrook-OADC-Anreicherung ergänzt mit 50 ug / ml über Nacht bei 28 ° C Hygromycin und Kultur in 10 ml Middlebrook 7H9-Medium mit 10% (v / v) Middle ADC-Anreicherung mit 50 ug / ml Hygromycin ergänzt. </li><li> Zentrifuge 1 ml der Kultur bei 12.000 × g für 1 min und anschließend Waschen mit 1 ml steriler PBS mit 0,3% (v / v) Tween-80 3x. </li><li> Messung der OD 600 und verdünnt das Bakteriensuspension bis zu einer OD 600 von 0,3 in 2% (w / v) PVP 40 in PBS. Hinweis: eine OD 600 von 1 entspricht 1,0 x 10 8 cfu / ml. </li></ol></li></ol> 2. Bereiten Zebrafisch-Eier <ol><li> Legen Sie ein maximal 70 männliche und 50 weibliche wilde type Zebrafisch getrennt in den großen Zuchtbehälter. Hinweis: Setzen Sie die weiblichen Fische im unteren Teil des großen Zuchtbehälter. </li><li> Entfernen Sie die Trenn am nächsten Tag in der Früh, der Zebrafisch Zucht beginnen zu lassen. </li><li> Sammeln der Eier an der Unterseite des großen Zuchtbehälters durch die Eiersammelanlage in einem 50 ml-Röhrchen mit Ei Wasser (60 &amp;mgr; g / ml Instant Ocean Meersalz) gefüllt. </li></ol> 3. Injektionsnadeln <ol><li> Erhalten handelsüblichen Maß Glaskapillaren Nadeln mit einem Innendurchmesser von 10 um. </li></ol> 4. Experimental Outline of Injection <ol><li> Kochen Sie 100 ml von 1% (w / v) Agarose in Ei-Wasser, und kühlen, bis ca. 40 º C. Gießen Agarose in den automatisierten Mikroinjektoren Platte und legen Sie die 1024-Well-Stempel in die Agarose. Hinweis: Die Platte ist fertig, wenn abgekühlt zu bedienen. </li><li> Auf der automatisierten Mikroinjektor Betriebssoftware, klicken Sie auf &quot;Kalibrieren Bühne&quot;,dann klicken Sie auf &#39;1024 &#39;und Gitter und legen Sie die Agarose-Platte in der Mikroinjektor und kalibrieren die Platte, indem Sie auf dem Bildschirm in der Mittelposition des Brunnens. </li><li> Gehen Sie zu &#39;Nadel-Menü &quot;und klicken Sie auf&quot; Kalibrieren Nadelhalter. </li><li> Füllen Sie die Injektionsnadel mit einem Microloader Spitze mit entweder 10 ul pvp 40 mit 100 KBE / nl S. epidermidis oder 30 KBE / nl M. marinum oder Verwendung pvp 40 als Scheininjektion. </li><li> Platzieren der Nadel in der automatisierten Mikro Injektor und Kalibrieren der x, y-Position durch Senken oder Bewegen der Nadel und Anklicken auf dem Bildschirm an der Position der Nadel. Dann kalibrieren die z-Position der Nadel, indem Sie auf dem Bildschirm auf die Position der Spitze der Nadel. </li><li> Verteilen Sie die Eier über dem Agarose-Gitter mit einem Kunststoff-Transferpipette, und entfernen Sie überschüssiges Wasser Ei. Legen Sie die Agarose-Netz in der automatisierten Mikroinjektor. </li><li> Gehen Sie auf die &#39;injection-Menü &quot;und stellen Sie die&quot; Einspritzdruck &quot;-Einstellung auf 200 hPa,&quot; Einspritzzeit &quot;0,2 sec und &#39;Compensation Druck&quot; 15 hPa, die mit 1 nl korreliert, an der FemtoJet Einstellungen-Menü. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Inject all &#39;die gesamte Platte zu injizieren. </li><li> Sammeln der Eier nach der Injektion durch Waschen in einer Petrischale (92 x 16 mm), mit einem Maximum von 70 Embryos pro Petrischale, und Inkubieren bei 28 ° C. </li></ol> 5. Durchflusszytometer Analyse <ol><li> Bereiten Sie die große Partikel Durchflusszytometer entsprechend den Anweisungen des Herstellers und füllen Sie die Probenschale und Mantelflüssigkeitsbehälter mit Ei Wasser. </li><li> Bei der Betriebssoftware, gehen Sie auf die &quot;PMT&quot;-Menü und verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 650 V für die &quot;Red&quot;-Kanal und 0 V für die &quot;Grün&quot; und &quot;Gelb&quot;-Kanäle. Dann gehen Sie zu &quot;Schwellen&quot;-Menü und verwenden Sie die folgenden Einstellungen: &quot;Optical Dichte &#39;Schwellensignal: 975 mV (COPAS XL-Wert: 50) und die &quot;Time Of Flight&quot; (TOF) mindestens bis 320 Mikrosekunden (COPAS XL-Wert: 800), um den Einfluss von Schmutz zu reduzieren. </li><li> Für die Analyse ohne Sortierung die Embryonen gehen Sie zu Schritt 5.4, für die Analyse und Sortierung der Embryonen in eine Petrischale mit Schritt 5.5 oder für Analyse-und Sortier die Embryonen in eine 96-Well-Platte gehen Sie zu Schritt 5.6. </li><li> Legen Sie die Embryonen in den Probenbecher und klicken Sie auf &quot;Start&quot;, um die Analyse zu starten. Wenn alle Embryonen analysiert werden, stoppen Sie die Analyse durch einen Klick auf &quot;Stop&quot;. Speichern Sie die Daten, indem Sie auf &quot;Speichern Sie alle.&quot; Hinweis: Alle Daten werden als TXT, LMD-, DAT-, CSV-und BSRT Dateien gespeichert. Folgen Sie dem Protokoll bei Schritt 5.7. </li><li> Legen Sie die Embryonen in den Probenbecher und das Maximum von 70 Embryonen pro Platte durch die Eingabe 70 im Menü &#39;Sortieren&#39; sortiert werden sollen. Stellen Sie eine leere Petrischale unter dem Sortierer und klicken Sie auf &#39;Manual Sortieren&#39;. Wenn der Petri di<html> sh gefüllt ist, die Daten zu speichern, indem Sie auf &quot;Speichern Sie alle.&quot; Hinweis: Alle Daten werden als TXT, LMD-, DAT-, CSV-und BSRT Dateien gespeichert. Folgen Sie dem Protokoll bei Schritt 5.7. </li><li> Legen Sie die Embryonen in den Probenbecher und die maximal 1 pro Embryo gut durch Eingabe von 1 im Menü &#39;Sortieren&#39; sortiert werden sollen. Stellen Sie eine leere 96-Well-Platte in der linken Schildhalter und klicken Sie auf &#39;Füllen Platte. Wenn die 96-Well-Platte gefüllt ist, die Daten zu speichern, indem Sie auf &quot;Speichern Sie alle.&quot; Hinweis: Alle Daten werden als TXT, LMD-, DAT-, CSV-und BSRT Dateien gespeichert. Folgen Sie dem Protokoll bei Schritt 5.7. </li><li> Holen Sie sich die TXT-Datei, um die Rohdaten verarbeiten, verwenden Sie die folgenden Daten Filtereinstellungen: &#39;Status wählen Sie &quot;: 40, und wenn mit der Art Modul&#39; Status-Art &#39;:. 6 Dann nutzen Sie die Zahlen aus der Gesamtfluoreszenzsignal aus dem&#39; Red &quot;Kanal, um den Durchschnitt und die Standardabweichung vom Mittelwert zu berechnen. Zeichnen Sie diese Datensätze in bar oder Streudiagramme. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 6. Drug Treatment <ol><li> Analysieren und Sortieren bei 3 Tage nach der Injektion (dpi), M. marinum infizierten Embryonen in zwei gleich große Gruppen mit dem großen Partikel Durchflusszytometer (Schritt 5.5). Behandeln Sie eine Gruppe mit einer Verbindung der Interesse an seiner Trägerlösungsmittel und andere Träger mit Lösungsmittel allein (Kontrolle). Gelten ähnliche Behandlungen, die injiziert Kontrolle Test für Antibiotika Nebenwirkungen zu verspotten. </li><li> Wiederholen Sie bei 4 und 5 die dpi-Analyse (Schritt 5.5) und aktualisieren Sie die Ei-Wasser-oder Wasser-Ei, das die Verbindung. </li></ol> 7. High Resolution Imaging <ol><li> Anesthetize die Embryonen mit 0,02% (w / v) gepufferten 3-Aminobenzoesäureethylester (Tricaine) in Ei-Wasser 10 min vor der Analyse. </li><li> Bereiten Sie die Wirbel Automatisierte Rastertechnologie System und die Große Partikelsammler nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Wählen Sie die Referenzbilder, die dem Alter der Embryonen aus dem &quot;Imaging - Objekt211; Menü Erkennung Setup &#39;. </li><li> Wählen Sie die Anzahl der Bilder und die Orientierung durch die Wirbel automatisierten Screening-Technologie-System von der &quot;Imaging - Auto-Speichern von Bildern&quot; gemacht werden Menü. </li><li> Legen Sie eine 96-Well-Platte mit Embryonen (aus Schritt 5.6) gefüllt ist, in der linken Schildhalter des Large Partikelsammler, und klicken Sie auf &#39;Run Platte. </li><li> Wenn ein Embryo erkannt und korrekt positioniert ist; Bild der Kopf und der Schwanz mit dem CLSM separat mit einem 10X Klartrockenobjektiv und nähen die Bilder anschließend mit Hilfe von Bildverarbeitungssoftware. </li></ol>

<ol>
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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Spaink, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robotic+injection+of+zebrafish+embryos+for+high-throughput+screening+in+disease+models.">Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models.</a> Methods. 62, 246-254 (2013).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+exomes+of+common+carp+(Cyprinus+carpio)+and+zebrafish+(Danio+rerio).">Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 9, 59-67 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab on a Chip. 12, 711 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7, 634-636 (2010).</li></ol>

JS ist Inhaber der Life Science-Methoden BV, die Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert.

Die in diesem Dokument beschriebenen Hochdurchsatz-Methodik ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Pipeline zu hohe Anzahl von Fischembryonen und Larven mit verschiedenen Arten von Infektionen zu untersuchen. Mit der großen Zuchtbehälter statt der traditionellen Einzel-oder Familienzuchtbecken erleichtert die Steuerung des Laichprozesses und der Erzeugung von größeren Anzahl von Synchron Eier. Bei einer verbesserten Version des automatisierten Mikroinjektionssystem 7 ist es möglich, bis zu 2500 Eier fast alle innerhalb von 1 h spritzen in der gleichen Zellstadium. Mit diesen Aktualisierungen und verbesserte Software ist es möglich, mehr Eier als dies bisher möglich war, die verwendet werden kann, um große Arzneimittel Bildschirme mit Bakterienproliferation als Ausleseführen zu injizieren. Jedoch ist dieses Verfahren immer noch beschränkt auf Injektion andere Injektionswege beispielsweise von Benard et al Eigelb. (2012) 6, hoffentlich in der automatisierten Mikroinjektionssystem in naher Zukunft aufgenommen werden. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Obwohl diese Methoden für das Screening von Zebrafisch-Benchmarking, wäre es sinnvoll für Anwendungen mit anderen Fischarten als gut. Zum Beispiel hat der Karpfen angedeutet wurde, um Vorteile für Drogen-Bildschirme haben. Wie Zebrafisch, sind Eier und Embryonen im Frühstadium von Karpfen transparent, aber mit dem Vorteil der großen Laich Größe der hunderttausende von Eiern und die Verfügbarkeit von Inzuchtlinien, die eine konstante genetischen Hintergrund 16 anbieten. Die Analyse von großen Mengen von infizierten Embryos mit dem hohen Durchsatz großer Partikel Durchflußzytometer durchgeführt. Dieses Gerät kann Art in Multi-Well-Platten oder eine Petrischale und ist daher besonders geeignet für die Prüfung einer großen Anzahl von Verbindungen analysiert Embryonen. Wenn eine höhere Bildauflösung erforderlich ist, als die Einrichtung ist so angepaßt, daß die großen Teilchen Durchflusszytometer Technologie kann für Pre-Screening verwendet werden, und anschließend die Proben analysieren zu einem Medium durchsetzen mit einer höheren Auflösung. Dies kann mit dem Wirbel Automatisierte Rastertechnologie 17, 18 durchgeführt werden. Dieses Gerät kann automatisch sammeln Live-oder Fest Embryonen zwischen 2 und 7 Tage nach der Befruchtung aus einer Mehr Well-Platte oder Schüttgut-Container, 360 °-Bild durch eine Kapillare mit CLSM-oder Stereo-Mikroskopie und entsorgen Sie wieder in zwei Großcontainern eine manuelle Sortierung der Embryonen auf Basis auf der mikroskopischen Bilder. Zukünftige Verbesserungen werden die Sortierung der Embryo nach der Bilderzeugung in den Multi-Well-Platte zu ermöglichen, wodurch es möglich ist, automatisch Vielzahl von einzelnen Embryonen im Laufe der Zeit mit CLSM screenen. Unter der Annahme, dass in zukünftigen Anwendungen der Wirbel automatisierten Screening-Technologie-System kann auch auf die große Partikel Durchflusszytometer Technologie ohne die Notwendigkeit von vor Abgabe Larven in Multi-Well-Platten angeschlossen werden, werden zu einer erweiterten Sortier führen. Dieser Beitrag beschreibt die Einrichtung eind Optimierung eines Hochdurchsatz-Setup, um zu studieren S. epidermidis und M. marinum Infektion als Modell für die Wirkstoffforschung. Sie zeigt, dass das Ergebnis dieser Bakterien in den Dotter injiziert abhängig vom Entwicklungsstadium der Eier bei der Injektion. Injizieren M. marinum E11 bei 16 bis 128 Zellen-Stadium oder die M-Stamm bei 16 bis 64-Zell-Stadium führt zu dem gleichen Muster wie Infektion Schwanzveneninjektion 2, 6. Aber diese Konfiguration ist nicht auf die Proliferation von nur bakterielle Pathogene beschränkt. Es wurde gezeigt, dass, bevor es möglich ist, Roboter zu injizieren Lösungen, die DNA, RNA oder Morpholinos für Transgenese, Überexpression und Gen-Knock-down-Studien, bzw. 13. Weiterhin wurde gezeigt, daß dieser Aufbau ist auch nützlich für das Studium der Krebszellproliferation und Migration. Diese Leitung stellt somit ein vielseitiges Verfahren für Hochdurchsatz-Screening einer Vielzahl von Signalmechanismen im Zusammenhangder angeborenen Immunität, angewendet auf Infektionskrankheiten und die Entwicklung von Krebs. Diese Bildschirme können mit anderen, für die Medizin Entdeckung aber auch mit Analyse der möglichen toxischen Wirkungen von Drogen identifiziert anwendbar kombiniert werden.

Um den Zebrafisch stammen (Danio rerio) ist erfolgreich als effizientes Modell, um eine Vielzahl von Infektionskrankheiten ein Studium etabliert. Die Zebrafischembryo bietet einzigartige Möglichkeiten in-vivo-Bildgebung durch ihre Transparenz und der großen Anzahl von vorhandenen transgenen Reporterlinien, die fluoreszierende Proteine. Diese leistungsfähige Kombination macht es möglich, verschiedene Immunzelltypen in der Zeit zu verfolgen, während der Interaktion mit Krankheitserregern wie Mycobacterium marinum, der nächste Verwandte von M. Tuberkulose 2 oder Staphylococcus epidermidis, die Hauptverursacher von Biomaterial-assoziierten Infektionen 5.3. Verschiedene Infektionswege in Zebrafischembryos in Abhängigkeit von den Zwecken der Untersuchung 6 verwendet werden. Eine dieser Infektionswege ist Dotter Injektion der Bakterien. Der Hauptvorteil dieser Methode im Vergleich zu den anderen ist, dass Dotter infectiauf automatisch über Roboter Injektion durchgeführt werden, eine signifikante Reduzierung der Einspritzzeit und damit hohe Reproduzierbarkeit der Infektion 7, 8. Frühere Arbeiten unter Verwendung der Zebrafisch ein hoher Durchsatz in vivo Modellsystem für die Untersuchung von S. epidermidis und M. marinum Infektion zeigten erfolgreiche 7, 8 ist. Dieses System ist in der Lage, Krankheitsprogression über Roboter Eigelb Injektion von frühen Embryonen und mittels Fluoreszenzauslese als Maß für die bakterielle Belastung zu screenen. In Übereinstimmung mit dieser Idee, hat dieser Aufbau optimiert und etabliert eine sehr effiziente Hochdurchsatz-Pipeline mit dem Potenzial, eine große Anzahl von homogen infizierte Embryonen zu erzeugen und zu verfolgen den Verlauf der Infektion während der Zeit nach der Behandlung mit einer Anzahl von Verbindungen. Mit der bewährten Setup ist es möglich, erzeugen bis zu 8000 Synchron Embryonen zu Bildschirmzum Fortschreiten der Erkrankung, die Verarbeitung auf diese Weise bis zu 2500 Embryonen pro Stunde. Embryonen werden auf der Grundlage ihrer Bakterienlast sortiert unter Verwendung eines automatisierten Systems, wodurch homogene Gruppen von infizierten Larven. Darüber hinaus, um das Setup zu validieren, die Auswirkungen der Referenz bekannt, Tuberkulose Progression bei Säugetieren zu verhindern, haben an Embryonen mit M. infiziert getestet marinum E11 Belastung oder die virulenter Stamm M 9. Diese Studie beschreibt im Detail die Hochdurchsatz-Pipeline, die eingerichtet wurde, um eine große Anzahl von infizierten Embryos und die nachfolgende Analyse der Bakterien Progression während der Entwicklung und nach der Behandlung Verbindung zu erzeugen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 agar</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L5542</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L3022</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>16785.03</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>25966.01</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone40</td>
			<td>Calbiochem, San Diego, California, USA&#160;</td>
			<td>529504</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands</td>
			<td>S103</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant ocean sea salt</td>
			<td>Sera Marin, Heinsberg, Germany</td>
			<td>5460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSPAWN</td>
			<td>Techniplast, Buguggiate, Italy</td>
			<td>iSPAWN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td>Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands</td>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>COPAS XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP Sampler</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle 10 &#181;m inner diameter</td>
			<td>Qvotek, Mississauga, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and optimization of a high throughput setup to study staphylococcus epidermidis and mycobacterium marinum infection as a model for drug discovery

Zebrafische sind immer ein wertvolles Werkzeug in der präklinischen Phase der Arzneimittelforschung Screenings als Ganzes Tiermodell mit Hochdurchsatzscreening Möglichkeiten. Sie können verwendet werden, um die Lücke zwischen den Assays auf Zellbasis in einem früheren Stadium und in vivo-Validierung in Säugermodellen überbrücken, wodurch auf diese Weise wird die Anzahl der Verbindungen, die durch die Prüfung auf die viel teurer Nagetiermodellen. In diesem Licht ist in der vorliegenden Handschrift ist eine neue Hochdurchsatz-Pipeline mit Zebrafisch in vivo Modellsystem für die Untersuchung von Staphylococcus epidermidis und Mycobacterium marinum Infektion beschrieben. Dieses Setup erlaubt die Erzeugung und Analyse einer großen Anzahl von Synchron Embryonen homogen infiziert. Darüber hinaus ist die Flexibilität der Rohrleitung kann der Benutzer einfach implementieren andere Plattformen, um die Auflösung der Analyse zu verbessern, wenn nötig. Die Kombination aus dem Zebrafisch zusammen mit innovativen Hochdurchsatz-technologies öffnet den Bereich der Droge und Entdeckung neuer Möglichkeiten, nicht nur wegen der Stärke unter Verwendung eines Ganztiermodell, sondern auch wegen der großen Anzahl von transgenen Linien vorhanden, die verwendet werden können, um die Wirkungsweise der neuen Verbindungen zu entschlüsseln.

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die Hochdurchsatz-Pipeline nach S. zu studieren epidermidis und M. marinum Infektion erfolgreich hergestellt wurde und das kann zu anderen Infektionsmodellen erweitert werden. Erstens, die Verwendung von großen Zuchtbehälter (1A) auf der Grundlage der veröffentlichten System Adatto et al. (2011) 11, ermöglicht es, eine große Anzahl von Synchron Eier in Einzelereignisse Gewährleistung einer hohen Steuerung der Laichprozess zu erzeugen. Neben der Lage, große Anzahl von Embryonen in einem kurzen Zeitraum zu injizieren, um eine verbesserte Version des zuvor entwickelten automatisierten Mikroinjektionssystem 7 verwendet wurde (Fig. 1A) sein. Um abzuschätzen, welche die beste Entwicklungsstufe für Eigelb Infektion, Injektionen mit S. ist epidermidis und M. marinum wurden bei allen verschiedenen Stufen zwischen 1 und 512 Zellenstadium durchgeführt wird, entsprechend der Beschreibung von Kimmel et al. (1995) 12 </sup&gt;. Injektionen mit 100 KBE S. epidermidis zwischen 16 und 128-Zellen-Stadium, sofern die beste Infektion Muster (Abbildung 2). Die Bakterien in den Dotter vermehrt für 3 Tage und 3 dpi weiter in den Körper ausbreiten. Darstellende Injektionen vor dem 16-Zell-Stadium führte zu der hohen Sterblichkeit bei 4 dpi und nach der Injektion 256-Zellen-Stadium zeigte vor allem das Wachstum von Bakterien in der Dotter mit kaum Bakterien im Körper ausbreitet, des Embryos. Quantifizierung der Bakterienlast wurde durch Fluoreszenzintensitätsanalyse unter Verwendung der großen Partikel Durchflusszytometer durch Veneman et al (2013) 8 (Fig. 3) durchgeführt.. Beobachtungen zeigten, dass die optimale Entwicklungsstadium für die Injektion von 30 KBE M. marinum Injektion ist zwischen 16 bis 128 Zellen-Stadium für die E11-Stamm (4A) und zwischen 16 bis 64-Zell-Stadium mit dem virulenten M Strain (Fig. 4B). Embryonen dieser Stufen injiziert zeigten Bakterienwachstum innerhalb des Eigelbs und Ausbreitung der Bakterien durch den Embryo (Abbildung 7). Die Infektion mit beiden Stämmen in früheren Stadien präsentiert unspezifische generaliBakterienWachstum führt die Embryonen nach 4 dpi sterben. Auf der anderen Seite, in den Embryos in einem späteren Stadium injiziert bakterielle Belastung wurde zu dem Eigelb beschränkt. Nächstes Vorsortierung mit großen Partikel Durchflusszytometer (Abbildung 1B) erzeugt großen homogenen Gruppen von infizierten Fischen ohne nicht oder stark infizierten Embryonen (5A und 6A). Nach der Vorsortierung, M. marinum infizierten Embryonen wurden mit Rifampicin, eine erste Linie Tuberkulose Medikament behandelt. Frühere Studien zeigten, dass die Behandlung mit Rifampicin in einer Dosis von 200 uM wirksam reduziert M. marinum Infektion in Zebrafisch-7, 13. Unter advantage der Vielzahl von homogen infizierten Embryos mit der hohen Durchsatzaufbau, der Behandlung mit verschiedenen Dosen durchgeführt wurde erzeugt. Embryonen mit M. infiziert marinum M-Stamm und für 48 h bei 12, 24 behandelt, und 200 &amp;mgr; M ergab, Rifampicin, effizient mykobakteriellen Infektion in einer dosisabhängigen Weise (Fig. 5B) zu reduzieren. Im Hinblick auf eine effiziente Reduzierung der Infektion mit Rifampicin in einer Dosis von 200 uM wurde diese Konzentration für die zukünftige Experimente verwendet. Im Einklang mit dem vorherigen Ergebnis, Studium bakterielle Belastung Progression mit M. marinum E11 Belastung eine signifikante Reduktion von 24 h und weiter nach der Behandlung mit Rifampicin 200 uM beobachtet (6B). Außerdem, wenn hohe Vergrößerung Bildgebung dieser Embryonen erforderlich sind, können sie automatisch in 96-Well-Platten (Fig. 1C), von wo die Proben analysiert werden können unter Verwendung angezeigt werdender Wirbel Automatisierte Rastertechnologie-System mit dem Large Partikelsammler auf eine CLSM montiert. Der Wirbel Automatisierte Rastertechnologie-System mit dem Large Partikelsammler ist ein System, das entweder auf eine CLSM-oder Stereo-Mikroskop montiert werden kann. Diese Vorrichtung ermöglicht das Laden von lebenden oder fixierte Embryonen aus einem 96-Well-Platte oder Schüttgutbehälter automatisch durch eine Glaskapillare und orientiert sie vor der Kamera in dem gewünschten Winkel (z. B. Rücken-oder Seiten). Bilder des Embryos in allen Orientierungen kann mit der Kamera an Bord oder mit einer externen CLSM (Abbildung 7) vorgenommen werden. Die Embryonen werden in die Kollektion oder Abfallbehälter überführt werden. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1.jpg" /> Abbildung 1. Mainstream experimentellen outline. A) Erwachsene Fische sind zusammen zu paaren, Eier werden gesammelt, in einem Agarose-Platte ausgerichtet und eingespritzt. B) Die injizierten Eier werden bei 28 ° C inkubiert und auf mögliche medikamentöse Behandlung vorsortiert werden. C) Die anschließende Analyse von großen Partikel Durchflusszytometer und / oder Groß Partikelsammler / Wirbel Automatisierte Rastertechnologie mit CLSM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2.jpg" /> Abbildung 2. Gründung der besten Zellstadium für S. epidermidis Eigelb Injektion. Zebrafisch-Embryonen wurden in den Dotter in verschiedenen Entwicklungsstadien 1-512 Zell-Stadium mit 100 KBE von S. injiziert epidermidis. Embryonen zwischen 1 a eingespritztnd 8-Zell-Stadium zeigte das Bakterienwachstum im Eigelb und hohe Sterblichkeit von 4 dpi. Embryonen zwischen 16 und 128 Zellstadium injiziert zeigte das Bakterienwachstum im Eigelb und im Inneren des Körpers ab 3 dpi. Embryonen zwischen 256 und 512 Zellen-Stadium injiziert zeigten viele Bakterienwachstum in der Dotter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3.jpg" /> Abbildung 3. Quantifizierung der bakteriellen Belastung mit großen Partikel Durchflusszytometer. 100 KBE von S. epidermidis wurden in den Dotter von Zebrafisch-Embryonen injiziert. A) Bis zu 5 dpi, jeden Tag wurden Gruppen von 10 Embryonen homogenisiert und direkt überzogen, die das durchschnittliche exponentielle Wachstum, das auf zwei biologische Replikate (Fehlerbalken= SEM). B) Große Partikel Durchflusszytometer-Analyse zeigt die durchschnittliche Fluoreszenzsignal aus nicht-eingespritzt und S. epidermidis injizierten Embryonen. 30-160 Embryonen pro Bedingung analysiert (Fehlerbalken = SEM), verschiedene Buchstaben zeigen statistisch signifikante Unterschiede durch eine ANOVA mit Tukey-post-hoc-Test (P &lt;0,001), gefolgt ns:. Keine signifikanten Unterschiede C) Zusammenhang zwischen KBE und durchschnittliche Fluoreszenzsignal von Gruppen von 10 S. epidermidis infizierten Embryonen (Fehlerbalken = SEM). Diese Zahl hat sich von Veneman et al geändert. (2013) 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4.jpg" /> Abbildung 4. Establishment der besten Zellstadium für M. marinum Eigelb Injektion. Zebrafisch-Embryonen wurden auf all die verschiedenen Entwicklungsstufen von 1 bis 512 Zellen-Stadium mit 30 KBE M. injiziert marinum E11 und M-Stamm. A, B) Embryonen injiziert 1-8 Zell-Stadium zeigten ähnliche Verbreitung und Sterblichkeit, die mit beiden Stämmen. A) Embryonen injiziert zwischen 16-128 Zell-Stadium mit E11-Stamm zeigte Bildung von Granulomen und systemischen Infektion, während die eingespritzte 256-512 Zellen-Stadium gehalten bakterielle Belastung in den Dotter. B) Embryonen injiziert zwischen 16-64 Zellstadium mit M-Stamm zeigte die Bildung von Granulom Strukturen und systemischen Infektion, während die 128 bis 512 Zellen-Stadium injiziert gehalten Bakterienlast in den Dotter . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" fo: Content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg&quot; /&gt; 5. Behandlung von M. marinum akute Infektion mit einem First-line-Anti-Tuberkulose-Medikament. Embryonen injiziert, zwischen 16 bis 64-Zell-Stadium mit 30 KBE M. marinum M Stammes wurden durch die großen Teilchen führen Durchflusszytometer bei 3 dpi in beiden Gruppen nach dem Verwerfen der nicht-und / oder stark infizierte Embryonen. A) Die Fluoreszenz der einzelnen Embryonen in beiden Gruppen sortiert werden. b) Embryonen mit Rifampicin (RIF behandelt ) für 48 Stunden in Dosen von 12, 24 und 200 &amp;mgr; M wurden bei 4 dpi analysiert; die bakterielle Belastung erheblich reduziert. C) Repräsentative COPAS Profile von Embryonen mit DMSO und Rifampicin in Dosen von 12, 24 und 200 &amp;mgr; M für 24 Stunden. Bakterielle Belastung und Verteilung wird durch die roten Spitzen angegeben. Blaue Linie stellt das Profil des Elements sortiert (4 dpf Zebrafisch-embryo) von den COPAS. 60-90 Embryonen pro Bedingung wurden analysiert. Jeder Datenpunkt stellt einen einzelnen Embryo. Die Werte sind angegeben als Mittelwert ± SEM. ns: nicht signifikante Unterschiede. Die Analyse der statistischen Signifikanz der Unterschiede wurde von einem ANOVA nach Tukey-Post-hoc-Test durchgeführt, gefolgt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6.jpg" /> 6. Behandlung von M. marinum chronische Infektion mit einer ersten Linie antituberculosis Droge. Embryonen injiziert, zwischen 16 bis 64-Zell-Stadium mit 30 KBE M. marinum E11 Stamm wurden durch die große Partikel Durchflusszytometer bei 3 dpi in beiden Gruppen nach dem Verwerfen der nicht-und / oder stark infizierte Embryonen sortiert werden ausgeführt.<html> A) Die Fluoreszenz der einzelnen Embryonen in beiden Gruppen. B) Embryonen mit Rifampicin (RIF) bei 200 uM 4 Tage lang behandelt wurden, untersucht, die eine deutliche Reduktion der Keimzahl nach dem 1. Tag der Behandlung. 90 Embryonen pro Bedingung wurden analysiert. Die Werte sind angegeben als Mittelwert ± SEM. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den Zeitpunkten der gleichen Behandlung. * Zeigt signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe. ns: nicht signifikante Unterschiede. Die Analyse der statistischen Signifikanz der Unterschiede wurde von einem ANOVA nach Tukey-Post-hoc-Test durchgeführt, gefolgt. (P &lt;0,05). Abbildung B) von Spaink et al geändert. (2013) 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> hres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg &quot;/&gt; Abbildung 7. Ergebnis M. marinum E11 Eigelb Injektion aufgenommen mit Wirbel automatisierten Screening-Technologie und CLSM. Konfokale Z-Stapel (genäht 3 Bilder) aus einem 5-dpi FLI1 egfp 14 Embryos. A) Live-Embryo zeigt Verbreitung von M. marinum E11 Bakterien (rot) im ganzen Körper. B) Fest 5 dpi fli-egfp Embryo zeigt M. marinum E11 Bakterien (rot) im ganzen Körper Co-Lokalisierung mit Leukozyten (hellblau) durch L-15 plastin Immunfärbung nachgewiesen.

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Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Dieses Video Artikel beschreibt das Hochdurchsatz-Pipeline, die erfolgreich etabliert hat, zu infizieren und zu analysieren, eine große Zahl von Zebrafisch-Embryonen bietet eine neue Verbindung leistungsfähiges Werkzeug für Test-und Wirkstoffforschung mit einer ganzen Wirbeltierorganismus.

Aufbau und Optimierung eines Hochdurchsatz-Setup zum Studium<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Und<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infektion als Modell für Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

13.1K Aufrufe.  Leiden University.  Dieses Video Artikel beschreibt das Hochdurchsatz-Pipeline, die erfolgreich etabliert hat, zu infizieren und zu analysieren, eine große Zahl von Zebrafisch-Embryonen bietet eine neue Verbindung leistungsfähiges Werkzeug für Test-und Wirkstoffforschung mit einer ganzen Wirbeltierorganismus. 

Serie: Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Die Erleichterung Drug Discovery: Eine automatisierte High-Content-Assay Entzündung im Zebrafisch

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Die Verwendung von<em&gt; Galleria mellon</em&gt; Als Modellorganismus zum Studium<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infektion

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Der Nachweis eines multiresistenten<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Verstärkung Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analyse der 18FDG PET/CT Imaging als Werkzeug für Studium Mycobacterium-Tuberkulose -Infektion und Behandlung bei nicht-menschlichen Primaten

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Modellierung von Tuberkulose Mycobacterium Marinum infizierten Erwachsenen Zebrafisch

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

Ein Mausmodell zu beurteilen, angeborene Immunantwort auf Staphylococcus Aureus -Infektion

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...