Wir danken Dr. Randy Elkins, Robin Kastenmayer, Ted Torrey, Dan Pare und Tovi Lehman für die kritische Durchsicht der Manuskripte. Diese Arbeit wurde durch die Interne Research Program der Abteilung für Interne Research, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, und durch das 973 National Basic Research Program of China, # 2007CB513103 unterstützt. Wir danken NIAID intramural Editor Brenda Rae Marshall für die Unterstützung.

Aseptische Technik ist für alle Materialien, die in Tieren verabreicht werden, um eine versehentliche Einführung von exogenen Krankheitserregern in Mäusen, die experimentellen Ergebnisse zu verwechseln vermeiden können angewendet werden. 1. Die Infektion von Mäusen mit Blut-Stufen-Malaria-Erregern <ol><li> Bei Raumtemperatur auftauen zwei Fläschchen mit dem gefrorenen Blut Bühne Malaria-Parasiten zu überqueren. In diesem Beispiel sind zwei Nagetier Malaria-Parasiten Plasmodium-Stämme verwendet yoelii yoelii und Plasmodium yoelii nigeriensis. </li><li> Fit eine Spritze mit einer 22-30 Gauge (G) Nadel und erarbeiten 400 ul sterilem, pharmazeutischer Qualität PBS (pH 7,4). </li><li> Mit der gleichen Spritze, erarbeiten 100 ul des aufgetauten infiziertes Blut, kehren die Spritze auf und ab, bis der Inhalt homogen vermischt wird. (Optional: eine Pipette verwendet werden, um PBS und infiziertes Blut in ein Sammelrohr vor Transfer in eine Spritze zur Injektion übertragen werden). </li><li> Inject 200 ul von Parasiten enthaltenden Lösung direkt in die Bauchhöhle einer Maus. Wenn Sie fertig sind, werfen Sie die Spritze in einem dafür bin. (Siehe auch Ergänzende Materialien für die Wartung von Labor-Mäuse). Im Allgemeinen ist die Standard-Größe des Inokulums zwischen 100-500 ul, je nach der Höhe der Parasitenbefall in der ursprünglichen eingefroren Materialien. </li><li> Inject die beiden Parasiten-Stämme in zwei Mäusen gekreuzt werden. Mäuse positiv wird mikroskopisch 3 bis 5 Tage nach den Injektionen. Wenn Parasitämien zwischen 1-5% zu erreichen, mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li></ol> 2. Mixed Clone Infektion von Mäusen <ol><li> Vor gemischt Klon-Infektion, sammeln Schwanz Blut aus den beiden Spender-Mäuse mit den verschiedenen Parasiten-Stämme für die mikroskopische Untersuchung von Giemsa dünne Blutausstriche (Abb. 3) infiziert sind, und für die Messung der roten Blutkörperchen Dichte (siehe ergänzende Materialien für detaillierte Verfahren) . </li><li> Berechnen Sie das Volumen einer physiologischen Kochsalzlösung (1,5% w / v Trinatriumcitratdihydrat, 0,85% w / v Natriumchlorid) und Maus Blut benötigt, um ein Inokulum Gemisch zu erzeugen, mit der Parasitämie und der roten Blutkörperchen Dichtemessungen erhaltenen früher. </li><li> Passen Sie die Parasiten-Lösung auf eine Endkonzentration von einer Million infizierter roter Blutkörperchen pro 100 &amp;mgr;. </li><li> Kombinieren Sie die infiziertes Blut aus den beiden Spendern in einem Verhältnis von 1:1 zu einem Mixed-Klon Inokulum erhalten. Als die beiden elterlichen Klone in der Wachstumsrate unterscheiden, passen die Proportionen eines schneller wachsenden elterlichen einer langsamer wachsenden elterlichen Klon bis 1:2 oder 1:5. </li><li> Inject 100 ul der gemischten Probe in das Bauchfell jeder Maus infiziert zu sein. (Siehe auch Schritt 3,9 bis die Anzahl der Mäuse zu bestimmen, die injiziert werden) </li><li> Mit dieser Methode infizieren zwei Mäuse jeweils mit dem einzigen elterlichen Stämme. Die Single-Klon Infektionen ermöglicht die Bestimmung der erfolgreichen Übertragung der beiden elterlichen Stämme. </li></ol> 3. Feeding Moskitos <ol><li> Bereiten Sie drei Käfige mit 300-500 Erwachsenen (männlich und weiblich) Anopheles Mücken stephensi jeden, Alter 5-7 Tage Nachauflauf aus Puppen. Die Behälter sind mit Netzen zu sichern durch eine Kunststoff-oder Metall-Deckel abgedeckt. Zwei Käfige sind für die Fütterung auf die elterliche Klone, die dritte Käfig ist für die Herstellung eines genetischen überqueren. </li><li> Ab vier Tage nach dem Mixed-Klon Infektion vorbereiten Giemsa-gefärbten dünnen Blut Schwanz Abstriche von den infizierten Mäusen. </li><li> Untersuchen Sie die Flecken unter dem Mikroskop durch das Scannen von mindestens 50 mikroskopischen Feldern in 1000facher Vergrößerung und festzustellen, ob männliche und weibliche gametocytes vorhanden sind. </li><li> Männliche und weibliche gametocytes erkennbar sind durch die Anwesenheit von großen Vakuole und große Körner (Abb. 3). Männliche und weibliche gametocytes haben rosa und blau Zytoplasma bzw.. Wenn gametocytes vorhanden sind, fahren Sie mit Schritt 3.6. </li><li> Wenn gametocytes abwesend sind, halten die Überwachung täglich bis sie erscheinen. Wenn gametocytes vorhanden sind, weiterhin den folgenden Schritt. </li><li> Inject 50 ul Anästhetika Cocktail mit 33 mg / ml Ketamin und 3 mg / ml Xylazin in die Bauchhöhle einer Maus zu jeder infizierten Maus (pro 20 Gramm Maus Körpergewicht) zu betäuben. Finale Dosis Ketamin und Xylazin liegt bei 82,5 und 7,5 mg / kg. </li><li> Legen Sie die Maus nach unten auf der Oberseite einen Käfig mit erwachsenen Anopheles stephensi Moskitos, die von Zucker liefern wurden für 24 Stunden ausgehungert und damit die Mücken für 30 Minuten ohne Unterbrechung zu ernähren. </li><li> Pflegen Sie die Mücken in einem Insektarium unter Standard-Bedingungen (Temperatur zwischen 24-26 ° C gehalten, siehe auch ergänzende Methoden für die Wartung von Labor-Moskitos). </li><li> Verwenden Sie eine infizierte Maus für jeden 50-100 weiblichen Mücken. Euthanize die Mäuse sofort durch Genickbruch nach der Fütterung während die Mäuse noch unter Narkose. </li></ol> 4. Dissecting Mosquito MIDGuts und Counting Oocysten <ol><li> Neun Tage nach der Fütterung werden die Mücken für die Oozysten in das Insekt Mitteldarm untersucht werden. Die Anwesenheit von Oozysten in den Mücken ernähren sich von Single-Klon infizierten Mäusen, dass gametocytes der beiden elterlichen Stämme zeigt infektiös sind. </li><li> Um sezieren eine Mücke Mitteldarm, verwenden Sie einen Aspirator verbunden mit einem kleinen Behälter auf 5 bis 10 infizierten Mücken aus dem Käfig zu sammeln. </li><li> Mit CO 2-Gas, betäuben die Mücken und übertragen Sie sie in ein Glas-Petrischale auf Eis. Separate und entsorgen männlichen Mücken. Die Antennen der Männchen sind deutlich buschiger im Vergleich zu den Weibchen. </li><li> Füllen Sie zwei Spritzen mit PBS und montieren Sie sie mit 26 Gauge halben Zoll (G ½) Nadeln. Kaution ca. 100 ul PBS aus einer Spritze auf einen Objektträger. </li><li> Übertragen von 5 bis 10 anästhesierten weibliche Stechmücken auf den Tropfen PBS und legen Sie die Folie auf einem Binokular. </li><li> Mit der gleichen Nadeln, nehmen Sie jede Mücke die Flügel und Beine, dann hält das Insekt an der Brust und hinteren Bauch, ziehen Sie den Körper auseinander, bis die Mitteldarm, ein weißes sackartige Körper freigesetzt wird. Lösen Sie den Mitteldarm und entsorgen Sie den Rest des Körpers. </li><li> Fügen Sie weitere PBS auf dem Mitteldarm, wenn die Folien trocken sind. Der Mitteldarm wird entartet, wenn wir getrocknet. Legen Sie ein Deckglas über dem Mitteldärmen. </li><li> Untersuchen Sie die Mitteldärmen unter einem Lichtmikroskop bei einer 100-facher Vergrößerung. Zählen Sie die Anzahl von Oozysten in jedem Mitteldarm (Abb. 3). Oozysten sind erkennbar als dickwandige kreisförmige Strukturen, die auf der Außenfläche des Mitteldärmen liegen. </li><li> Wenn Sie fertig sind, von Spritzen, Nadeln, und schieben Sie in einem dafür bin entsorgen. </li><li> Wenn Oozysten fehlen in der Mitteldärmen sind, Futtermittel Moskitos mit infizierten Mäusen, die mit der höheren Anzahl von gametocytes und geben eine längere Fütterungszeit. Die Temperatur ist entscheidend für diesen Schritt. Vergewissern Sie sich, die Temperatur, bei 24 bis 26 ° C eingestellt </li></ol> 5. Sammeln Sporozoiten von Mücken durch Zentrifugation <ol><li> Bereiten Sporozoiten Sammelröhrchen wie folgt: Schneiden Sie die Deckel von einem sauberen 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen und ein Loch (0.1-0.2 mm Durchmesser) an der Unterseite des Rohres mit einer geflammten 19 G Nadel. </li><li> Füllen Sie 1 / 3 des Rohres mit Glaswolle. Legen Sie die Filter-Tube in ein 1,5-ml-Collection-Tube (eine Tube reicht bis zur Ernte Sporozoiten von ~ 100 Mücken) </li><li> Am Tag 17 post Fütterung, sammeln Mücken (Schritt 4) aus den Käfigen in einen kleinen Behälter mit einem Staubsauger. </li><li> Verwenden CO 2-Gas, um Mücken zu betäuben. </li><li> Separate die Weibchen vom Männchen Mücken. Übertragen Sie die betäubten weiblichen Mücken aus dem Behälter zu einem Glas Petrischale auf Eis. </li><li> Bereiten Sie zwei Spritzen mit 26 G ½ Nadeln mit PBS gefüllt. Kaution ca. 100 ul PBS aus einer Spritze auf einen Objektträger. </li><li> Übertragen Sie die Mücken auf einen Objektträger. Entfernen Sie die Moskitos Kopf, Flügel, Beine, Bauch und unter einem Binokular. </li><li> Mit spitzen Pinzette übertragen Brustkörbe in 0,5 ml PBS in einer 1,5-ml-Homogenisator (Mörser und Stößel). Bewahren Sie die Brustkörbe auf Eis (Sporozoiten bleibt infektiös für 2-3 h). </li><li> Homogenisieren Brustkörbe auf Eis zu Sporozoiten aus Speicheldrüsen freizugeben (siehe Abbildung 3), und übertragen Sie die Lysate (Homogenate) in das Rohr mit Glaswolle (Schritt 5,1 bis 5,2) mit einer Glaspipette gefüllt. </li><li> Zentrifuge für 10 bis 20 sec bei 1000 rpm bei Raumtemperatur. </li><li> Sammeln Sie die Flow-Through (die gereinigte Sporozoiten Suspension) mit einer Spritze mit einer 22-30 G Nadel. (Optional: drop 10-50 ul der Flow-Through auf einen Objektträger, legen ein Deckglas und visualisieren die Live-Sporozoiten unter einem Standard-Lichtmikroskop, 400-facher Vergrößerung, siehe auch Abb. 3) </li><li> Inject ip 0,1-0,5 ml des Sporozoiten-Suspension in Mäusen (bis zu 200.000 Parasiten können von einer einzigen Stechmücke geerntet werden; siehe Lit. 12). In einem erfolgreichen Fall, wird das Tier infiziert 72 Stunden nach der Injektion. </li></ol> 6. Cloning Progeny mit Begrenzte Dilution <ol><li> Zweiundsiebzig Stunden nach der Sporozoiten-Injektionen, sammeln Schwanz Blut aus den beiden Spender-Mäuse mit den verschiedenen Parasiten-Stämme für die mikroskopische Untersuchung nach Giemsa-Färbung von dünnen Blutausstrich und für die Messung der roten Blutkörperchen Dichte (siehe ergänzende Materialien für detaillierte Verfahren) infiziert. </li><li> Wählen Sie eine Maus Anzeige einer 0,1 bis 1% Parasitämie und deren infizierte rote Blutkörperchen enthalten meist einzelne Parasiten als Spender für die Klonierung. Wiederholen Sie Schritt 6.1 nächsten Tagen, wenn die Mäuse mikroskopisch negativ sind. Wenn die Tiere nicht innerhalb von 14 Tagen infiziert sind, wiederholen Sie Schritt 2 bis 5 und bestimmen Sie die Anwesenheit von Sporozoiten in Schritt 5,11). </li><li> Verdünnen Sie die geernteten Schwanz Blut in einem kalten 1:1-Lösung von Kälberserum und Säugetieren Ringer-Lösung (2,7 mM Kaliumchlorid, 1,8 mM Calciumchlorid, 154 mM Natriumchlorid), um so das Ziel, ein conKonzentration von 0,6 bis 1 infizierte rote Blutkörperchen pro 100 ul, und speichern Sie das Inokulum auf Eis. Auf diese Weise sollten die meisten der einzelnen Maus erhalten entweder Eins oder Null Parasiten. </li><li> Intravenös injizieren 100 ul verdünnt infiziertes Blut in jeder von 50 bis 100 Mäuse. </li><li> Fünf bis sieben Tage später, Bildschirm die Mäuse auf das Vorhandensein von Blut Parasiten durch die Untersuchung Giemsa-gefärbten dünnen Blutausstrich. In einem erfolgreichen Experiment, werden 20-50% der Mäuse infiziert und wird Parasitämie von 0,1-5,0% an Tag 8 nach der Infektion zeigen. </li></ol> 7. Charakterisierung von Progeny Hilfe von genetischen Markern <ol><li> Sammeln Sie 20 bis 40 ul der Maus Schwanz Blut in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, dass 0,2 ml gekühlter physiologischer Kochsalzlösung Citrat, kurz vortexen und zentrifugieren für 3 min bei 3000 rpm bei Raumtemperatur zu Pellet die Blutzellen enthält. Auszug DNA sofort oder halten das Pellet bei -80 ° C. </li><li> Bereiten Parasiten-DNA mit einem beliebigen Standard-DNA-Extraktionsverfahren. Zur schnellen Isolierung von DNA, verwenden Sie ein High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche Applied Bioscience). </li><li> Rekombinante Nachkommen sind nach Genotypisierung mit Mikrosatelliten (MS) oder Single-Nukleotid-Polymorphismus (SNP) auf verschiedenen Chromosomen, dass die beiden elterlichen Stämme der genetischen Kreuz unterscheiden kann identifiziert werden. Ein vereinfachtes Verfahren mit einzelnen fluoreszenzmarkierten Primer für MS-Genotypisierung von P. yoelii kann (vgl. Rz 8,9) werden. </li></ol> 8. Kryokonservierung von Blut-Stufen-Malaria-Erregern <ol><li> Sammeln 0,5-1 ml von infiziertem Blut durch Herzpunktion aus einer narkotisierten Maus mit Parasitämie von 5-20% in 5-10 mL gekühlter physiologischer Kochsalzlösung. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 2000 rpm bei Raumtemperatur. Überstand. </li><li> Tropfenweise 2x Volumen von Glycerolyte 57-Lösung (Fenwal Laboratories) auf Blut-Pellets und gut mischen. </li><li> Die Suspension auf Kryoröhrchen (0,2-0,5 mL pro Röhrchen). </li><li> Bewahren Sie die kryokonservierten Blut bei -80 ° C (bis zu 1 Monat) oder in flüssigem Stickstoff. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse: In einem erfolgreichen Experiment, werden 5-10% der geklonten Linien unabhängige rekombinante Nachkommen sein. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Eine schematische Darstellung des Lebenszyklus und der genetischen Rekombination Ereignisse während eines genetischen überqueren. Genetische Rekombination Veranstaltungen finden während der frühen Phase der Entwicklung in der Mücke. Nach der Befruchtung &quot;haploid&quot; männliche und weibliche Keimzellen von verschiedenen genetischen Hintergründen im Mitteldarm der Mücke sind &quot;diploid&quot; Zygoten gebildet. Die Zygote ist der einzige diploide Stadium des Parasiten Lebenszyklus; Meiose folgt innerhalb von 12 Stunden nach der Befruchtung, und alle nachfolgenden Stufen in der Mücke und Säugetiere bleiben haploid. Die daraus resultierenden Zygoten entwickeln sich zu ookinetes und Oozysten. Wachstum und mitotischen Teilung der einzelnen Oozysten produziert Tausende von Sporozoiten, die in der Moskitos hemoceal freigesetzt werden. Diese Sporozoiten, die Speicheldrüsen wandern sind in der Lage, auf einem Säugetierwirt, wo die Entwicklung der Leber und roten Blutkörperchen Stufen erfolgt übertragen werden. Im Laufe der roten Blutkörperchen Zyklen lassen sich einige Parasiten zu reifen männlichen und weiblichen gametocytes unterscheiden. Der Parasit Lebenszyklus ist beendet, wenn diese gametocytes von einem anderen Mücke, verewigen Übertragung ergriffen werden. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Vererbung von nuklearen Genen in Malaria-Parasiten und Produktion von rekombinanten Nachkommen. Genetische Rekombination kann durch chromosomale Reassortierung oder Crossover-Ereignisse erzeugt werden. Homozygote Nachkommen durch Selbstbefruchtung zwischen Gameten der gleichen elterlichen Klon 1 oder 2 (A und D), bzw. produziert. B) Heterozygote Nachkommen durch Befruchtung zwischen Gameten der beiden unterschiedlichen elterlichen Klone, rekombinante Kerne (blau Ovale) durch chromosomale Reassortierung allein gebildet produziert. C) Heterozygote Nachkommen aus der gegenseitigen Befruchtung zwischen Gameten der beiden anderen übergeordneten Klone, rekombinante Kernen (rot Ovale) durch Übergänge zwischen den Nicht-Schwesterchromatiden der homologen Chromosomen gebildet produziert. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Morphologie der Nager Malariaparasiten Plasmodium yoelii. A) Ring Bühne, B) Trophozoiten, C) Schizonten, D) Merozoiten, E) unreifen männlichen gametocyte, F) reifen männlichen gametocyte, G) unreife weibliche gametocyte, H) ausgewachsene weibliche gametocyte, I) Mitteldarm mit Oozysten am Tag 10 post Fütterung (reifen Oozyten durch Pfeile angedeutet; 200-facher Vergrößerung), J) Mücke Speicheldrüsen (100fache Vergrößerung), K) Sporozoiten (400-facher Vergrößerung).

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Wir zeigen die Techniken für die Herstellung eines genetischen Kreuz in das Nagetier Malaria Plasmodium yoelii, die auch für die Produktion von genetischen Kreuzungen in andere Nager malarias. Infektionen von Mäusen mit einzelnen Eltern Klone sind in der Regel durchgeführt, um eine erfolgreiche Übertragung der elterlichen Parasiten zu bestimmen, um sicherzustellen, dass die Eltern kompetent bei der Herstellung von funktionellen Gameten vor der Durchführung eines Kreuzes sind. ...

Ergänzende Materialien: <ul><li> Wartung von Labormäusen </li><li> Wartung von Labor-Moskitos </li><li> Die mikroskopische Untersuchung von dünnen Blutausstrich mit Giemsa-Färbung </li><li> Die Messung der roten Blutkörperchen Dichte </li></ul> Wartung von Labormäusen Die Weibchen Inzucht Labor Mausstamm BALB / c, im Alter von 5 bis 8 Wochen alt, werden in der Studie verwendet. Mäuse sind in einem Standard mit festem Boden Polycarbonat Käfig mit Draht-bar Deckel, mit Speiser und eine Wasserflasche ausgerüstet untergebracht. Mäuse sind bei einer konstanten Temperatur gehalten (25 ± 1 ° C) auf 12:12 stündigen Licht: Dunkel-Zyklus. Mäuse dürfen auf 2018S Harlan Teklad Globale 19% Protein extrudierten Nagerfutter Feed (sterilisierbar, von Harlan-Teklad) und lieferte mit angesäuertem Trinkwasser ad libitum. Tierversuche sind in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Animal Care und Verwenden Ausschuss am National Institute of Allergy and Infectious Disease unter Protokoll LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland) gesetzt durchgeführt. Wartung von Labor-Moskitos Moskitos sind aus einem Labor gezüchtet Kolonie von Anopheles stephensi. Die Erwachsenen sind in Nylon Käfige in einem Temperatur-und Feuchte-kontrollierten Raum (23 bis 25 gehalten ° C gehalten Plasmodium yoelii und Plasmodium chabaudi und 19 bis 21 ° C für Plasmodium berghei; 80 bis 95% Luftfeuchtigkeit; am 00.12 Stunden Licht: Dunkel-Zyklus). Adult Mücken sind mit 10% Glucose und 2,00% para-Aminobenzoesäure (PABA) ergänzt Wasser-Lösung zugeführt. Um qualitativ hochwertige Erwachsene, 500 Larven in einer Low-Density-Zustand in 1 l destilliertem Wasser in einer 1.000-cm 3 offene Schale mit ca. 1 mg Natriumbicarbonat geliefert gewachsen. Nach dem Schlüpfen werden die Larven gegeben TetraMin Pulver (PETCO), bis sie entwickeln sich zu dem Puppenstadium und an die erwachsenen Mücken Käfige für Schwellenländer übertragen. Die mikroskopische Untersuchung von dünnen Blutausstrich mit Giemsa-Färbung Mit sauberen Schere abzuschneiden der Spitze (1,0 mm) der infizierten Maus den Schwanz. Geben Sie einen Tropfen (0,5-1,0 mL) der Schwanz Blut auf ein sauberes Objektträger. Maus stoppt Blutungen in 1-2 min. Legen Sie ein sauberes Streuer schieben auf dem Blutstropfen und hält ihn in einem 45 ° Winkel in Bezug auf den Objektträger und lassen das Blut auf die gesamte Breite des Streuers zu adsorbieren. Halten Sie den Objektträger und voranzutreiben den Streuer schieben schnell und reibungslos zu einem dünnen Abstrich zu produzieren. Lassen Sie das Blut Film trocknen, und dann tauchen die Folien in absolutem Methanol. Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen noch einmal vor dem Abdecken mit Giemsa (10% Giemsa Farbstoff in destilliertem Wasser). Nach der Inkubation das dünne Blut Filme für 10-15 min bei Raumtemperatur sorgfältig spülen Sie die Dias mit Leitungswasser und lassen Sie sie trocknen. Untersuchen Sie die Anzahl der infizierten roten Blutkörperchen (iRBC; siehe Abbildung 3 für die Morphologie der infizierten Erythrozyten) unter einem Lichtmikroskop mit Immersionsöl bei 1000-facher Vergrößerung (100x mit Objektiv) und berechnen Parasitämie (die Anzahl der iRBC pro 100 RBC gezählt). Verschiedene Stämme von Malariaparasiten variieren in der Wachstumsrate und Pathogenität. Überwachung von Blut Bühne Parasitämien durchgeführt 24h nach Injektionen, abhängig von der Dosis des Blutes Bühne Malaria-Parasiten. Zum Beispiel werden die Mäuse mikroskopisch positive 24 Uhr werden, wenn sie mit 10 7 infiziert RBC intraperitoneal oder 10 6 infizierten RBC intravenös injiziert. Die Messung der roten Blutkörperchen Dichte Wie die Ebenen der Parasitämien, roten Blutkörperchen (RBC) Dichte in infizierten Mäusen variiert im Verlauf der Infektion. RBC Dichte sollte innerhalb von 1-2 Stunden vor dem Start des Einzel-und Mixed-Klon-Infektion und das Klonen Experimenten gemessen werden. Es gibt zwei Methoden für die Messung der RBC Dichte: ein manuelles Zählen mit Neubauer-Zählkammer und eine automatische Zählung mit einem Cellometer (Nexcelom Bioscience). Bei beiden Methoden sind je 1 ul der Maus Schwanz Blut mit einer Glaskapillare (VWR) und verdünnen in 10 ml PBS und gut mischen. Für die Verwendung einer Neubauer-Zählkammer, Last 20 ul der Suspension auf die Hämazytometer. Legen Sie die Hämazytometer auf einem Lichtmikroskop mit 10x Objektiv. Die Hämazytometer enthält ein Raster in 9 große Quadrate und 4 große Quadrate an den Ecken gegliedert werden weiter in 16 kleine Quadrate unterteilt. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in jeder der 16 kleine Quadrate in den vier Eck-Quadraten. Um zu vermeiden, Zählen Bias oder Zählen von Zellen, die ein Raster Linie überschneiden, gehören eine Zelle als &quot;in&quot;, ob er sich der rechten oder oberen Linien und &quot;out&quot;, ob er sich unten oder links Linien. Schätzen Sie die Anzahl der Zellen pro ein kleines Quadrat und dividieren durch 0,00625 (das Volumen eines kleinen Platz beträgt 6,25 nL). Daraus ergibt sich die Anzahl der Zellen pro Mikroliter (&amp;mu; L). Aus diesen Daten berechnet den endgültigen roten Blutkörperchen Dichte durch Multiplikation mit 10.000 (ein Verdünnungsfaktor). Spülen Sie das Deckglas und Zählkammer mit destilliertem Wasser und 70% Ethanol, an der Luft trocknen. Alternativ laden 20 ul der Suspension auf einen Cellometer Zählkammer gleiten. Legen Sie die Folie in einen Cellometer schieben Kammer (dem Leser). Starten Sie den Cellometer Software, wählen Sie den &quot;roten Blutkörperchen&quot;-Option, und geben Sie einen Verdünnungsfaktor von 10.000. Notieren Sie sich die RBC Dichte.

protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites

Variation in Reaktion auf Medikamente gegen Malaria und Pathogenität von Malaria-Parasiten ist von biologischen und medizinischen Bedeutung. Linkage Mapping um erfolgreiche Identifizierung von Genen oder loci zugrunde liegenden verschiedenen Eigenschaften in Malaria-Parasiten von Nagetieren 1-3 und 4-6 Menschen geführt. Die Malaria-Parasiten Plasmodium yoelii ist eine von vielen Malaria-Arten von wilden afrikanischen Nagetieren isoliert und wurde angepasst, um im Labor wachsen. Diese Art reproduziert viele der biologischen Eigenschaften des menschlichen Malaria-Parasiten, genetischen Markern wie Mikrosatelliten und amplifizierte Fragment-Längen-Polymorphismus (AFLP)-Marker sind auch für die Parasiten 7-9 entwickelt worden. So können genetische Untersuchungen bei Nagetieren Malaria-Parasiten durchgeführt, um Forschung auf Plasmodium falciparum ergänzen. Hier zeigen wir die Techniken zur Herstellung eines genetischen Kreuz in P. yoelii, die zuerst Pionierarbeit von Dr. wurden. David Walliker, Richard Carter und Kollegen an der University of Edinburgh 10. Genetische Kreuze in P. yoelii und andere Nager Malaria-Parasiten sind durch Infizieren Mäusen Mus musculus mit einem Inokulum mit gametocytes von zwei genetisch unterschiedliche Klone, die in Phänotypen von Interesse und indem Mücken auf dem infizierten Mäusen 4 Tage nach der Infektion Vorschub unterscheiden durchgeführt. Die Anwesenheit von männlichen und weiblichen gametocytes in der Maus Blut mikroskopisch vor der Fütterung bestätigt. Innerhalb von 48 Stunden nach der Fütterung, im Mitteldarm der Mücke, die haploid gametocytes in männliche und weibliche Keimzellen zu differenzieren, zu befruchten, und bilden eine diploide Zygote (Abb. 1). Bei der Entwicklung einer Zygote in eine ookinete erscheint Meiose bis 11 auftreten. Wenn die Zygote durch gegenseitige Befruchtung zwischen Gameten von zwei genetisch verschiedene Parasiten, genetischen Austausch (. Chromosomale Reassortierung und Cross-overs zwischen den Nicht-Schwesterchromatiden eines Paares von homologen Chromosomen; Abb. 2) abgeleitet sind, können auftreten, die bei der Rekombination von genetischem Material an homologen Loci. Jede Zygote durchläuft zwei aufeinanderfolgende Kernteilungen, was zu vier haploide Kerne. Ein ookinete weiterentwickelt in eine Oozysten. Sobald die Oozysten fällig wird, werden Tausende von Sporozoiten (die Nachkommen des Kreuzes) gebildet und freigesetzt in Mücke hemoceal. Sporozoiten aus den Speicheldrüsen geerntet und in eine neue Maus-Host, wo pre-Erythrozyten und Erythrozyten Entwicklungsphase stattfindet. Erythrozytären Formen sind geklont und klassifiziert in Bezug auf die Charaktere zu unterscheiden elterlichen Linien vor genetische Verknüpfung Mapping. Bekämpfung von Infektionen von einzelnen Eltern Klone sind in der gleichen Weise wie die Herstellung eines genetischen Kreuz durchgeführt.

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Genetische Kreuzungen Nagetier Malaria-Parasiten werden durch Zuführen von zwei genetisch verschiedene Parasiten Mücken durchgeführt. Rekombinante Nachkommen sind von der Maus Blut nach Abzug Mücken infizierten Mäuse beißen geklont. Dieses Video zeigt, wie genetische Kreuzungen produzieren<em&gt; Plasmodium yoelii</em&gt; Und ist auch für andere Nager Malaria-Parasiten.

Protokoll für die Herstellung eines genetischen Kreuz der Nager Malaria-Erregern

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.1K Aufrufe.  National Institutes of Health. Genetische Kreuzungen Nagetier Malaria-Parasiten werden durch Zuführen von zwei genetisch verschiedene Parasiten Mücken durchgeführt. Rekombinante Nachkommen sind von der Maus Blut nach Abzug Mücken infizierten Mäuse beißen geklont. Dieses Video zeigt, wie genetische Kreuzungen produzieren Plasmodium yoelii Und ist auch für andere Nager Malaria-Parasiten.

Serie: Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

In-vivo-Imaging von transgenen Leishmania Parasiten in einer Live-Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Ein Protokoll für die Erfassung und Färbung Blutzellen aus dem Gelbfiebermücke Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Quantitative Analysen aller Influenza Typ A Viral Hämagglutininen und Neuraminidasen mit Universal Antikörper in Einfache Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

A Simple Chelex Protokoll zur DNA-Extraktion aus<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Genetische Manipulation in<em&gt; Δku80</em&gt; Die Stämme für Funktionelle Genomanalyse<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Retrovirale Transduktion von T-Helferzellen als genetischer Ansatz zur Untersuchung Mechanismen der Kontrolle ihrer Differenzierung und Funktion

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

A Simple Red Blood Cell Lysis Verfahren zur Etablierung von B Lymphoblastoidzelllinien

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

Phänotypische Analyse von Nagetier Malaria Parasiten Asexual und Sexuelle Blutstadien und Mückenstadien

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate hosts, respectively. While pathogenic symptoms of leishmaniasis can vary widely, from benign cutaneous lesions to highly fatal visceral disease forms depending on the infective species, all Leishmania species reside inside host macrophages during the vertebrate stage of their lifecycle. Leishmania infectivity is therefore directly related to its ability to invade, survive and replicate within parasitophorous vacuoles (PVs) inside macrophages. Thus, assessing the parasite&#39;s ability to replicate intracellularly serves as a dependable method for determining virulence. Studying leishmaniasis development using animal models is time-consuming, tedious and often difficult, particularly with the pathogenically important visceral forms. We describe here a methodology to follow the intracellular development of Leishmania in bone marrow-derived macrophages (BMMs). Intracellular parasite numbers are determined at 24 h intervals for 72 - 96 h following infection. This method allows for a reliable determination of the effects of various genetic factors on Leishmania virulence. As an example, we show how a single allele deletion of the Leishmania Mitochondrial Iron Transporter gene (LMIT1) impairs the ability of the Leishmania amazonensis mutant strain LMIT1/&#916;Lmit1 to grow inside BMMs, reflecting a drastic reduction in virulence compared to wild-type. This assay also allows precise control of experimental conditions, which can be individually manipulated to analyze the influence of various factors (nutrients, reactive oxygen species, etc.) on the host-pathogen interaction. Therefore, the appropriate execution and quantification of BMM infection studies provide a non-invasive, rapid, economical, safe and reliable alternative to conventional animal model studies.

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

All pathogenic Leishmania species reside and replicate inside macrophages of their vertebrate hosts. Here, we present a protocol to infect murine bone marrow-derived macrophages in culture with Leishmania, followed by precise quantification of intracellular growth kinetics. This method is useful for studying individual factors influencing host-pathogen interaction and Leishmania virulence.

Quantifizierung der intrazellulären Wachstum innen Makrophagen wird eine schnelle und zuverlässige Methode zur Beurteilung der Virulenz des Parasiten Leishmania

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...