Die Autoren möchten die folgenden Organisationen danken: National Natural Science Foundation of China (31171018, 31171355), der Wissenschaft und Technik Abteilung Guangdong (2013KJCX0054), der naturwissenschaftlichen Grundlage der Provinz Guangdong ( 2014A030313418, 2014A030313440), Guangzhou Wissenschaft und Technologie Bureau (201607010320).

Tierhaltung und alle Tierarten, die Experimente wurden nach Verfahren genehmigt von der Ethikkommission für Tierversuche an South China Normal University, nach den Richtlinien für Animal Care vom National Institute of Gesundheit.
 1. Vorbereitung der Lösungen <ol><li>bereiten 500 mL standard künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) mit den Komponenten in unseren veröffentlichten Werk 7 beschrieben, wie in Tabelle 1 aufgeführt.
	<ol><li>Verwendung sauberes Glas Becher mit entionisiertem Wasser, eine frische ACFS Lösung vorzubereiten. Spachteln mit entionisiertem Wasser reinigen und trocknen, bevor Sie mit NaCl, KCl, NaH hinzufügen 2 PO 4, Nahco3 3, MgSO 4, D-Glucose, und fügen Sie das CaCl 2 nach haben sprudelte die Lösung mit 95 % O 2 / 5 % CO 2 Mischung für ~ 20 min (wie in Tabelle 1) bis 500 mL entionisiertem Wasser. Rühren, bis Sie vollständig aufgelöst.</li>
		<li>Stellen Sie sicher der ACFS völlig ist klar, ohne jede Niederschlag. Dann stellen Sie den pH-Wert auf 7.2-7.4. Blase mit einem Gasgemisch bestehend aus 95 % O 2 und 5 % CO 2 für ~ 20 min.</li>
	</ol></li> <li>250 mL Slice Cutting-Lösung mit den Chemikalien 7 in Tabelle 2 beschrieben vorbereiten.
	<ol><li>KCl, MgCl 2, NaH 2 PO 4, Nahco3 3, Choline·Cl, D-Glucose hinzufügen und fügen Sie das CaCl 2 zuletzt gemäß 1.1.1 bis 250 mL entionisiertem Wasser und auflösen wie in 1.1.1 und 1.1.2 beschrieben.</li>
		<li>Nach sprudeln mit 95 % O 2 / 5 % CO 2, stellen die Lösung in eine Tiefkühltruhe für 15-20 min, so dass die Cutting-Lösung wird eiskalt und teilweise gefrorenen. 
		Hinweis: Wir verwenden diese Cutting-Lösung bei der Scheiben von 1-2 Monate-alten Mäusen; die Formel für Mäuse, die älter als 2 Monate abweichen.</li>
		<li>Bereiten LPS Lösung durch Auflösen in sterilen Endotoxin-freie isotonische Kochsalzlösung (0,9 % NaCl). LPS ist intraperitoneal verabreicht (0,5 mg/kg) und mit der Aufnahme 2 h später.</li>
	</ol></li></ol> 2. Vorbereitung des präfrontalen Cortex Slice <ol><li>Cutting-Lösung aus dem Gefrierschrank nehmen und homogenisieren um ein Matsch zu erhalten. Legen Sie die Lösung auf dem Eis und Blase ständig mit 95 % O 2 / 5 % CO 2.</li>
	<li>Mit großen, scharfen Schere, schnell eine Maus als beschriebenen 9 enthaupten und sofort legte den Kopf in ein Becherglas gefüllt mit eiskalten (0-4 ° C) Schneidlösung.</li>
	<li>Schneiden Sie die Spitze des Schädels entlang der Mittellinie in Richtung kaudalen Nasal mit einer feinen Schere und die seitlichen Schädel Teile zu entfernen. Entfernen Sie das Gehirn mit einem feinen Spachtel und Drop ins eiskalte Schneidlösung. 
	Hinweis: Schritte 2.2-2.3 erfolgen schnell (im Idealfall &#60; 1 min).</li>
	<li>Legen Sie das Gehirn auf den Deckel einer 9 cm Petrischale mit Eis gefüllt. Spülen Sie das Gehirn mit eiskalten Schneidlösung. Das Kleinhirn und der Riechkolben mit einer Rasierklinge abgeschnitten.</li>
	<li>Anwenden Cyanacrylat-Klebstoff auf die Probe Inhaber einer Vibratome. Legen Sie vorsichtig den Gehirn-Block auf den Tropfen Klebstoff, rostral Seite nach oben, und sofort eintauchen in eiskaltes Schneidlösung.</li>
	<li>Einstellen den Klingenhalter Vibratome in einem Winkel von 15° mit Bezug auf die horizontale Ebene und bereiten 350 µm koronalen Gehirnscheiben (Klinge Schwingungsfrequenz = 85 Hz, Geschwindigkeit = 0,1 mm/s).</li>
	<li>Mit einer Pipette, die Scheiben in die Erholung-Kammer voller ACFS, Transfer inkubieren 1 h (bei RT) mit konstanten sprudeln von 95 % O 2 / 5 % CO 2.</li>
</ol> 3. Ganze Zelle Patch Aufnahme <ol><li>machen Glas Borosilikat Mikropipetten für als Aufnahme Elektroden verwenden oder Blätterteig Mikropipetten nach den vorgegebenen Richtlinien der Puller-Betriebsanleitung. Für die Aufzeichnung von Elektroden, Tipp Widerstände sind im Bereich von 4-6 M &#8486;, während Blätterteig Mikropipetten Spitze Durchmesser im Bereich von 2 bis 5 µm haben.</li>
	<li>Na +-Kanal-Blocker (TTX, 1 µM), Block schnell Na + Kanal und damit Aktionspotentiale zu ACFS hinzufügen und Verwalten von konstantem Volumenstrom dieser Lösung von 2-3 mL/min in der Kammer Aufnahme durch peristaltische Pumpe in die Kammer und streben aus ihm heraus. Blase der ACFS mit 95 % O 2 / 5 % CO 2 ständig um die Lebensfähigkeit der Scheiben gewährleisten.</li>
	<li>Übertragen eine Gehirn-Scheibe in der Aufnahme-Kammer mit einer modifizierten Pasteurpipette deren feiner Spitze geschnitten wurde, um die Scheibe Größe passen. Decken Sie die Scheibe mit einem Platin Slice-Anker mit parallel Nylonfäden Abstand &#8805; 2 mm auseinander, die Scheibe auf der Plattform zu halten.</li>
	<li>Füllen Sie die Aufnahme Mikropipette mit internen Lösung 7 (Tabelle 3), und füllen Sie die Blätterteig Mikropipetten mit GABA bei 10 µM, 50 µM und 100 µM (aufgelöst in ACFS) oder ACFS als Fahrzeugkontrolle.</li>
	<li>Gegen Verstopfung mit Schutt, üben Sie leichten positive Druck mit eine 1 mL Spritze vor die Aufnahme Elektrode in der ACFS eintauchen. Mit einem Mikromanipulator unter dem Mikroskop (4 X Objektiv), die Aufnahme Elektrode und Blätterteig Mikropipette so positionieren, dass die Spitzen in der Mitte des video-Bildes auf dem Monitor ( Abbildung 1 A) erscheinen.</li>
	<li>Stellen Sie den Mikroskop-Fokus (40 X Objektiv) schrittweise Senkung der Blätterteig Mikropipette und legen Sie es über das Neuron Aufnahmen in einem Winkel von 45°. Halten Sie den Abstand zwischen der Spitze des Blätterteig Mikropipette und das Neuron, aufgenommen zwischen 20-40 µm ( Abbildung 1 B). Nähern Sie langsam und vorsichtig das Neuron mit der Aufnahme-Elektrode und lassen Sie dann den positiven-Luftdruck. Eine schwache und kurze Absaugung durch den Schlauch angeschlossen, der Elektrodenhalter erstelle ich ein Giga-Ohm-Siegel bewerben.</li>
	<li>Pflegen die Spannung auf 0 mV. Nach Bildung der Giga-Ohm-Dichtung schnell kompensieren Sie und verlangsamen Sie Kapazität zu, manuell oder automatisch. Dann bewerben Sie sich eine kurze und starke Absaugung durch die Schläuche erwähnt, um in den gesamten Zelle Modus bekommen.</li>
	<li>Datensatz eIPSC in Voltage-Clamp-Modus. Die Blätterteig-Mikropipette mit einer Picospritzer durch einen Master 8 Schritt Generatorspannung gesteuert, einzeln oder paarweise GABA Puffs ( Abbildung 2) liefern niedrigen Gasdruck (Stickstoff, 4-6 Psi) zuweisen.</li>
	<li>Ändern die Blätterteig-Dauer um das beste eIPSC erzielen ( Abbildung 3) und Messen Sie die eIPSC in die LPS-induzierte Depression-Modell ( Abbildung 4).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres.">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li><li>Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+used+for+studying+synaptic+transmission+in+slices+of+mammalian+brain.">Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain.</a> Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).</li><li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus.">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li><li>Dickinson, G. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+determining+the+recruitment+of+inositol+trisphosphate+receptor+channels+during+calcium+puffs.">Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs.</a> Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Columnar+distribution+of+activity+dependent+gabaergic+depolarization+in+sensorimotor+cortical+neurons.">Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons.</a> Mol Brain. 5, 33 (2012).</li><li>Glykys, J., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+main+source+of+ambient+GABA+responsible+for+tonic+inhibition+in+the+mouse+hippocampus.">The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus.</a> J Physiol. 582, 1163-1178 (2007).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+modulates+KCC2+expression+and+function+in+hippocampal+GABAergic+inhibition.">APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+interleukin-1+and+endotoxin+in+the+forced+swim+and+tail+suspension+tests+in+mice.">Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice.</a> Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).</li><li>Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Patch-clamp+Recordings+from+the+Somatodendritic+Domain+of+Nigral+Dopamine+Neurons.">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Wondolowski, J., Frerking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit-dependent+postsynaptic+expression+of+kainate+receptors+on+hippocampal+interneurons+in+area+CA1.">Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1.</a> J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).</li><li>Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+regulates+Cav1.2+L-type+calcium+channel+levels+and+function+to+influence+GABAergic+short-term+plasticity.">Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity.</a> J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).</li><li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+Cortical+GABAergic+Dysfunction+Contributes+to+Aberrant+UP-State+Duration+in+APP+Knockout+Mice.">Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice.</a> Cereb Cortex. , (2016).</li><li>Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine+Acts+through+Nicotinic+Receptors+to+Enhance+the+Firing+Rate+of+a+Subset+of+Hypocretin+Neurons+in+the+Mouse+Hypothalamus+through+Distinct+Presynaptic+and+Postsynaptic+Mechanisms.">Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms.</a> eNeuro. 2 (1), (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Blätterteig-Anwendung ist weit verbreitet, postsynaptischen Rezeptor-Funktion3,4,7zu bewerten, sondern erfordert eine präzise Steuerung in jedem Experiment. Wir beschreiben hier ein Verfahrens unter Beteiligung ganz-Zell-Patch zu spannen, was beweist, dass GABA-Blätterteig IPSCs (z.B. eIPSCs) im präfrontalen kortikalen Gehirnscheiben induziert. Der Widerstand der Elektrode Aufnahme beträgt ca. 5 MΩ, während der Kopfkreis ...

Die Patch-Clamp-Technik, ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung von elektrischen Signale in Neuronen, wurde in den 1970er Jahren1,2entwickelt. Ein großer Vorteil dieser Technik ist, dass sie wissen wie bestimmte Behandlungen bietet (z. B. pharmakologische) neuronale Funktionen oder Kanäle in Echtzeit3verändern kann. Pharmakologische Bewertung der neuronalen Funktion während der gesamten-Zelle in einer Gehirn-Scheibe Aufzeichnung erfordert die Anwendung von Medikamenten, wie z. B. Agonisten oder Antagonisten von spezifischen Rezeptoren, die Neuronen aufgenommen wird. Diese Methode ermöglicht die Identifikation von neuronalen Veränderungen, die auftreten, nach der Anwendung eines bestimmten Medikaments, führt zu einem besseren Verständnis der physiologischen und pathologischen Eigenschaften der Neuronen-4. Obwohl pharmakologische Verwaltung über entweder Perfusion5 oder Blätterteig6durchgeführt werden kann, ist letzteres die überlegene Technik. Insbesondere: (i) Blätterteig Anwendung rasch erhöht Medikament Konzentration um das aufgezeichnete Neuron auf ein Niveau, so dass Desensibilisierung der Membranrezeptoren verhindert wird; (Ii) das Volumen der Droge aufgeblasen ist äußerst gering, so dass es kaum Auswirkungen auf die Bad-Lösung, die daher Nebenwirkungen der verabreichten Chemikalien auf Gehirnscheiben reduziert; (Iii) das Blätterteig-Protokoll kann eingestellt und gespeichert, so dass das Experiment sehr genau reproduzierbar; (iv) Blätterteig Anwendung steht für sparsamen Umgang mit Agonisten/Antagonisten, besonders wo solche Reagenzien sind teuer oder schwer zu erlangen.
Hier konzentrieren wir uns auf die ganze Zelle Ströme induziert durch schnaufend GABA in akut bereit Gehirnscheiben, ein Präparat, das hat den Vorteil, relativ gut erhaltene Hirnschaltkreisen Aufnahme. Wie führen wir Blätterteig-induzierte hemmenden Strömungen7 werden in diesem Artikel beschrieben werden. Mithilfe von Cäsium (Cs+)-interne Lösungen, und halten die Neuronen bei 0 mV, präsentieren wir GABA-Blätterteig hervorgerufen inhibitorischen postsynaptischen Ströme (eIPSCs) mit entsprechenden technischen Details. Mit einem Maus-Modell der Depression induziert durch Lipopolysaccharid (LPS) Injektion8, wir zeigen, dass die eIPSC ist Amplitude, hervorgerufen durch einen GABA-Zug in Scheiben von LPS injiziert Mäusen im Vergleich zu Kontrollen Fahrzeug deutlich reduziert. Unsere Absicht ist, dass dieser Artikel zeigen sollte, wie die Blätterteig-Technik ist überall anwendbar, Studien zur Bewertung der Wirkung von Chemikalien, Verbindungen oder Drogen auf neuronalen Aktivitäten im Gehirnscheiben.

<table><tbody><tr><td>Glass Borosilicate micropipettes</td><td>Shutter Instruments</td><td>BF150-86-10</td><td>1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter</td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Shutter Instruments</td><td>MODEL P-97&amp;nbsp;</td><td>Flaming/Brow Micropipette Puller</td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Shutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Computer controlled Amplifier&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Digital Acquisition system&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Camera</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>2115001</td><td>Inspection equipment</td></tr><tr><td>Microscopy&amp;nbsp;</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>Eclipse FN1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Master 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8 Pulse stimulator</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Slicer</td><td>Leica</td><td>VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Gillette</td><td>74-S</td><td>FLYING EAGLE</td></tr><tr><td>Video monitor</td><td>Panasonic</td><td>WV-BM 1410</td><td></td></tr><tr><td>502 Glue</td><td>Deli</td><td>7146</td><td>Cyanoacrylate Glue</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Shanghai JIA PENG Corporation</td><td>BT100-1F</td><td></td></tr><tr><td>Video Camera</td><td>Olympus America Medical</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipets</td><td>Biologix</td><td>30-0138A1</td><td></td></tr></tbody></table>

whole-cell currents induced by puff application of gaba in brain slices

Pharmakologische Verwaltung wird häufig verwendet, wenn Sie ganze Zelle Patch-Clamp in Hirnschnitten Aufnahme durchführen. Eine der besten Methoden der Zulassungsantrag bei der elektrophysiologischen Aufnahme ist der Blätterteig-Technik, die verwendet werden kann, um die Wirkung der pharmakologischen Reagenzien auf neuronalen Aktivitäten im Gehirnscheiben zu studieren. Der größte Vorteil der Blätterteig-Anwendung ist, dass die Wirkstoffkonzentration rund um den Ort der Aufnahme schnell erhöht und verhindert so die Desensibilisierung von Membranrezeptoren. Erfolgreichen Einsatz von Blätterteig Anwendung beinhaltet besondere Aufmerksamkeit auf die folgenden Elemente: die Konzentration des Medikaments, die Parameter der Blätterteig Mikropipette, der Abstand zwischen der Spitze des einen Blätterteig Mikropipette und das Neuron aufgenommen und die Dauer und Druck der Zug fahren (Pfund pro Quadratzoll, Psi). Dieser Artikel beschreibt ein schrittweises Verfahren zur Erfassung der ganzen Zelle Ströme induziert durch Gamma - Aminobuttersäure (GABA) auf ein Neuron eine präfrontalen kortikalen Scheibe schnaufend. Insbesondere kann das gleiche Verfahren mit geringfügigen Änderungen, andere Hirnareale wie Hippocampus und das Striatum und verschiedene Präparate, wie z. B. Zellkulturen angewendet werden.

Die Blätterteig-Technik erlaubt Forschern, die Wirkung von Medikamenten auf bestimmte Rezeptoren auf der Oberfläche eines bestimmten Neurons zu studieren. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf Strömungen durch GABA-Rezeptoren vermittelt. Abbildung 1 zeigt die Blätterteig und Aufnahme Mikropipetten. Keine Auswirkungen auf die aufgezeichneten Neuronen des physischen Drucks zu beseitigen durch das Blätterteig ACFS generiert und Saccharose Puffs (<stro...

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Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Whole-Cell Ströme induziert durch Blätterteig Anwendung von GABA im Gehirnscheiben

Wir beschreiben die Blätterteig-Technik, durch die pharmakologische Reagenzien können während der gesamten Zelle Patch-Clamp-Aufnahme verabreicht werden, und verschiedene Aspekte der Funktionen, die für den Erfolg entscheidend sind.

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

whole-cell-currents-induced-puff-application-gaba-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.3K Aufrufe.  South China Normal University. Wir beschreiben die Blätterteig-Technik, durch die pharmakologische Reagenzien können während der gesamten Zelle Patch-Clamp-Aufnahme verabreicht werden, und verschiedene Aspekte der Funktionen, die für den Erfolg entscheidend sind.

Serie: Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, respectively 4,5,6,7 The GABAA channel is a pentameric GABA-gated chloride channel. The channel subunits are grouped into 8 families (&alpha;1-6, &beta;1-3, &gamma;1-3, &delta;, &#949;, &theta;, &pi; and &rho;). Two alphas, two betas and one 3rd subunit form the functional channel 8. By combining studies of sub-type specific GABA-activated single-channel molecules with studies including all populations of GABAA channels in the neuron it becomes possible to understand the basic mechanism of neuronal inhibition and how it is modulated by pharmacological agents.
We use the patch-clamp technique 9,10 to study the functional properties of the GABAA channels in alive neurons in hippocampal brain slices and record the single-channel and whole-cell currents. We further examine how the channels are affected by different GABA concentrations, other drugs and intra and extracellular factors. For detailed theoretical and practical description of the patch-clamp method please see The Single-Channel Recordings edited by B Sakman and E Neher 10.

We use the patch-clamp technique to measure GABA-activated single-channel currents (GABAA channels, GABAA receptors) and the synaptic and tonic currents they generate in neurons. Activation of the channels decreases neuronal excitability in health and disease 1,2,3,4.

GABA-aktivierten Single-Channel-und Tonic Currents in Hirnschnitten der Ratte

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, ...

Forschung

Neurowissenschaften

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Slice It Hot: Akute erwachsenen Gehirn Slicing in physiologischen Temperatur

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the identification of novel molecules active in preclinical assays from an in vitro recombinant receptor to their pharmacological effects at native receptors in rodent brain slices. For compounds binding at the benzodiazepine site of the receptor, the first step is to set up a primary screen that consists of developing radioligand binding assays on cell membranes expressing the major GABAA subtypes. Then, taking advantage of the heterologous expression of rodent and human GABAA receptors in Xenopus oocytes or HEK 293 cells, it is possible to explore, in electrophysiological assays, the physiological properties of the different receptor subtypes and the pharmacological properties of the identified compounds. The Xenopus oocyte system will be presented here, starting with the isolation of the oocytes and their microinjection with different mRNAs, up to the pharmacological characterization using two-electrode voltage clamps. Finally, recordings conducted in rodent brain slices will be described that are used as a secondary physiological test to assess the activity of molecules at their native receptors in a well-defined neuronal circuit. Extracellular recordings using population responses of multiple neurons are demonstrated together with the drug application.

Here, we present protocols to discover compounds active at GABAA receptors, from the binding to the physiology and pharmacology.

Methoden für die Entdeckung der neuartige Substanzen modulieren einen Gamma - Aminobuttersäure-Rezeptor geben eine Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue

Controlling seizures remains a challenging issue for the medical community. To make progress, researchers need a way to extensively study seizure dynamics and investigate its underlying mechanisms. Acute seizure models are convenient, offer the ability to perform electrophysiological recordings, and can generate a large volume of electrographic seizure-like (ictal) events. The promising findings from acute seizure models can then be advanced to chronic epilepsy models and clinical trials. Thus, studying seizures in acute models that faithfully replicate the electrographic and dynamical signatures of a clinical seizure will be essential for making clinically relevant findings. Studying ictal events in acute seizure models prepared from human tissue is also important for making findings that are clinically relevant. The key focus in this paper is on the cortical 4-AP model due to its versatility in generating ictal events in both in vivo and in vitro studies, as well as in both mouse and human tissue. The methods in this paper will also describe an alternative method of seizure induction using the Zero-Mg2+ model and provide a detailed overview of the advantages and limitations of the epileptiform-like activity generated in the different acute seizure models. Moreover, by taking advantage of commercially available optogenetic mouse strains, a brief (30 ms) light pulse can be used to trigger an ictal event identical to those occurring spontaneously. Similarly, 30 - 100 ms puffs of neurotransmitters (Gamma-Amino Butyric Acid or glutamate) can be applied to the human tissue to trigger ictal events that are identical to those occurring spontaneously. The ability to trigger ictal events on-demand in acute seizure models offers the newfound ability to observe the exact sequence of events that underlie seizure initiation dynamics and efficiently evaluate potential anti-seizure therapies.

Acute seizure models are important for studying the mechanisms underlying epileptiform events. Furthermore, the ability to generate epileptiform events on-demand provides a highly efficient method to study the exact sequence of events underlying their initiation. Here, we describe the acute 4-aminopyridine cortical seizure models established in mouse and human tissue.

Generation und On-Demand Einleitung der akuten iktale Aktivität in Nagetier und menschlichem Gewebe

Controlling seizures remains a challenging issue for the medical community. To make progress, researchers need a way to extensively study seizure dynamics ...

Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect distinct cellular and network components of these circuits remains unclear. Ex vivo brain slices provide a means by which investigators may probe discrete components of complex networks and disentangle potential mechanisms underlying the effects of volatile anesthetics on evoked responses. To isolate potential cell type- and pathway-specific drug effects in brain slices, investigators must be able to independently activate afferent fiber pathways, identify non-overlapping populations of cells, and apply volatile anesthetics to the tissue in aqueous solution. In this protocol, methods to measure optogenetically-evoked responses to two independent afferent pathways to neocortex in ex vivo brain slices are described. Extracellular responses are recorded to assay network activity and targeted whole-cell patch clamp recordings are conducted in somatostatin- and parvalbumin-positive interneurons. Delivery of physiologically relevant concentrations of isoflurane via artificial cerebral spinal fluid to modulate cellular and network responses is described.

Ex vivo brain slices can be used to study the effects of volatile anesthetics on evoked responses to afferent inputs. Optogenetics are employed to independently activate thalamocortical and corticocortical afferents to non-primary neocortex, and synaptic and network responses are modulated with isoflurane.

Optogenetische Aktivierung afferenter Signalwege in Hirnschnitten und Modulation von Reaktionen durch flüchtige Anästhetika

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Recording Whole-Cell Currents with GABA Puffing in a Mouse Brain Slice

Source: Feng, Y. et al., <a href="https://app.jove.com/v/56387">Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the recording of whole-cell currents induced by gamma-aminobutyric acid, or GABA, in a mouse prefrontal cortical brain slice. Controlled delivery of GABA opens chloride channels in a postsynaptic neuron, generating inhibitory postsynaptic currents, or IPSCs. These IPSCs increase with higher GABA concentrations, reflecting GABA&#39;s inhibitory activity on synaptic transmission.

Aufzeichnung von Ganzzellströmen mit GABA-Puffing in einer Gehirnscheibe einer Maus

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Preparation of Solutions

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