Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung zu DJJ durch DFG-Projekt # JA2108 / 2-1 unterstützt.

Hinweis: Die folgenden Schritte beschreiben , unser Verfahren für eine in - situ - Experiment an embryonalen und Larvenstadien von L. Durchführung stagnalis. Wenn ein Schritt , um die Verwendung eines gefährlichen chemischen beinhaltet dies durch das Wort &quot;ACHTUNG&quot; gekennzeichnet ist und alle entsprechenden Sicherheitsverfahren erlassen werden. Links zu repräsentativen Sicherheitsdatenblätter für gefährliche Chemikalien werden in Ergänzungs Datei 1 zur Verfügung gestellt. Rezepte für alle Reagenzien werden in Ergänzungs Datei 2 zur Verfügung gestellt. 1. Montage von Decapsulation Vorrichtung <ol><li> Um dies zu tun, schließen eine 20 ml Einwegspritze auf Silikonschlauch (mit einem Innendurchmesser von 1 mm und einem Außendurchmesser von 3 mm) , um eine P1,000 Spitze geschnitten auf eine geeignete Länge , wie in 2A gezeigt. </li><li> Band mit einem Standard-Mikroskop-Objektträger mit einem invertierten großen Petrischale. Band der Silikonschlauch unmittelbar neben der Mikroskop - Objektträger , wie in Abbildung gezeigt60; 2C und 2D. </li><li> Rest ist eine zog Glasnadel auf dem Objektträger und vorsichtig in den Silikonschlauch einführen , bis die Spitze der Nadel etwa 20% des Weges ragt über den Innendurchmesser des Rohres (siehe Abbildung 2C und 2D). Sobald die Nadel darin Position Band auf der Petrischale nach unten. </li><li> Lassen Sie das freie Ende des Silikonschlauch in einer anderen Petrischale ruhen, die die entkapselten Material sammeln. </li></ol> 2. Probenentnahme, Fixierung und Decapsulation HINWEIS: Alle Schritte werden bei RT durchgeführt, wenn nicht anders angegeben. <ol><li> Ei Saiten von den Wänden eines Aquariums sorgfältig sammeln. Um dies zu tun, ein flaches Stück aus flexiblem Kunststoff wie einem Spatel verwenden, um die Ei-String aus dem Substrat zu kratzen, und mit einem Kunststoff-Teesieb das schwebende Ei Schnur aus dem Wasser zu fischen. Bühne und sortieren das Material unter einem Mikroskop mit der Führung in Abbildung versehen1. </li><li> Legen Sie das Ei Zeichenfolge auf einem Papiertuch und machen einen Längsschnitt entlang der Eimasse mit Hilfe der Federzange. Rollen Sie die Ei-Kapseln aus dem Ei-String und entfernen Sie so viel von der Jelly-Material wie möglich aus jeder Kapsel durch sie um das Papiertuch drückt die Feder Pinzette. </li><li> Mit Hilfe der Federzange, übertragen Sie die Ei-Kapseln in eine Petrischale mit 5 ml Leitungswasser. Weiter de-Sülze Ei-Kapseln der gewünschten Entwicklungsstadien in diesem Gericht zu sammeln. Sammeln Sie genug Kapseln aus allen Entwicklungsstadien für die geplante WMISH Experiment dann mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li><li> Wenn sie mit weiter entwickelten Larven arbeiten (5 Tage nach der ersten Spaltung (DPFC) und älter) betäuben sie vor der Fixierung. HINWEIS: Dadurch werden die Muskeln von Vertrags verhindern , die die Interpretation der in situ Färbemustern sehr schwierig macht. <ol><li> Relax-Larven (während sie noch in ihrer capsu sindles) in einer 2% igen w / v Lösung von MgCl 2 • 6H 2 O für 30 min vor der Fixierung. </li><li> Beurteilen Sie den Grad der Entspannung nach 30 Minuten durch mehrere Larven während Untertauchen noch in ihrer Ei-Kapseln in Fixierungslösung und die Überwachung ihrer Antwort unter dem Mikroskop. Unvollständig entspannt Larven werden in ihren Schalen zurückziehen, während völlig entspannt Larven nicht reagieren. Sobald diese Larven gelockert worden, um mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Ei - Kapseln eine große Bohrung Plastikpipette in ein verschließbares Röhrchen verwenden , das 10 - fache des Volumens von Ei - Kapseln bietet (z. B. 1 ml der abgewickelten Kapseln würden typischerweise mehr als 10 - ml - Röhrchen erfordern). </li><li> Absaugen so viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Rohr und ersetzen mit einem Volumen von Fixierungslösung, die 10-fache Volumen der abgesetzten Ei-Kapseln ist. Vorsichtig drehen für jede Entwicklungsstufe für die entsprechende Zeit bei RT (siehe Abbildung 1) , um die Ei - Kapseln in Fixiermittel. </li><li> Discontinue Rotation und lassen Sie die Kapseln die Fixierungslösung in einen geeigneten Abfallbehälter zu sinken und absaugen. </li><li> Waschen Sie die Ei-Kapseln durch die Fixierungslösung mit Phosphat-gepufferte Saline mit 0,1% Tween-20 (PBTw) ersetzt und Drehen bei RT für 5 min. Saugen Sie das PBTw und zweimal wiederholen. </li><li> Entfernen Embryonen und Larven aus ihren Kapseln unter Verwendung der Vorrichtung in 2 gezeigt ist . Zeichnen Sie die Kapseln bis in die 20 - ml - Spritze (Abschnitt 1 für Details), den Schlauch befestigen und zerstreuen dann die Kapseln durch den Schlauch und vorbei an der Glasnadel aus in die Auffangschale. HINWEIS: Normalerweise ist die Mehrheit (&gt; 90%) aller Kapseln sollten nur einen Durchlauf durch das Gerät benötigen. In vielen Fällen wird die Kapselmembran beschädigt, aber Embryonen und Larven bleiben innerhalb der aufgebrochenen Kapsel. Reprocess dieses Material, indem es einfach nach oben in die Spritze aufgezogen und wieder auszuräumen. </li><li> Sammeln Sie die decapsulated Embryonen und Larven in ein 1,5-ml-Röhrchen ein Mikrofon mitropipette (a P20 für 0 bis 3 Tage alten Larven und eine P200 für ältere Larven mit dem Ende der Spitze abgeschnitten). Hinweis: eine Pause (bis zu mehreren Monaten) in dem Protokoll kann zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden. Wenn dies erforderlich ist, sollte die decapsuled Material in ein 1,5 ml Röhrchen für die Lagerung gesammelt werden (mit dem nächsten Schritt fortgesetzt). Andernfalls sofort weiter zu Protokoll 3. </li><li> Erlauben Embryonen und Larven auf den Boden des Röhrchens zu sinken und den Überstand absaugen. Ersetzen Sie mit 33% Ethanol (EtOH) in PBTw und lassen Sie sich für 5 sitzen - 10 min. Wiederholen Sie mit 66% EtOH in PBTw und 100% EtOH. Waschen Larven zweimal in 100% EtOH bei RT. Lagern Sie das Material bei -20 ° C in 100% EtOH. </li><li> Wenn Sie bereit sind, um fortzufahren, rehydrieren die Proben durch die 100% EtOH zu entfernen und mit 66% EtOH in PBTw ersetzt, lassen Sie sich für 5 sitzen - 10 min. Wiederholen Sie mit 33% EtOH in PBTw, sitzen lassen 5 - 10 min. Schließlich waschen mit 3x 5 min Wäschen von PBTw, um sicherzustellen, alle EtOH entfernt wird. </li></ol> 3. Proteinase-K, TEA und Post-fixation HINWEIS: Wir finden die folgenden Schritte in kleinen Körben mit einem Gitterboden, die effizienteste und schonende Methode für die schnelle zeitkritische Lösungen auszutauschen. Während diese können zu Hause gemacht werden, verwenden wir Körbe (mittlere Größe) , die mit der Flüssigkeit InSituPro -Vsi Intavis kompatibel sind Handhabungsroboter (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Solche Körbe können schnell und einfach zwischen den Vertiefungen einer 12-Well-Gewebekulturschale (TCD), um Lösungen für den Austausch oder die Lösung abgesaugt werden kann, aus dem Bohrloch mit einer Pipette bewegt werden. Alternativ können alle Lösungsaustausch ohne diese Körbe durchgeführt werden, indem man einfach den Überstand aus den Larven Ansaugen. In diesem Fall wird eine sanfte Wirbelbewegung werden alle Embryonen und Larven in die Mitte des Tellers konzentrieren so dass der Überstand aus dem Rand des Brunnens entfernt werden. Im Folgenden wird angenommen der Benutzer Körbe für Lösungsaustausch verwendet wird. <ol><li> Mit einer Pipette, Transfer Embryonen und Larven in einen Korb in einer 12-Well-TCD mit 2 ml PBTw sitzen. . HINWEIS: Die Anzahl der Embryonen und / oder Larven , die hinzugefügt werden können , hängt von der Entwicklungsphase untersucht, aber eine Faustregel ist , mindestens 25% der Bodenfläche frei von Embryonen / Larven (dh zu halten, nicht überladen Warenkorb). </li><li> Bereiten Sie eine angrenzende gut mit 2 ml der entsprechenden Proteinase-K - Lösung (siehe Abbildung 1), und weitere 2 Brunnen mit 2 ml 0,2% Glycin je. Bewegen Sie jeden Korb in den Brunnen der entsprechenden Konzentration von Proteinase-K enthält, und sofort Timing starten. </li><li> Nach 10 Minuten jeden Korb in ein gut mit 0,2% Glycin bewegen und für 5 min inkubiert. Dann bewegen Sie jeden Korb in die zweite gut mit 0,2% Glycin und Inkubation für 5 min. Waschen Sie die Glycine mit 3x 5 min Austausch von 3 ml PBTw. </li><li> Entfernen Sie die PBTw Lösung und behandeln die Proben einmal mit frisch zubereiteten Triethanolamin (TEA) solution für 5 min ACHTUNG! schütteln Sie nicht. Ersetzen mit 3 ml frisch zubereitete TEA-Lösung für 5 min. Nicht aufregen. Aspirieren die Mehrheit der TEA-Lösung aus den Proben. Fügen Sie den frisch zubereiteten Triethanolamine mit Essigsäureanhydrid (TEAAA) Lösung und Inkubation für 5 min. ACHTUNG! Sie agitieren nicht. </li><li> Optional - Während der obige Schritt brütet, bereiten eine weitere neue Charge von TEAAA Lösung und wiederholen Sie den Schritt. HINWEIS: Diese zweite Behandlung mit TEAAA optional ist, aber helfen kann vollständig alle Hintergrund mit Sonden zu erzeugen, Hintergrund anfällig zu beseitigen. </li><li> Entfernen Sie die TEAAA Lösung, indem sie es aus dem Brunnen Ansaugen und ersetzen mit 3 ml PBTw. Nicht aufregen. Entfernen Sie die PBTw und gelten 3 ml 3,7% Formaldehyd in PBTw. verwirbeln sanft gelegentlich während einer 30-minütigen Inkubation. </li><li> Entfernen Sie die Fixiermittel durch sie aus dem Bohrloch abgesaugt und ersetzen mit 3 ml PBTw. Übertragen Sie das Material in ein 1,5-ml-Röhrchen. REDie PBTw mit Hybridisierungspuffer und Inkubation bei RT für 5 min - VORSICHT. </li><li> Die Röhrchen in einen heißen Block bei RT, und stellen Sie die Temperatur auf die gewünschte Hybridisierungstemperatur. HINWEIS: Die Hybridisierungstemperatur Sonde, die spezifisch und müssen empirisch optimiert werden, jedoch finden wir, 55 ° C, um anfänglich Versuch eine gute Temperatur. Lassen Sie den Block auf die Hybridisierungstemperatur zu kommen, und damit die Proben vorzunehmen hybridisieren ca. 15 min (dh, es ist die Zeit , die Ribosonden vorzubereiten stattfindet, ist nicht länger erforderlich). Bereiten Sie ausreichende Mengen (in der Regel 100 &amp; mgr; l) der verdünnten Riboproben. Wir in der Regel Studie Sondenkonzentrationen von 100 und 500 ng / ml als Anfangsbereich. Wir bereiten Riboproben nach 12. </li><li> Entfernen Sie den Hybridisierungspuffer aus den Proben und fügen Sie die Sonde in Hybridisierungspuffer zu den Proben. Overlay mit 100 &amp; mgr; l (oder einer ausreichenden Volumen einer Phase über die Hybridisierung buffe zu bildenr) von Mineralöl. HINWEIS: Das Mineralöl umfangreiche Kondensation verhindert, dass während der langen Hybridisierungsschritt bilden. Extensive Kondensations deutlich sowohl die Chemie der Hybridisierungslösung und die Konzentration der Sonde zu verändern. </li><li> Denaturieren der Sonde und der Ziel-RNA durch Erhitzen der Proben auf 75 ° C für 10 min, dann reduzieren die Wärme an die Hybridisierungstemperatur erwünscht. Zulassen der Hybridisierung für mindestens 12 h (O / N) oder länger ablaufen (von 24 bis 48 h). </li><li> Während der Hybridisierung ein einzelnes Rohr aus dem Wärmeblock entfernen, drehen Sie es schnell zwischen Daumen und Zeigefinger die Larven zu suspendieren, ohne die Ölphase zu stören, und ersetzen Sie es in den Wärmeblock. Wiederholen Sie einmal dies jedes von 6 bis 12 Stunden oder so. </li></ol> 4. Hot Wäscht und Immunnachweis HINWEIS: Während wir eine Flüssigkeitshandhabungsroboter für die folgenden Schritte verwenden, können diese auch leicht manuell erfolgen. In diesem Fall, Embryonen und Larven shoULD in den 1,5-ml-Röhrchen gehalten werden, die sie in hybridisiert wurden. Alle nachfolgenden Lösung tauscht werden abgesaugt und mit einer P1,000 Pipette zugegeben. Wenn manuell durchgeführt für jede der folgenden Schritte sollten 1 ml jeder Lösung einzusetzen. <ol><li> Wärme ausreichende Volumina (je 3 ml für jede Probe) des 4x, 2x und 1x Waschlösungen auf die Hybridisierungstemperatur. </li><li> Waschen alle Proben dreimal in Waschpuffer 4x für 15 min jeweils bei der Hybridisierungstemperatur. Waschen alle Proben dreimal in 2x Waschpuffer für 15 min jeweils bei der Hybridisierungstemperatur. Waschen Sie alle Proben dreimal in 1x Waschpuffer für jeweils 15 Minuten bei der Hybridisierungstemperatur. </li><li> Waschen Sie alle Proben einmal mit 1x Natriumchlorid Natriumcitrat Puffer + 0,1% Tween (SSC + 0,1% Tween) bei der Hybridisierungstemperatur. Erlauben Proben auf RT abkühlen. </li><li> Waschen Sie alle Proben zweimal in 1x SSC + 0,1% Tween 15 min Ersetzen Sie diese 1x SSC-Lösung mit Maleinsäure-Puffer (MAB) und lassen Sie sich für 10 Minuten sitzen Wiederholen Sie die MAB wAsche. Ersetzen MAB mit Blocklösung und Inkubation für 1,5 Stunden. </li><li> Tauschen Sie die Blocklösung für Antikörperlösung (1: 10.000 Verdünnung des Antikörpers in Blocklösung) und Inkubation für 12 Stunden (O / N) bei RT unter leichtem Schütteln. </li></ol> 5. Farbentwicklung und Montage <ol><li> Absaugen der Antikörperlösung und waschen 15-mal mit PBTw für jeweils 10 min. Ersetzen PBTw mit 1x alkalische Phosphatase-Puffer (AP) und für 10 min inkubiert. </li><li> Während die oben genannten Inkubationsschritt fortschreitet, die Färbelösung AP vorbereiten (siehe Zusatz Datei 2) - VORSICHT. Übertragen Sie das Material in einen TCD gut und ersetzen Sie die 1x AP-Lösung mit AP-Färbelösung. Beachten Sie jetzt die Zeit, so dass die Länge der Zeit, die Farbreaktion stattfindet, für aufgezeichnet werden. Überwachen Sie die Entwicklung des Verfärbungsmuster, bis das Signal-Hintergrund-Verhältnis optimal ist. </li><li> Um die Farbentwicklung zu stoppen, entfernen Sie die 1x AP Färbelösung (entsorgen in der entsprechenden waste-Container) und 2 ml PBTw einsetzen und die Zeit jetzt beachten. Spülen Sie zweimal mit PBTw für jeweils 5 Minuten. Verwenden Sie eine dieser Spülungen das Material in einem 1,5-ml-Röhrchen zu übertragen. </li><li> Entfernen Sie die PBTw und anwenden 1 ml 3,7% Formaldehyd in PBTw und agitieren oder drehen für mindestens 30 min bei RT (dies auch O getan werden kann / N). </li><li> Waschen Sie die Fixiermittel mit 3 Waschungen von PBT (entsorgen den Abfall Fixiermittel in einem geeigneten Abfallbehälter). Waschen Sie die Proben 3 mal bei 50 ° C in entionisiertem Wasser. Hinweis: Diese Waschungen eliminieren die Ausfällung von Salzen, die während der Clearing- und Visualisierungsschritte sichtbar werden können. </li><li> Entscheiden Sie, ob die Proben sollten in Benzylbenzoat montiert werden: Benzylalkohol (BB: BA, die auch als Murray klar bekannt) oder Glycerin. HINWEIS: Wir bevorzugen die leistungsfähigeren Clearingstelle BB: BA als L. stagnalis Embryonen sind etwas undurchsichtig. Proben in BB montiert werden: BA wird zunächst durch eine Ethanolreihe dehydratisiert werden müssen. Proben in 60% zu montierendenGlycerin kann sofort montiert werden. </li><li> Übertragen Sie die Proben in die Montagelösung (BB: BA oder 60% Glycerin) mit einer Pipette. HINWEIS: Wenn in BB Montage: BA muss dies auch in einem Glas erfolgen (BB: BA wird Polycarbonat-Kunststoff schmelzen). </li><li> Lassen Sie die Proben für 5 zu löschen - 10 min, und dann montieren sie auf einen Objektträger eine entsprechende Anzahl von gestapelten Deckgläser als Abstandshalter unter Verwendung von (1 Deck für Proben &lt;1 DPFC, 2 Deckgläser für Proben&gt; 1 DPFC). HINWEIS: Vollständige Halterungen können nun eine Verbindung Mikroskop mit DIC-Optik abgebildet werden. </li></ol>

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C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deployment+of+regulatory+genes+during+gastrulation+and+germ+layer+specification+in+a+model+spiralian+mollusc.">Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc.</a> Dev. Dyn. , (2015).</li><li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis.">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li><li>Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+asymmetric+expression+of+dpp+in+the+mantle+of+gastropods+correlates+with+asymmetric+shell+coiling.">Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling.</a> EvoDevo. 4 (1), 15 (2013).</li><li>Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+animal+microRNAs+and+the+evolution+of+tissue+identity.">Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity.</a> Nature. 463, (2010).</li><li>Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+triple+staining+method+for+double+in+situ+hybridization+in+combination+with+cell+lineage+tracing+in+whole-mount+Xenopus+embryos.">A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos.</a> Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev. Biol. 11 (1), 43 (2011).</li><li>Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+behaviour+in+Lymnaea+stagnalis.+pond+snails+is+a+maternally+inherited,+lateralized+trait.">Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait.</a> Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).</li><li>Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+blastomere+arrangement+dictates+zygotic+left-right+asymmetry+pathway+in+snails.">Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails.</a> Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).</li><li>Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+handedness+is+directed+by+genetically+determined+cytoskeletal+dynamics+in+the+early+embryo.">Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo.</a> Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).</li><li>Lu, T. Z., Feng, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sodium+leak+current+regulates+pacemaker+activity+of+adult+central+pattern+generator+neurons+in+Lymnaea+stagnalis.">A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis.</a> PLoS One. 6 (4), e18745 (2011).</li><li>Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Splicing+of+an+Invertebrate+Beta+Subunit+(LCav-beta)+in+the+N-Terminal+and+HOOK+Domains+and+Its+Regulation+of+LCav1+and+LCav2+Calcium+Channels.">Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels.</a> PLoS ONE. 9 (4), e92941 (2014).</li><li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools.">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li><li>Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+genome+size+databases.">Eukaryotic genome size databases.</a> Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die effiziente Visualisierung von RNA - Transkripte mit vermutlich unterschiedlichen Expressionsniveaus in allen Entwicklungsstadien der Spitzschlammschnecke. Die Embryonen und Larven aus ihren Kapseln entfernen wir eine Vielzahl von chemischen, osmotischen Schock und physikalische Behandlungen trialed für andere encapsulated- berichtet Entwicklung von Modellorganismen. in unseren Händen Allerdings ist die Methode, die wir hier beschreiben, die nur mit hohem Durchsa...

Mollusken sind eine Gruppe von Tieren, die das Interesse einer breiten Vielfalt wissenschaftlicher Disziplinen halten. Trotz ihrer morphologischen Vielfalt 1, Artenreichtum ( an zweiter Stelle nach den Arthropoden in Bezug auf die Artenzahl 2) und der Relevanz für eine breite Palette von kommerziellen 3, medizinischen 4 und wissenschaftlichen Fragen 5-8, gibt es relativ wenige Mollusken - Arten , die zu behaupten kann , sein beide gut ausgestattete wissenschaftliche Modelle und einfach in einer Laborumgebung zu halten. Ein Mollusken , die viel von Disziplinen wie Neurobiologie 9 verwendet wird, Ökotoxikologie 10 und in jüngerer Zeit die Evolutionsbiologie 11,12, ist Spitzschlammschnecke, in erster Linie wegen seiner weiten Verbreitung und extrem einfache Wartung. Trotz seiner Popularität als &quot;Modell&quot; Organismus und seine lange Geschichte der Verwendung von Entwicklungsbiologen 13-19, die Reichweite und Leistung von molekularen Werkzeugen zur Verfügung, die L. StAGNalis wissenschaftliche Gemeinschaft liegt weit hinter der traditionellen Tiermodellen (Drosophila, Maus, Seeigel, Nematoden). Unser Wunsch zu entwickeln Lymnaea als ein molekulares Modell von einem Interesse an den molekularen Mechanismen ergibt sich die Schalenbildung führen. Dies motiviert uns eine Reihe von Techniken zu verfeinern , die für die effiziente, konsistente und sensible Darstellung der Genexpression während der Lymnaea &#39;s Entwicklung ermöglichen würde. Whole mount in situ Hybridisierung (WMISH) ist weit verbreitet für eine Vielzahl von Modellorganismen eingesetzt und ist seit mehr als 40 Jahren im Einsatz 20. In seinen verschiedenen Ausprägungen können, ISH räumlich eingesetzt werden, um spezifische Loci auf den Chromosomen, rRNA, mRNA und Mikro-RNAs zu lokalisieren. Eine der Herausforderungen , mussten wir vor der Raffination eine WMISH Verfahren zur L. zu adressieren stagnalis war die Frage der sanft und effizient Embryonen und Larven von verschiedenen Stadien von t Extrahierener Ei-Kapseln, in denen sie abgelegt werden. Diese Extraktion oder &quot;decapsulation &#39;muss effizient angemessene Material zu sammeln eine bestimmte in situ - Experiment, während zur gleichen Zeit die Aufrechterhaltung morphologischen und Zellintegrität um erreicht werden. Während andere Modellorganismen auch gekapselter Entwicklung durchlaufen, konnte erfolgreich in L. eingesetzt werden in unseren Händen keine der Methoden für diese Spezies berichtet stagnalis. Die allgemeinen Ziele dieses Verfahrens sind daher: L. zu extrahieren stagnalis Embryonen und Larven aus ihren Kapseln in einem Hochdurchsatzverfahren , Pre-Hybridisierung Behandlungen anwenden, das den WMISH Signal zu optimieren, Embryonen und Larven mit zufriedenstellender WMISHsignals für die Bildgebung vorzubereiten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2203">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Featherweight forceps</td>
			<td style="width:173px;">Ehlert &#38; Partner</td>
			<td style="width:104px;">#4181119</td>
			<td style="width:1547px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon tubing</td>
			<td>Glasger&#228;tebau OCHS GmbH</td>
			<td>760070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillaries</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>1403547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 well tissue culture dishes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CE55.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37% Formaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P733.1</td>
			<td>CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediamine tetraacetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN06.3</td>
			<td>CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127.1</td>
			<td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll type 400</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN90.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4607.1</td>
			<td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease freeBovine Serum Albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8895.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Salmon sperm</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5434.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7692.1</td>
			<td>CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase-K</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7528.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3790.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionised formamide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P040.1</td>
			<td>CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard formamide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6749.3</td>
			<td>CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triethanolamine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6300.1</td>
			<td>CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic anhydride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4483.1</td>
			<td>CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Maleic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K304.2</td>
			<td>CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6630-250ML</td>
			<td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10,800-6</td>
			<td>CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blocking powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti DIG Fab fragments AP conjugated</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9090.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4421.3</td>
			<td>CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A155.3</td>
			<td>CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl cysteine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4126.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td>CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tergitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NP40S</td>
			<td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN30.3</td>
			<td>CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4.2H2O)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4984.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3580.1</td>
			<td>CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Mineral oil&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td style="width:104px;">HP50.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">InSituPro-Vsi&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Intavis</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc lymnaea stagnalis

Whole mount in situ Hybridisierung (WMISH) ist eine Technik , die für die räumliche Auflösung von Nukleinsäuremolekülen (oft mRNAs) innerhalb eines &quot;whole mount&quot; Gewebepräparation oder Entwicklungsstadium (wie ein Embryo oder Larve) von Interesse ermöglicht. WMISH ist extrem leistungsfähig, da sie wesentlich zur funktionellen Charakterisierung komplexer Metazoen Genome beitragen kann, eine Herausforderung, die mehr von einem Engpass bei der Flut der nächsten Generation Sequenzdaten immer. Trotz der konzeptionellen Einfachheit der Technik viel Zeit wird häufig benötigt, um die verschiedenen Parameter inhärent WMISH Experimente für neuartige Modellsysteme zu optimieren; subtile Unterschiede in den zellulären und biochemischen Eigenschaften zwischen Gewebetypen und Entwicklungsstadien bedeuten, dass eine einzige WMISH Methode nicht für alle Situationen geeignet sein können. Wir haben eine Reihe von WMISH Methoden für die wieder auftauchende gastropod Modell entwickelt , das Spitzschlammschnecke erzeugen konsistent undklar WMISH Signale für eine Reihe von Genen, und in allen Entwicklungsstadien. Diese Verfahren umfassen die Zuordnung von Larven unbekannter chronologischen Alter zu einem ontogenetischer Fenster die effiziente Entfernung von Embryonen und Larven von ihren Eier Kapseln, die Anwendung eines geeigneten Proteinase-K - Behandlung für jeden ontogenetischer Fenster und Hybridisierung, post-Hybridisierung und Immunnachweis Schritte. Diese Methoden stellen eine Grundlage, das resultierende Signal für eine bestimmte RNA-Transkript verfeinert werden kann weiter mit Sonde spezifische Anpassungen (in erster Linie Sondenkonzentration und Hybridisierungstemperatur).

Die repräsentativen WMISH Färbungsmuster in 3 gezeigt wurden die oben beschriebenen Technik erzeugt wurde, und eine Vielzahl von räumlichen Expressionsmuster für Gene , die in einem Bereich von molekularen Prozessen beteiligt reflektieren Bereich von Schalenbildung (Novel Gen 1, 2, 3 und 4), an Zell-Zell - Signalisierung (DPP) zur Transkriptionsregulation (Brachyurie) in einer Reihe von Entwicklungsstadien. Während wir die Express...

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A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Eine ganze Berg<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierungsverfahren für die Gastropod Mollusc<em&gt; Spitzschlammschnecke</em

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

a-whole-mount-situ-hybridization-method-for-gastropod-mollusc-lymnaea

Research

JoVE Journal

Biology

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

8.7K Aufrufe.  Georg-August University of Göttingen. The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

Serie: A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Verfahren zur Whole Mount Antikörper-Färbung in Küken

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Mit Whole Berg In situ Hybridisierung zu Molecular Biology und Organismal Link-

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

In-situ-Hybridisierung für die genaue Lokalisierung der Transkripte in Pflanzen

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung in whole mount Embryonen und Histologie für Marine Elasmobranchs Angepasst

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Hohe Auflösung Ganze Berge<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung innerhalb Zebrafischembryonen Gene Expression und Funktion zu untersuchen

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

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Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Verfahren zur Whole Mount Antikörper-Färbung in Küken

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Mit Whole Berg In situ Hybridisierung zu Molecular Biology und Organismal Link-

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

In-situ-Hybridisierung für die genaue Lokalisierung der Transkripte in Pflanzen

Whole Berg RNA Fluorescent

RNA

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz

Hohe Auflösung Ganze Berge