Die Autoren haben keine Bestätigungen.

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Chalmers University Humanforschung Ethikkommission.
Hinweis: Alle Schritte müssen in einem sterilen Biosafety Schrank ausgeführt werden.
1. Vorbereitung von Verbrauchsmaterialien, Bioink und Zellen
<ol>
	<li>Erhalten zwei Spritzen, eine Spritze (Abbildung 1(ein) ist für die Zellsuspension, während die andere Spritze für die Bioink (Abbildung 1b) ist.</li>
	<li>Erhalten Sie eine sterile passive Mischeinheit (Abbildung 1c), die mit dual Spritzen über eine Luer-Lock-Verbindung gekoppelt werden kann.</li>
	<li>Erhalten Sie eine Dosiereinheit (Abbildung 1-d), die ein Volumen von zwei sterile Spritzen gleichzeitig mit kontrollierter Geschwindigkeit linear austragen kann. Hinweis: Das Mischungsverhältnis verwendet in dieser Studie beträgt 10:1. Verwenden Sie daher eine 12 mL Spritze und eine 1 mL Spritze je nach Bedarf vom Referat 10:1 mischen.</li>
	<li>Erhalten Sie eine sterile Patrone (Abbildung 1e) und sterile weiblich-weiblich Luer Lock Anschluss direkt gemischt Bioink und Zelle Aussetzung in.</li>
	<li>Zu erhalten Sie oder bereiten Sie die Bioink für die Mischung mit einem Zellsuspension. Hinweis: In diesem Protokoll war ein Nanocellulose/Alginat-basierte Bioink genutzt. Dieses Bioink ist durch die Zugabe einer sterilen 100 mM CaCl2 -Lösung post drucken vernetzt.</li>
	<li>Zellen mit einer 0,5 % Trypsin/EDTA-Lösung zu lösen und die Gesamtzahl der Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung Methode17zählen. Hinweis: In diesem Protokoll wurden menschliche Fibroblasten eingesetzt.</li>
	<li>Bestimmen Sie, welche Zelldichte in das endgültige gedruckten Konstrukt gewünscht wird. Berechnen Sie mit Hilfe der folgenden Gleichungen die Konzentration der geernteten Zellen, die verdünnt werden muss, um dieses Ziel letzte Zelle Dichte zu erreichen. Hinweis: In diesem Protokoll wurde eine endgültige Zelldichte von 5 x 106 Zellen/mL eingesetzt.<ol>
		<li>Wählen Sie eine gewünschte Zelle Konzentration für die Experimente: C-Zellen (Zellen/mL).</li>
		<li>Berechnen Sie die Höhe der Bioink notwendig, VBioink, bezogen auf die Gesamtzahl Konstrukte gewünscht: 
		VBioink = Vkonstruieren × Nkonstruierte Hinweis: zum Beispiel ist die Lautstärke des Bioink pro Konstrukt 100 µL. Wenn 30 Konstrukte gedruckt werden, dann ist das Bioink Volumen benötigt 3 mL.</li>
		<li>Berechnen Sie die Anzahl der Zellen benötigt: 
		NZellen = CZelle (1,1 × VBiolink)</li>
		<li>Aufschwemmen der Zellen (N-Zellen) in 1/10th das Volumen der Bioink: 
		VZellsuspension = 0,1 × VBiolink Hinweis: zum Beispiel wenn VBioink = 3 mL, dann VZellsuspension = 0,1 × 3 mL = 0,3 mL</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Mischen der Zellsuspension und Bioink
<ol>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in die Zelle Aussetzung Spritze.</li>
	<li>Übertragen Sie der Bioink auf eine andere Spritze oder erhalten Sie eine Spritze mit der Bioink zu.</li>
	<li>Ziehen Sie den Spritzenkolben Bioink zurück und legen Sie die Spritze in der Dosiereinheit. Positionieren Sie das Gerät senkrecht mit dem Luer Lock Anschluss nach oben (Abbildung 1-f1).</li>
	<li>Ziehen Sie den Kolben der Spritze Zelle zurück auf eine ähnliche Länge als die Bioink Spritze und stecken Sie in die Dosiereinheit (Abbildung 1f2).</li>
	<li>Die Mischeinheit zuordnen Sie beide Spritzen durch Verdrehen Luer Lock Konnektoren (Abbildung 1f3).</li>
	<li>Entlüften Sie das Mischsystem durch Drücken auf die Dosiereinheit, die Luft in der Spritze zu extrudieren. Stoppen Sie die Grundierung vor der Lösung der Luer-Lock (Abbildung 1g4) zu erreichen.</li>
	<li>Nach dem Grundieren, legen der Füllung Kartusche bis zum Ende der Mischeinheit über den Luer Lock-Anschluss (Abbildung 1g5). Stellen Sie sicher, dass unten vor der Anlage befindet sich die Kolben in der Füllung Patrone.</li>
	<li>Komprimieren Sie langsam (Abbildung 1h6) die Dosiereinheit um die Bioink und Zelle Aussetzung in die Patrone (Abbildung 1i7) vermischen.</li>
	<li>Drücken Sie den Kolben in die Füllung Patrone nach unten mit einer sterilen Pipettieren Spitze, die Bioink-Zelle-Mischung nach dem Mischen zu kontaktieren. Halten Sie die Abgabe bis komprimiert, um sicherzustellen, dass die Zelle/Bioink-Mischung zurück in die Mischeinheit nicht extrudiert wird.</li>
	<li>Verschließen der Patrone und klopfen Sie leicht auf die Arbeitsfläche, um eventuell vorhandene Luftbläschen an die Spitze der Kartusche (Kolbenende) bewegen. Hinweis: An dieser Stelle ist die Zelle/Bioink Mischung druckfertig. Den folgenden Abschnitten werden spezifische Anwendungen und Druckverfahren werden.</li>
</ol>
3. Ermittlung der Zellviabilität unter Verwendung einer Mischanlage im Vergleich zu manuellen Spatel mischen
<ol>
	<li>Lösen von menschlichen Fibroblasten (Abschnitt 7) mit 0,5 % Trypsin/EDTA-Lösung am Zusammenfluss von 80 %, die Anzahl und Aufschwemmen in Kulturmedium bei ausreichender Zelldichte, eine Endkonzentration nach dem Mischen mit der Bioink zu erreichen (01:10 Zellen: Bioink-Verhältnis) von 5 x 10 6 Zellen/mL.</li>
	<li>Mischen Sie Zellen, in die Bioink mit entweder die Passive Einheit Mischtechnik (Schritt2) oder per Spachtel die Wirkung beider Techniken im Zellviabilität bewerten.</li>
	<li>Die Bioink mit der Passive Einheit Mischtechnik 1, 2 oder 3 Mal vor der Abgabe in eine Form zur Vernetzung mit 100 mM CaCl2verschmelzen Sie Zellen. Hinweis: Um zusätzliche Mischungen durchzuführen, mischen Sie die Zelle/Bioink direkt in eine Spritze anstatt einer Patrone. Dann die Mischung durch die Mischeinheit nach dem vorherigen Protokoll, aber ohne die Zelle Spritze Komponente remix.</li>
	<li>Eine separate Bioink mit manuelle mechanische mischen über einem Spatel für Laufzeiten von 30, 60 oder 90 S. Transfer die Mischungen (für jede Mischzeit) in eine Form zur Vernetzung mit 100 mM CaCl2verschmelzen Sie Zellen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Proben auf einen gut Teller nach Abschluss der Vernetzung und Kultur unter Standardbedingungen.</li>
	<li>Nach 1 Tag voller Kultur, waschen die Konstrukten (n = 3-4 pro Gruppe) in serumfreien Zellkulturmedium für 30 min. Fleck der Zellen in die Konstrukte mit einer Färbelösung (4 µM Calcein AM, 1 µM Interkalation Homodimer-1) für 30 min.<ol>
		<li>Zwei weitere Male zu waschen, und die Proben in serumfreien Zellkulturmedium für insgesamt 1 h bei 37 ° c inkubieren</li></ol></li></ol>Übertragen Sie die Proben auf ein live Cell imaging-Lösung.
	
	
	<li>Abrufen von Bildern über eine digitale Farbkamera bei 10facher Vergrößerung mit einem inversen Mikroskop mit FITC und Texas Red-Filter, und analysieren Sie mittels Bildanalyse-Software.</li>
	<li>Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie drei Bilder von jedem Konstrukt für die Quantifizierung der Zellviabilität.</li>
	<li>Rentabilität, basierend auf dem Verhältnis von lebenden Zellen, Gesamtzahl der Zellen zu berechnen. Analysieren Sie die Daten über eine einfache ANOVA, gefolgt von Tukey multiple Vergleiche-Test.</li>

4. Bioprinting der Knorpel Analoga mit einem einzigen Zelltyp
<ol>
	<li>Zeichnen Sie ein 3D-Modell des gewünschten Gewebes analog. Umwandeln einer Datei Gcode für Bioprinting und laden Sie die Datei Gcode auf dem Bioprinter1. Hinweis: In diesem Protokoll wurde eine quadratische Struktur mit Maße 4,8 x 4,8 x 0,9 mm3 als STL-Datei exportiert. Eine Gcode-Datei wurde von der Gitterstruktur mit folgenden Einstellungen generiert: Schichtdicke, 0,3 mm; Füllung Muster, geradlinig; Ausfachung Dichte, 25 %; 10 mm/s Geschwindigkeit.</li>
	<li>Isolieren Sie und Tiefgefrieren Sie primären menschlichen nasale Knorpelzellen (hNC) von Patienten nach dem referenzierten Protokoll Nr.1.</li>
	<li>Tauen Sie auf und erweitern Sie kryokonservierten hNCs und einmal in der Monolayer Kultur mit standard Nährmedium bei 37 ° C. Zellen am Zusammenfluss von 80-90 % mit 0,5 % Trypsin/EDTA-Lösung zu lösen und zählen mit einem Trypan blau Ausgrenzung Protokoll. Alle Experimente wurden mit hNCs in der Passage 2 durchgeführt.</li>
	<li>Aufschwemmen der hNCs 100 x 106 Zellen/ml innerhalb von 300 µL Kulturmedium mit fötalen Rinderserum 10 %, 1 % Penicillin-Streptomycin und 50 µg/mL Ascorbinsäure, in Vorbereitung für die Mischung mit den Bioink ergänzt.</li>
	<li>Mischung die hNC-Zellsuspension in einem Nanocellulose/Alginat basiert Bioink folgenden die Passive mischen Einheit Protokoll im Verhältnis 10:1 Bioink:cell Federung, eine endgültige Zellkonzentration von 9 x 106 Zellen/mL zu erhalten.</li>
	<li>Sicherstellen Sie, dass die Bioprinter über UV-Exposition und wischen sich mit 70 % Ethanol sterilisiert wird. Sterilität zu erhalten, indem man in eine laminare Strömung Kabinett.</li>
	<li>Die Kartuschen mit den Bioink/Zelle Aussetzung Mischungen sterile drucken Düsen beimessen und in die Bioprinter einfügen.</li>
	<li>Kalibrieren Sie den Bioprinter entweder manuell oder durch die Protokolle für den Drucker spezifisch.</li>
	<li>Stimmmuster der Gitter-strukturiert, Zelle-beladenen Konstrukte, die mit den folgenden Parametern Druck: 25G konische Düse mit einem Druck von 25 kPa. Stimmmuster zellfreie Konstrukte (gemischt mit Zelle Medium enthält keine Zellen) als Kontrolle.</li>
	<li>Vernetzen Sie die Konstrukte durch Hinzufügen einer Ionenlösung 100 mm CaCl2 für 5 min. Spülen die Konstrukte zu und inkubieren Sie in Kulturmedium unter standard Kulturbedingungen (37 ° C, 5 % CO2und 95 % Relative Luftfeuchtigkeit). Wechseln Sie das Medium jeden zweiten oder dritten Tag.</li>
	<li>Sammeln Sie Proben zur histologischen Untersuchung bei 2 und 4 Wochen. Führen Sie die Proben für die GAG-Produktion mit Alcian Bläue18zu Flecken.</li>
</ol>
5. Bioprinting des Haut-Analoga mit zwei Zelltypen
<ol>
	<li>Zeichnen Sie ein 3D-Modell des gewünschten Gewebes analoge und umwandeln in eine Datei Gcode für Bioprinting. Laden Sie die Gcode-Datei auf die Bioprinter. Hinweis: In diesem Protokoll wurde eine quadratische Struktur mit Maße 4,8 x 4,8 x 0,9 mm3 als STL-Datei exportiert. Dann eine Gcode-Datei von der Gitterstruktur mit folgenden Einstellungen generiert wurde: Schichtdicke, 0,3 mm; Füllung Muster, geradlinig; Ausfachung Dichte, 25 %; 10 mm/s Geschwindigkeit.</li>
	<li>Bereiten Sie die Zellen zum Mischen in der Bioink für Bioprinting. Für die Herstellung von Haut-Analoga wurden zwei Zelltypen eingesetzt. Die zwei Zelltypen wurden in die Bioink und Bioprinting gemischt.<ol>
		<li>Erhalten Sie primär HDF. Pflegen Sie diese Zellen in DMEM Wachstumsmedien ergänzt mit fötalen Rinderserum 10 %, 1 % Penicillin-Streptomycin und 50 µg/mL Ascorbinsäure. Zellen am Zusammenfluss von 80-90 % mit 0,5 % Trypsin/EDTA Lösung und Graf zu lösen.</li>
		<li>Isolieren Sie und Tiefgefrieren Sie primäre hNC von Patienten nach dem referenzierten Protokoll Nr.1. Auftauen und kryokonservierten hNCs in Monolayer Kultur zu erweitern. Zellen am Zusammenfluss von 80-90 % mit 0,5 % Trypsin/EDTA Lösung und Graf zu lösen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Beide Zelltypen 100 x 106 Zellen/ml innerhalb von Wachstumsmedien aufzuwirbeln. Mischen Sie die Zellsuspensionen zusammen im Verhältnis 1:1, eine totale Endkonzentration von 100 x 106 Zellen/mL in 300 µL der Medien zu erreichen.</li>
	<li>Mischung 50: 50-Zellsuspension HDF und hNC in einem Nanocellulose/Alginat basiert Bioink folgenden die Passive mischen Einheit Protokoll im Verhältnis 10:1 Bioink:cell Federung, eine endgültige Zellkonzentration von 9 x 106 Zellen/mL zu erhalten.</li>
	<li>Sicherstellen Sie, dass die Bioprinter sterilisiert wird oder sich in einem Laminar-Flow Kabinett befindet zu Sterilität.</li>
	<li>Die Kartuschen mit den Bioink/Zelle Aussetzung Mischungen sterile drucken Düsen beimessen und in die Bioprinter einfügen.</li>
	<li>Kalibrieren der Bioprinter entweder manuell oder die Protokolle für den Drucker spezifisch.</li>
	<li>Stimmmuster der Gitter-strukturiert, Zelle-beladenen Konstrukte, die mit den folgenden Parametern Druck: 25G konische Düse mit einem Druck von 25 kPa. Stimmmuster zellfreie Konstrukte (gemischt mit Zelle Medium enthält keine Zellen) als Kontrolle.</li>
	<li>Vernetzen Sie die Konstrukte durch Hinzufügen einer Ionenlösung 100 mm CaCl2 für 5 min. Spülen die Konstrukte zu und inkubieren Sie in Kulturmedium unter standard Kulturbedingungen (37 ° C, 5 % CO2und 95 % Relative Luftfeuchtigkeit). Wechseln Sie das Medium jeden zweiten oder dritten Tag.</li>
	<li>Sammeln Sie Proben zur histologischen Untersuchung bei 2 und 4 Wochen. Färben Sie die Proben für Kollagen ich Produktion mit einem Masson trichrome Fleck19.</li>
</ol>

<ol>
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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li></ol>

Die Autoren dieser Handschrift sind Mitarbeiter von CELLINK LLC.

Wie in diesem Manuskript gezeigt hat, waren pre-cellularized Bioinks Bioprinted zu fabrizieren entweder Knorpel oder Haut Analoga, die für bis zu 4 Wochen gezüchtet wurden. Zellviabilität nach dem Mischen mit der Passive Einheit Mischtechnik war höher als die herkömmliche Vermischung. Darüber hinaus ist die Vereinfachung der der Mischprozess mit Mischeinrichtung minimiert die Anzahl der Schritte Handhabung und ermöglicht eine bessere Konsistenz in das Ausmaß der Vermischung. Letztendlich führt dies zu besseren Reproduzierbarkeit in beiden Zelle Verteilung innerhalb der Bioink und über Konstrukte und experimentellen Gruppen. Ablagerung von Gewebe spezifische ECM-Komponenten wie GAGs und Kollagen wurde ich für den Knorpel und Haut Analoga, jeweils nach 4 Wochen der Kultur beobachtet. Dies zeigt die Flexibilität die Mischtechnik und die gewählten Konstrukt Geometrie, verschiedene Gewebe Ziele zu fabrizieren. Die Herstellung von Knorpel und Haut Analoga ausgestellt die Flexibilität der Nutzung einer Nanocellulose-Alginat-Bioink und die Bioprinting-Technik für verschiedene technische Gewebe Ziele. Wir besprechen zwei Bestandteile der Studie unten: (1) die Passive Einheit Technik und (2) das Verhalten von Zellen innerhalb von Knorpel und Haut Analoga mischen.
Die Entwicklung und die Optimierung der Technik für die Vermischung von eine Zellsuspension in einer Bioink war von höchster Bedeutung für die Herstellung von diese Konstrukte. Im Gegensatz zu traditionellen niedrigviskos Hydrogel Materialien führte die hohe Viskosität der Bioinks zu Schwierigkeiten bei der Pre-cellularization von einem Bioink vor dem Druck. Als Alternative zur traditionellen Methode der Zelle Einbeziehung in ein Bioink ein Protokoll für die einstufige mischen eine Zellsuspension in eine zähflüssige Bioink entwickelt und diskutiert. Darüber hinaus wurde die praktische Anwendung dieser Mischtechnik in der Herstellung von Gewebe Konstrukte bewertet. Dieser Schritt mischen Ansatz hat mehrere Vorteile gegenüber traditionellen Techniken enthalten kontrollierte mischen Mischungsverhältnis, Minimierung der Schubspannungen hoch und unregelmäßig, und ein geschlossenes System, Probe zu beseitigen mischen Schiffe schließen. Es gibt jedoch einige wichtige Schritte in diese Technik, um dessen Vorteile gegenüber traditionellen Methoden für die Zelle/Bioink Mischung zu gewährleisten. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Zellen in der Zelle-Spritze ausgesetzt sind und gut vor dem Mischen gemischt. Zu groß für eine zeitliche Lücke zwischen der Aufhebung und der Transfer der Zellen in der Spritze und ab kann der Mischprozess Zellen zu sedimentieren, wodurch unebene mischen und Verteilung in einem gedruckten Filament führt. Sedimentation ist beobachteten, einfache Umkehrung (2-3 Mal) der die passive mischen Montage unmittelbar vor dem Mischen ausreichen, um die Zellen Aufschwemmen und gewährleisten eine gleichmäßige Verteilung vor dem mischen. Es ist auch wichtig, dass Luftblasen in die Spritzen beseitigt sind oder minimiert vor um sicherzustellen, dass das Mischungsverhältnis konstant bleibt. Wenn größere Luftblasen in der Patrone Bioink vor dem Mischen zu bleiben, empfiehlt es sich, dass die Lösung durch die Mischeinheit eine zusätzliche Zeit ausgeführt werden, um gute Durchmischung zu gewährleisten. Wenn Luftblasen verbleiben, kann sanfte klopfen der Druck Patrone/Spritze verbleibenden Luftblasen verdrängen. Darüber hinaus Wenn mehrere Material Mischung (mehrere mischen Einheiten oder Materialien) für komplexere Konstrukte erforderlich ist, müssen die Konzentrationen von Bioinks/Zellsuspensionen gemischt werden angepasst werden, um sicherzustellen, dass nach Verdünnung durch Mischen, die richtige Endkonzentration wird noch erreicht.
Im Vergleich zu anderen Mischtechniken ist die passive Mischeinheit einen neuartigen Ansatz zur Bioinks cellularize. Im Gegensatz zu anderen mischen Techniken wie dual Spritze mischen und unter Rühren mit einem Spatel oder einem anderen Werkzeug ermöglicht die passive Mischeinheit mehr Kohärenz bei der Mischung für Chargen und Benutzer. Die Art der manuellen mischen Techniken wie ein Spachtel mischen, führt zu mehr User-to-User-Variante in Umfang und Preis des Mischens. Darüber hinaus haben geschlossene Systeme wie die Passive Einheit und dual Spritze mischen mischen wenig bis gar keine Probenverlust im Vergleich zum Handbuch mischen in einer Petrischale oder Rohr.
Beide Gewebe-Analoga hergestellt in diesem Manuskript bestand aus einer einzigen Art von Bioink und ein oder zwei Zelltypen. Jedoch möglicherweise die Bioprinting der Gewebe-Analoga, die Architekturen, die Regionen unterschiedliche Bioinks mit unterschiedlichen Zelltypen enthalten bestehen notwendig für die Herstellung von mehr physiologische Gewebe Konstrukte20,21, 22. Spezialisierter Bioinks mit einzigartigen Kompositionen oder Funktionalitäten durch das Mischen von mehreren Arten von bestehenden Bioinks zusammen, um materialübergreifenden Bioinks erstellen, die unterschiedliche Kompositionen oder Funktionalitäten23erzeugt werden, 24. Dies ist besonders wichtig bei Übergangsregionen Gewebe wie Haut, subkutane Schicht oder der Knorpel Region eines Gewebes Knochen wo ein Gefälle von Bioink Zusammensetzung25,26 Entwicklung gewährleisten kann notwendig sein, möglicherweise Diese kritischen Regionen in nativen Gewebe27gefunden. Darüber hinaus könnte eine Mischeinheit genutzt werden, um in Wachstumsfaktoren und Morphogens in der Bioinks vor dem Bioprinting mischen. Die Beseitigung von Probenverlust mit geschlossenen Mischsystem ist attraktiv für den Einsatz von teuren und niedrige Konzentration bioaktive Faktoren, wo kann eine Änderung auf ihre Endkonzentration innerhalb der Bioprinted-Konstrukt Probenverlust ergeben, insbesondere dann, wenn Gradienten sind beteiligt.
Eine Einschränkung mit jedem Mischtechnik, einschließlich die Passive Einheit in dieser Studie verwendeten mischen ist das Risiko von Schäden an mechanisch empfindlichen Zelltypen. Zum Beispiel solche Stammzellen isoliert von induzierten pluripotenten Stammzellen, Knochenmark oder Embryo sind anfälliger für Beschädigungen28,29. Der Akt des Mischens vermittelt abnorme mechanische Belastungen auf die Zellen durch die Scherkräfte an den Mischprozess beteiligt, und sie müssen gegeneinander abgewogen werden, um Rentabilität30zu bewahren. Während die Verwendung von primäre Fibroblasten und Chondrozyten in dieser Studie gute Lebensfähigkeit (Abbildung 2) geführt, sind weitere Studien notwendig, um sicher mischen Preise und Quoten für empfindlichere Zelltypen zu bestimmen. Bis dahin empfiehlt es sich, dass die Vermischung durchgeführt werden, unter einer konstanten langsamen Rate um Rentabilität zu maximieren. Darüber hinaus war die Zelldichte in dieser Studie ausgewählt basierend auf früheren Studien1bestimmt. Diese Zelldichte möglicherweise nicht ideal für alle Zelltypen.Vor allem führen Mischung Zellen mit einer höheren Konzentration erhöhte Zell-Zell-Kontakten, die Lebensfähigkeit der Zellen und Gewebe Bildung31,32verbessern können. In ähnlicher Weise könnte die passive Mischeinheit auf mischen Zelle Sphäroide oder andere Zelle Aggregate33 in Bioinks anwendbar.
Wie vorgeschlagen und gezeigt in dieser Studie eine Passive Einheit Mischsystem eine zähflüssige Bioink schnell eine Zellsuspension verschmelzen kann. Während das Risiko für mechanische Schäden an den Zellen noch bleibt, ermöglicht der Ansatz mehr Kohärenz bei der Vermischung innerhalb einer einzigen Studie und Benutzern. Pre-cellularized Bioinks unter Verwendung dieses Ansatzes wurden verwendet, um beide Knorpel zu fabrizieren und Hautpflege-Analoga, die für bis zu 4 Wochen kultiviert wurden, und Ablagerung von Gewebe spezifische ECM Marker demonstriert. Zukünftige Studien konzentrieren sich auf die Nutzung der passiven Einheit Mischsystem um spezialisierte Bioinks aus standardisierten Bioinks für die Herstellung von komplexen Gewebe Analoga zu mischen.

Dreidimensionale (3D) Bioprinting Technologie geworden in den letzten Jahren besser zugänglich für Forscher, so dass die Technik für die Herstellung von Gewebe Analoga häufiger genutzt werden. Bioprinting verspricht, biomedizinischen Forschung zu revolutionieren, indem erleichtern die schnelle und wiederholbare Herstellung von vielfältigen Gewebe Konstrukte. Die Crux der Bioprinting Technologie liegt in der Fähigkeit, genau zu steuern, die Ablagerung von Biomaterialien (bekannt als Bioinks) in drei Dimensionen. Dies ermöglicht die Erzeugung von komplexen Gerüsten mit unterschiedlichen Regionen von Matrix Zusammensetzungen, bioaktive Faktoren und Zellen, die genauer native Gewebestruktur rekapitulieren können.
Bioprinting ist für die Herstellung von Konstruktionen für viele Gewebe Anwendungen einschließlich Knorpel1, Haut2, Muskel3und Knochen4verwendet worden. Diese Gewebe sind attraktiv für Bioprinting durch ihre intrinsische gekerbten Mikro-Architekturen, die Reprise über Schicht für Schicht Ablagerung geeignet sind. Insbesondere besitzt Haut eine wohldefinierte mehrschichtige Struktur5, geeignet für die Herstellung durch Layer-by-Layer Deposition Techniken wie Bioprinting. Darüber hinaus Bioprinting kann genutzt werden, um Konstrukte zu generieren, die die notwendigen anatomischen Dimensionen besitzen und Formen, um das Gewebe zu reparieren defekt. Biomaterialien mit patientenspezifischen Größe und Form6 generieren kann damit beginnen, die Nachfrage nach teilweise Reparaturen von vielen Geweben einschließlich aber nicht beschränkt auf Knochendefekten, Knorpelschäden und deren Umfang von variiert Hautläsionen Patient zu Patient.
In dieser Studie wurden zwei Gewebe-Analoga (Gelenkknorpel und Haut) durch die Bioprinting pre-cellularized Bioinks hergestellt. Gewährleistung angemessener Mischung von Bioink mit Zellsuspension, die einheitliche Zelle Verteilung sicherstellen kann, während die Erhaltung der Zellviabilität kann eine Herausforderung sein. Bioinks geeignet für Bioprinting über Extrusion sind oft hoch viskosen und erfordern daher umfangreiche mischen, um eine homogene Mischung zu gewährleisten. Mechanische Schäden an den Zellen kann unter harten mischen Bedingungen auftreten und nachteilige Auswirkungen Lebensfähigkeit. Studien haben gezeigt, dass die meisten Zelltod beim Inkjet-Druck während der Zubereitung wie das Mischen von7,8auftritt. Während herkömmliche Vermischung mit Agitation9 für niedrigviskose Bioinks geeignet für Inkjet-Druck10ausreichend sein kann, ist Vermischung von Zellen in eine hohe Viskosität Bioink besser geeignet für Extrusion Bioprinting schwieriger. Adressierung dieses Bedürfnis, ist die Verwendung von Mischdüsen für die Beimischung von Bioinks während der Druck Prozess11populärer geworden. Diese Armaturen wurden auch weit verbreitet in der Mikrofluidik-Forschung genutzt, wo das Mischen von Flüssigkeiten mit niedrigen Reynolds-Zahl wichtiger12ist. Die Nutzung von ein kontinuierliche Mischprozess eine Zellsuspension in eine Bioink Mischung würde Gleichförmigkeit während des Druckvorgangs ermöglichen. Jedoch da Zellsuspensionen niedrigen Viskosität im Vergleich zu einem Bioink besitzen, werden Schwierigkeiten ergeben sich bei der Verhinderung der Sedimentation der Zellen während der Druck Prozess9,13,14. Alternativ kann die Vermischung von Zellen in einem Bioink vor dem Druck dieses Problem anzugehen.
Zur Minimierung von Zelltod während der Mischung in eine Bioink entwickelten wir ein Verfahren auf der Grundlage einer passiven Mischanlage Zellen mit einer Bioink in die minimale Anzahl der Schritte zu verschmelzen. Der chaotische Mischung erzeugt durch die Strömung der Materialien durch die Mischeinheit ist ausreichend, um reproduzierbar Mischung zwei Komponenten zusammen15,16. Diese Methode wurde in erster Linie entwickelt, um die Vermischung von jedem Zellsuspension mit jedem Bioink, geeignet für Extrusion Bioprinting zu vereinfachen. Die Anzahl der Schritte in den Mischprozess wurde minimiert, um User-to-User-Variante beim Mischen zu beseitigen. Übermäßige mischen Schritte kann zeitaufwendig und gilt nicht für alle Bioinks, besonders wenn Zellen beteiligt sind. Sekundäre, wollten wir einen Mischvorgang zu entwickeln, war eigenständige Sterilität bewahren und Probenverlust zu minimieren.
In dieser Handschrift zeigen wir die Vermischung von eine Zellsuspension mit einem Bioink mit einem passiven Einheit Mischtechnik, die minimiert Handhabung und führt zu hohen Zelle Lebensfähigkeit und gleichmäßige Verteilung. Diese pre-cellularized Bioinks sind dann genutzt, um Stimmmuster Knorpel oder Haut zu konstruieren, mit ein oder zwei Zelltypen, bzw., die für bis zu 6 Wochen kultiviert werden. Der Bioink verwendet ist ein Alginat-Nanocellulose Mischung, die Eignung für Bioprinting1zuvor gezeigt hat.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>STARTINK Kit</td>
			<td>CELLINK</td>
			<td>SK0001</td>
			<td>Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Kit for the analysis of cell viability after mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson&#39;s Trichrome</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT15-1KT</td>
			<td>Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B8438-250ML</td>
			<td>Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INKREDIBLE+ bioprinter</td>
			<td>CELLINK</td>
			<td>Gen1+</td>
			<td>Printer utilized in the study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with Glutamax</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10566016</td>
			<td>Media for culture of the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% fetal bovine serum</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A3160402</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>live cell imaging solution</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>component utilized using live/dead imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td>microscope utilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a digital color camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XC10</td>
			<td>microscope camera utilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens imaging software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>n/a</td>
			<td>stock software with the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>n/a</td>
			<td>open source image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>n/a</td>
			<td>software for statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slic3r software (v1.2.9)</td>
			<td>Slic3r</td>
			<td>n/a</td>
			<td>open-source software to convert .stl file to gcode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary adult human dermal fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-201-012</td>
			<td>cell source for fibroblasts</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization

Bioprinting ist eine leistungsfähige Technik für die schnelle und reproduzierbare Herstellung von Konstrukte für Tissue engineering-Anwendungen. In dieser Studie wurden die Knorpel und Haut Analoga nach Bioink Pre-cellularization nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik hergestellt. Diese Technik wurde entwickelt mit dem Ziel, die Arbeitsschritte bei der Vermischung von eine Zellsuspension in einem hochviskosen Bioink zu vereinfachen. Die Auflösung der Filamente hinterlegt durch Bioprinting erfordert die Sicherstellung der Einheitlichkeit in der Zelle Verteilung vor dem Druck zu vermeiden, die Ablagerung von Regionen ohne Zellen oder Aufbewahrung von großzellige Klumpen, die die Nadel verstopfen können. Wir zeigen die Fähigkeit, rasch eine Zellsuspension mit einem Bioink vor der Bioprinting von Knorpel und Haut Analoga zu mischen. Beide Gewebe-Analoga konnte bis zu 4 Wochen kultiviert werden. Histologische Analyse ergab Zellviabilität und Ablagerung von Gewebe spezifische extrazelluläre Matrix (ECM) Marker wie Glykosaminoglykane (GAGs) und Kollagen ich jeweils.

Ergebnisse in dieser Handschrift sind in zwei Abschnitte unterteilt. Zunächst wurde die Zellviabilität nach dem Mischen mit der mechanischen Methode oder die passive Mischeinheit analysiert. Als nächstes wurden die Knorpel und Haut Konstrukte kultiviert und für entsprechenden histologischen Marker analysiert.
Zelle Verteilung erschien in beiden Fällen homogen. Die Aktion der Vermischung von Hand mit einem Spatel (Abbildung 2b) hat jedoch mehr Varianz als Vermischung mit einer passiven Mischanlage (Abbildung 2eine). Umfang, Geschwindigkeit und Mischtechnik mit einem Spatel ist stark abhängig von der Benutzer. Allerdings mischen Zellen in einem Bioink mit einer passiven Mischanlage standardisiert mischen und Variation in Chargen minimiert. Darüber hinaus die 30, 60 und 90 s mischen Zeit Mai für das Mischen von einer großen Menge von Zellen in eine große Menge an Bioink nicht ausreichen. Strenger mischen durch Vermischung mit einem Spatel kann erforderlich sein. Im Vergleich dazu unter Verwendung einer passiven Mischanlage besser behält das Mischungsverhältnis der Zellen, um Bioink während mischen und sorgt dafür, dass eine homogene Durchmischung erfolgt. Darüber hinaus ist Probenverlust ein Anliegen mit traditionellen mischen Techniken wo kann Bioink in den Petrischalen, Röhren und mixing-Tools aufgrund ihrer hohen Viskosität zurückgelassen werden. Die Zellviabilität war hoch zum Mischen mit einer Mischanlage (&#62; 90 %) 1, 2 oder 3 Mal. Wenn der passive Mischeinheit genutzt wurde, nahm das Mischen ca. 1 min langsam mischen konstanter Geschwindigkeit. Während mit einem Spatel mischen hohe Rentabilität ausgestellt nach dem Mischen für 30 und 60 s, mehr als 90 s mischen führte zu einem deutlichen Rückgang der Rentabilität im Vergleich zu den anderen Fraktionen (77,9 ± 14 %, p &#60; 0,05) (Abbildung 2c). Dies ist möglicherweise aufgrund übermäßigen mischen, die die Zellen schädigt. Langfristige lebenden/Toten Färbung nach 14 Tagen und 28 Tagen der Kultur ist in ergänzende Abbildung1dargestellt. Zellen beginnen, bis zum Tag 14, Verbreitung und verteilen sich hoch am 28. Tag und gute Lebensfähigkeit anzugeben.
Nach Kultur wurden Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga durch Histologie analysiert. Analyse der Knorpel Konstrukte am Tag 0, 14 und 28 zeigt eine Zunahme der Quantität und Abdeckung der GAGs wie gezeigt durch eine Alcian blau Fleck (Abbildung 3A-3_c). Das Fehlen des Flecks ist am Tag 0, bemerkt, während am Tag 14 Färbung auf Standorte proximal zu den Zellen beschränkt ist. Jedoch am 28. Tag der Kultur Alcian blau in das Konstrukt, demonstrieren die Bildung einer Chondrocytic ECM gefunden. Bioprinted Haut Konstrukte wurden durch histologische Färbung des Kollagens ich unter Verwendung eines Masson Trichrome Fleck (Abbildung 3-d-3f) analysiert. Ähnlich wie bei der Knorpel-Konstrukte, ausgestellt Tag 0 Proben keine Ablagerung von Kollagen. Bis zum Tag 14 der Kultur wurden erhebliche Ablagerungen von Kollagen um die Zellen und entlang der Oberfläche des Konstrukts festgestellt. Dies wurde verstärkt durch Tag 28, wie dicht Kollagen Schichten auf der Oberfläche Konstrukt und innerhalb der Großteil gefunden wurden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56372/56372fig1.jpg"> 
Abbildung 1 : Passive Einheit Mischsystem. (ein) 1 mL Spritze für Zellsuspension, (b) 12 mL Spritze mit Bioink, (c) Dosiereinheit, passive Mischeinheit (d), (e) Füllung Patrone, (f) die Montage der Bioink Spritze (1) und Zelle Aussetzung Spritze (2) in der Dosiereinheit, Befestigung der passiven Mischeinrichtung zum Jahresende sowohl Spritzen (3), (g) Befestigung des weiblich-weiblich Luer Lock Stecker (4) und Anlage der Füllung Patrone (5) schließt die Versammlung, (h ) komprimieren die Dosiereinheit um die Rührschüssel (6), (ich) prime weiterhin drücken Sie auf die Dosiereinheit zu mischen die Zellsuspension mit den Bioink und in die Füllung Patrone (7) zu verzichten. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56372/56372fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56372/56372fig2.jpg"> 
Abbildung 2 : Zelle Lebensfähigkeit Bilder und Analyse. Repräsentative Bilder zeigen live (grün) und menschlichen Fibroblasten Toten (rot) nach dem Mischen mit der Einheit 1, 2 oder 3 Mischzeiten Passive (ein) oder Spachtel für 30, 60 oder 90 Sekunden (b) und 3D Culture für 1 Tag. Bilder bei 4 X Vergrößerung angezeigt werden. Maßstabsleisten zeigen 200 µm. (c) Prozent durchschnittliche Rentabilität von menschlichen Fibroblasten nach dem Mischen mit der Passive Einheit oder Spachtel und 3D Culture für 1 Tag zu mischen. Fehlerbalken zeigen, Mittelwert, Standardabweichung * 0,005. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56372/56372fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56372/56372fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Gewebe spezifische extrazelluläre Matrix Deposition. Bioprinted Knorpel Konstrukte gebeizt für Glykosaminoglykane Nutzung Alcian blau an (einen) Tag 0, (b) 14 und (c) 28. Bilder mit 5 X Vergrößerung. Bioprinted Haut Konstrukte für Kollagen ich mit Masson Trichrome (d) am Tag 0, (e) 14, gebeizt und (f), 28. Bilder mit 5 X Vergrößerung. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56372/56372fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/56372/56372supfig1.jpg"> 
Zusätzliche Abbildung1: Zellviabilität an Tag 14 (ein) und 28 (b). Maßstabsleiste beträgt 200 µm, grün bezieht sich Zellen Leben, rot auf abgestorbenen Zellen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56372/56372supfig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Knorpel und Haut Analoga wurden Bioprinted mit einem Nanocellulose-Alginat-basierten Bioink. Die Bioinks wurden vor dem Druck über einen einzigen Schritt passive Mischeinheit cellularized. Die Konstrukte wurden demonstriert werden gleichmäßig cellularized, haben hohe Rentabilität und günstige Marker der Differenzierung aufweisen.

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.5K Aufrufe.  CELLINK LLC. Knorpel und Haut Analoga wurden Bioprinted mit einem Nanocellulose-Alginat-basierten Bioink. Die Bioinks wurden vor dem Druck über einen einzigen Schritt passive Mischeinheit cellularized. Die Konstrukte wurden demonstriert werden gleichmäßig cellularized, haben hohe Rentabilität und günstige Marker der Differenzierung aufweisen.

Serie: Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

Density Gradient Multilayered Polymerisation (DGMP): A Novel Technique für das Erstellen von Multi-Fach, Anpassbare Scaffolds für das Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Forschung

Biotechnik

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the engineered pDNA is administered to the vaccines, it is transcribed and translated into immunogen proteins that can elicit responses from the immune system. Many ways of delivering DNA vaccines have been investigated; however each delivery route has its own advantages and pitfalls. Skin tattooing is a novel technique that is safe, cost-effective, and convenient. In addition, the punctures inflicted by the needle could also serve as a potent adjuvant. Here, we a) demonstrate the intradermal delivery of plasmid DNA encoding enhanced green fluorescent protein (pCX-EGFP) in a mouse model using a tattooing device and b) confirm the effective expression of EGFP in the skin cells using confocal microscopy.

Skin tattooing is a potent and safe way to delivery DNA vaccine intradermally. Here, a DNA plasmid encoding EGFP is delivered by tattooing to the skin of a laboratory mouse, and the expression of EGFP in the skin cells is then inspected by confocal microscopy.

Haut Tätowieren als einen neuartigen Ansatz für DNA Vaccine Lieferung

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting cellularized Konstruiert unter Verwendung eines gewebespezifischen Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Automatische Robotic Dosiertechnik für Oberflächen Ausrichtungs- und Bioprinting von Zellen

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

Eine neue Technik zur Erzeugung und Observing Chemilumineszenz in einem biologischen Rahmen

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Eine neuartige Tenorrhaphy-Nahttechnik mit tissue engineered Collagen Graft zur Reparatur großer Sehnendefekte

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by shear stress and improve the survival of the encapsulated cells. However, rapid gravity-driven cell sedimentation in the reservoir could lead to an inhomogeneous cell distribution in bioprinted structures and therefore hinder the application of liquid-like bioinks. Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (e.g., gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells. Multiple liquid interfaces were manipulated in the multilayered bioink to provide interfacial retention. Consequently, the cell sedimentation action going across adjacent layers in the multilayered system was retarded in the bioink reservoir. It was found that the interfacial retention was much higher than the sedimental pull of cells, demonstrating a critical role of the interfacial retention in preventing cell sedimentation and promoting a more homogeneous dispersion of cells in the multilayered bioink.

Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells.

Verwendung von mehrschichtigem Hydrogel Bioink im dreidimensionalen Bioprinting für homogene Zellverteilung

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...