Gli autori desidera ringraziare le seguenti organizzazioni: National Natural Science Foundation of China (31171018, 31171355), scienza e tecnologia divisione di Guangdong (2013KJCX0054), la Fondazione di scienze naturali della provincia di Guangdong ( 2014A030313418, 2014A030313440), Guangzhou scienza e tecnologia Bureau (201607010320).

Custodia degli animali e tutti gli animali sono stati condotti esperimenti secondo procedure approvate dal comitato etico per la ricerca animale presso South China Normal University, secondo le linee guida per la cura degli animali, istituito dall'Istituto nazionale di Salute.
 1. preparazione di soluzioni <ol><li>preparare 500 mL di standard cerebrospinale artificiale (ACSF) contenente i componenti descritti nel nostro lavoro pubblicato 7 come elencato nella tabella 1.
	<ol><li>Vetro pulito uso becher con acqua deionizzata per preparare una soluzione fresca di ACSF. Pulire la spatola con acqua deionizzata e asciugare prima dell'uso aggiungere NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-glucosio e aggiungere il CaCl 2 dopo aver fatto gorgogliare la soluzione con 95% O 2 / 5% CO 2 miscela per ~ 20 min (come descritto in dettaglio nella tabella 1) a 500 mL di acqua deionizzata. Mescolare fino a quando completamente sciolto.</li>
		<li>Assicurarsi la ACSF è completamente chiaro senza alcuna precipitazione. Quindi regolare il pH a 7,2-7,4. Bolla con una miscela di gas composta da 95% O 2 e 5% CO 2 per un minimo di 20 ~</li>
	</ol></li> <li>Preparare 250 mL di soluzione di taglio fetta che contiene i prodotti chimici 7 descritto in tabella 2.
	<ol><li>Aggiungere KCl, MgCl 2, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-glucosio e aggiungere il CaCl 2 Ultima come indicato al punto 1.1.1, 250 ml di acqua deionizzata e sciogliere come descritto in 1.1.1 e 1.1.2.</li>
		<li>Dopo spumeggiante con 95% O 2 / 5% CO 2, posizionare la soluzione in un congelatore per 15-20 min in modo che la soluzione di taglio diventa ghiacciata e parzialmente congelati. 
		Nota: Usiamo questa soluzione di taglio quando si effettuano le fette da 1-2 mese-vecchi topi; la formula può differire per topi più vecchi di 2 mesi.</li>
		<li>Soluzione di LPS preparare sciogliendo in soluzione salina sterile privo di endotossina isotonica (0,9% NaCl). LPS è somministrato per via intraperitoneale (0,5 mg/kg) e iniziare la registrazione dopo 2 h.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparazione della fetta di corteccia prefrontale <ol><li>prendere la soluzione di taglio fuori dal freezer e omogeneizzare per ottenere una granita. Mettere la soluzione sul ghiaccio e bolla costantemente con 95% O 2 / 5% CO 2.</li>
	<li>Utilizzando le forbici grandi, nitide, rapidamente decapitare un mouse come descritto 9 e subito messo la testa in un becher pieno di ghiacciata (0-4 ° C) soluzione di taglio.</li>
	<li>Tagliare la parte superiore del cranio lungo la linea mediana in direzione caudale--nasale con forbice e rimuovere le porzioni laterale del cranio. Rimuovere il cervello con una spatola fine e goccia in soluzione di taglio ghiacciata. 
	Nota: Passaggi 2.2-2.3 devono essere fatto rapidamente (idealmente &#60; 1min).</li>
	<li>Mettere il cervello sul coperchio di una scatola Petri 9 cm riempito con ghiaccio. Sciacquare il cervello con soluzione di taglio ghiacciata. Tagliare il cervelletto e bulbo olfattivo con una lama di rasoio.</li>
	<li>Colla del cianoacrilato applica alla provetta titolare di un vibratomo. Posizionare con cura il blocco di cervello su goccia di colla, rostrale rivolta verso l'alto e subito immergere in soluzione di taglio ghiacciata.</li>
	<li>Regolare il portalama del vibratome ad un angolo di 15° con riferimento al piano orizzontale e preparare 350-µm fette coronali del cervello (frequenza di vibrazione della lama = 85 Hz, velocità = 0,1 mm/s).</li>
	<li>Utilizzando una pipetta, trasferire le fette nella camera di recupero riempite con ACSF, incubare per 1 h (a RT) con costante ribollimento di 95% O 2 / 5% CO 2.</li>
</ol> 3. Intero-cellula Patch registrazione <ol><li>Make vetro Micropipette di borosilicato per utilizzare come elettrodi di registrazione o soffio Micropipette secondo le linee guida specifiche del manuale di Puller. Per la registrazione di elettrodi, punta resistenze sono nel range 4-6 M &#8486;, mentre soffio Micropipette hanno diametri di punta nella gamma 2-5 µm.</li>
	<li>Aggiungere stampo della scanalatura del Na + (TTX, 1 µM), blocco veloce Na + canale e quindi i potenziali di azione, a ACSF e mantenere una portata costante di questa soluzione di 2-3 mL/min in camera di registrazione, di pompa peristaltica nella camera e aspirazione fuori di esso. Bubble ACSF con 95% O 2 / 5% CO 2 costantemente per garantire la redditività delle fette.</li>
	<li>Trasferire una fetta di cervello nella camera di registrazione utilizzando una pipetta Pasteur modificata cui punta fine è stato tagliato per adattarsi alle dimensioni della fetta. Coprire la fetta con un ancoraggio di platino fetta con fili di nylon paralleli distanziati &#8805; distanziate per contenere la fetta sulla piattaforma di 2 mm.</li>
	<li>Riempire la micropipetta di registrazione con soluzione interna 7 (tabella 3) e riempire le micropipette puff con GABA a 10 µM, 50 µM e 100 µM (disciolto in ACSF) o ACSF come controllo del veicolo.</li>
	<li>Per prevenire l'occlusione con detriti, applicare una leggera pressione positiva utilizzando una siringa da 1 mL prima di immergere l'elettrodo di registrazione nel ACSF. Utilizzando un micromanipolatore sotto un microscopio (4 x lente dell'obiettivo), posizionare la micropipetta di elettrodo e puff di registrazione in modo che le punte appaiono al centro dell'immagine video nel monitor ( Figura 1 A).</li>
	<li>Regolare il fuoco del microscopio (obiettivo obiettivo di 40 x) riducendo gradualmente la micropipetta puff e posizionarlo sopra il neurone di registrazione ad un angolo di 45°. Mantenere la distanza tra la punta della micropipetta soffio e il neurone registrate tra 20-40 µm ( Figura 1 B). Il neurone con l'elettrodo di registrazione si avvicinano lentamente e con attenzione e poi rilasciare la pressione positiva. Applicare una debole e breve di aspirazione attraverso il tubo collegato alla pinza porta elettrodo per creare un sigillo di giga-ohm.</li>
	<li>Mantenere la tensione a 0 mV. Dopo la formazione del sigillo giga-ohm, compensare per una rapida e lenta capacità manualmente o automaticamente. Quindi applicare un breve e forte aspirazione attraverso il tubo di cui sopra per entrare nel modo della intero-cellula.</li>
	Modalità di <li>record eIPSC in tensione-morsetto. Applicare la bassa pressione del gas (azoto, 4-6 psi) alla micropipetta puff utilizzando un Picospritzer controllato da un generatore di Master 8 tensione passo per fornire singolo o accoppiato GABA soffi ( Figura 2).</li>
	<li>Modificare la durata del soffio per ottenere i migliori risultati di eIPSC ( Figura 3) e misurare la eIPSC nel modello di depressione indotta da LPS ( Figura 4).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres.">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li><li>Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+used+for+studying+synaptic+transmission+in+slices+of+mammalian+brain.">Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain.</a> Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).</li><li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus.">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li><li>Dickinson, G. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+determining+the+recruitment+of+inositol+trisphosphate+receptor+channels+during+calcium+puffs.">Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs.</a> Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Columnar+distribution+of+activity+dependent+gabaergic+depolarization+in+sensorimotor+cortical+neurons.">Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons.</a> Mol Brain. 5, 33 (2012).</li><li>Glykys, J., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+main+source+of+ambient+GABA+responsible+for+tonic+inhibition+in+the+mouse+hippocampus.">The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus.</a> J Physiol. 582, 1163-1178 (2007).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+modulates+KCC2+expression+and+function+in+hippocampal+GABAergic+inhibition.">APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+interleukin-1+and+endotoxin+in+the+forced+swim+and+tail+suspension+tests+in+mice.">Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice.</a> Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).</li><li>Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Patch-clamp+Recordings+from+the+Somatodendritic+Domain+of+Nigral+Dopamine+Neurons.">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Wondolowski, J., Frerking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit-dependent+postsynaptic+expression+of+kainate+receptors+on+hippocampal+interneurons+in+area+CA1.">Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1.</a> J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).</li><li>Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+regulates+Cav1.2+L-type+calcium+channel+levels+and+function+to+influence+GABAergic+short-term+plasticity.">Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity.</a> J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).</li><li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+Cortical+GABAergic+Dysfunction+Contributes+to+Aberrant+UP-State+Duration+in+APP+Knockout+Mice.">Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice.</a> Cereb Cortex. , (2016).</li><li>Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine+Acts+through+Nicotinic+Receptors+to+Enhance+the+Firing+Rate+of+a+Subset+of+Hypocretin+Neurons+in+the+Mouse+Hypothalamus+through+Distinct+Presynaptic+and+Postsynaptic+Mechanisms.">Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms.</a> eNeuro. 2 (1), (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Applicazione di soffio viene ampiamente utilizzata per valutare il recettore postsinaptico funzione3,4,7, ma richiede un controllo preciso in ogni esperimento. Descriviamo qui una procedura che coinvolge cellule intere patch di bloccaggio, che dimostra che GABA-puff indotto IPSCs (cioè, ampiezza) nelle fette del cervello corticale prefrontale. La resistenza dell'elettrodo di registrazione è MΩ circa 5, mentre il diametro dell...

La tecnica del patch-clamp, uno strumento primario per lo studio di segnali elettrici nei neuroni, è stata sviluppata in anni 19701,2. Dei principali vantaggi di questa tecnica è che esso fornisce conoscenza su come specifici trattamenti (ad es., farmacologico) può alterare funzioni neuronali o canali in tempo reale3. Valutazione farmacologica di funzione di un neurone durante la registrazione in una fetta di cervello cellule intere richiede l'applicazione di farmaci, come gli agonisti o antagonisti dei recettori specifici, i neuroni in fase di registrazione. Questo metodo permette l'identificazione di alterazioni neuronali che si verificano dopo l'applicazione di un farmaco specifico, portando così a una migliore comprensione delle proprietà fisiologiche e patologiche dei neuroni4. Sebbene amministrazione farmacologica possa essere condotte via sia5 o soffio di aspersione6, quest'ultima è la tecnica superiore. In particolare: (i) puff applicazione rapidamente aumenta farmaco concentrazione intorno il neurone registrato ad un livello tale che è impedita la desensibilizzazione dei recettori di membrana; (ii) il volume di droga soffiato è estremamente basso, affinché ci sia scarso effetto sulla soluzione del bagno, che pertanto riduce eventuali effetti indesiderati dei prodotti chimici amministrati su fettine di cervello; (iii) il protocollo di soffio può essere impostato e salvato, rendendo l'esperimento molto precisamente riproducibile; (iv) soffio applicazione rappresenta l'uso economico di agonisti/antagonisti, in particolare qualora tali reagenti siano costose o difficili da ottenere.
Qui, ci concentreremo sulla registrazione cellule intere correnti indotte da sbuffando GABA nelle fette del cervello acutamente preparato, una preparazione che ha il vantaggio di circuiti cerebrali relativamente ben conservato. Come conduciamo correnti inibitorie indotta da soffio7 sarà descritti in questo articolo. Utilizzando cesio (Cs+)-base di soluzioni interne e che tiene i neuroni a 0 mV, introdurremo GABA-puff evocato correnti postsinaptiche inibitorie (ampiezza) con dettagli tecnici appropriati. Utilizzando un modello murino di depressione indotta dal lipopolysaccharide (LPS) iniezione8, indichiamo che il eIPSC ampiezza evocata da un soffio di GABA è ridotta significativamente in fette di topi iniettati LPS rispetto ai comandi del veicolo. La nostra intenzione è che questo articolo dovrebbe mostrare come la tecnica di soffio è ampiamente applicabile a studi mirati a valutare l'effetto di sostanze chimiche, farmaci o composti sulle attività neuronale nelle fette del cervello.

<table><tbody><tr><td>Glass Borosilicate micropipettes</td><td>Shutter Instruments</td><td>BF150-86-10</td><td>1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter</td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Shutter Instruments</td><td>MODEL P-97&amp;nbsp;</td><td>Flaming/Brow Micropipette Puller</td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Shutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Computer controlled Amplifier&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Digital Acquisition system&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Camera</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>2115001</td><td>Inspection equipment</td></tr><tr><td>Microscopy&amp;nbsp;</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>Eclipse FN1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Master 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8 Pulse stimulator</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Slicer</td><td>Leica</td><td>VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Gillette</td><td>74-S</td><td>FLYING EAGLE</td></tr><tr><td>Video monitor</td><td>Panasonic</td><td>WV-BM 1410</td><td></td></tr><tr><td>502 Glue</td><td>Deli</td><td>7146</td><td>Cyanoacrylate Glue</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Shanghai JIA PENG Corporation</td><td>BT100-1F</td><td></td></tr><tr><td>Video Camera</td><td>Olympus America Medical</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipets</td><td>Biologix</td><td>30-0138A1</td><td></td></tr></tbody></table>

whole-cell currents induced by puff application of gaba in brain slices

Amministrazione farmacologica è comunemente usato quando lo svolgimento di cellule intere patch-clamp registrazione nelle fette del cervello. Uno dei migliori metodi di applicazione della droga durante la registrazione elettrofisiologica è la tecnica di soffio, che può essere utilizzata per studiare l'effetto dei reagenti farmacologici sulle attività neuronale nelle fette del cervello. Il grande vantaggio di applicazione puff è che la concentrazione di droga intorno al sito di registrazione aumenta rapidamente, impedendo così la desensibilizzazione dei recettori di membrana. Riuscito uso di applicazione di soffio comporta particolare attenzione ai seguenti elementi: la concentrazione del farmaco, i parametri della micropipetta soffio, la distanza tra la punta di una micropipetta di soffio e il neurone registrati e la durata e pressione guidando il puff (libbre per pollice quadrato, psi). Questo articolo descrive una procedura dettagliata per la registrazione di cellule intere correnti indotte da sbuffando acido gamma - aminobutirrico (GABA) su un neurone di una fetta di corticale prefrontale. In particolare, la stessa procedura può essere applicata con lievi modifiche per altre zone del cervello come l'ippocampo e lo striato e per diverse preparazioni, quali colture cellulari.

La tecnica di soffio consente ai ricercatori di studiare l'effetto di droghe, in particolari recettori sulla superficie di un dato neurone. In questo articolo, ci concentriamo su correnti mediate da recettori GABA. La figura 1 Mostra le micropipette puff e registrazione. Per eliminare qualsiasi effetto sui neuroni registrati della pressione fisica generata da Sfoglia, ACSF e soffi di saccarosio (Figura 2A) vengon...

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Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Cellule intere correnti indotte dall'applicazione di Puff di GABA nelle fette del cervello

Descriviamo la tecnica di soffio, da cui reagenti farmacologici possono essere somministrati durante la registrazione di cellule intere patch-clamp ed evidenziano vari aspetti delle caratteristiche che sono cruciali per il suo successo.

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

whole-cell-currents-induced-puff-application-gaba-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.3K Views.  South China Normal University. Descriviamo la tecnica di soffio, da cui reagenti farmacologici possono essere somministrati durante la registrazione di cellule intere patch-clamp ed evidenziano vari aspetti delle caratteristiche che sono cruciali per il suo successo.

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GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, respectively 4,5,6,7 The GABAA channel is a pentameric GABA-gated chloride channel. The channel subunits are grouped into 8 families (&alpha;1-6, &beta;1-3, &gamma;1-3, &delta;, &#949;, &theta;, &pi; and &rho;). Two alphas, two betas and one 3rd subunit form the functional channel 8. By combining studies of sub-type specific GABA-activated single-channel molecules with studies including all populations of GABAA channels in the neuron it becomes possible to understand the basic mechanism of neuronal inhibition and how it is modulated by pharmacological agents.
We use the patch-clamp technique 9,10 to study the functional properties of the GABAA channels in alive neurons in hippocampal brain slices and record the single-channel and whole-cell currents. We further examine how the channels are affected by different GABA concentrations, other drugs and intra and extracellular factors. For detailed theoretical and practical description of the patch-clamp method please see The Single-Channel Recordings edited by B Sakman and E Neher 10.

We use the patch-clamp technique to measure GABA-activated single-channel currents (GABAA channels, GABAA receptors) and the synaptic and tonic currents they generate in neurons. Activation of the channels decreases neuronal excitability in health and disease 1,2,3,4.

Correnti a singolo canale e Tonico GABA-attivati ​​in fettine di cervello di ratto

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, ...

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Neuroscienze

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Slice It Hot: acuta cervello adulto affettare in fisiologica Temperatura

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the identification of novel molecules active in preclinical assays from an in vitro recombinant receptor to their pharmacological effects at native receptors in rodent brain slices. For compounds binding at the benzodiazepine site of the receptor, the first step is to set up a primary screen that consists of developing radioligand binding assays on cell membranes expressing the major GABAA subtypes. Then, taking advantage of the heterologous expression of rodent and human GABAA receptors in Xenopus oocytes or HEK 293 cells, it is possible to explore, in electrophysiological assays, the physiological properties of the different receptor subtypes and the pharmacological properties of the identified compounds. The Xenopus oocyte system will be presented here, starting with the isolation of the oocytes and their microinjection with different mRNAs, up to the pharmacological characterization using two-electrode voltage clamps. Finally, recordings conducted in rodent brain slices will be described that are used as a secondary physiological test to assess the activity of molecules at their native receptors in a well-defined neuronal circuit. Extracellular recordings using population responses of multiple neurons are demonstrated together with the drug application.

Here, we present protocols to discover compounds active at GABAA receptors, from the binding to the physiology and pharmacology.

Metodi per la scoperta di nuovi composti modulando un recettore dell'acido Gamma - aminobutirrico tipo una neurotrasmissione

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue

Controlling seizures remains a challenging issue for the medical community. To make progress, researchers need a way to extensively study seizure dynamics and investigate its underlying mechanisms. Acute seizure models are convenient, offer the ability to perform electrophysiological recordings, and can generate a large volume of electrographic seizure-like (ictal) events. The promising findings from acute seizure models can then be advanced to chronic epilepsy models and clinical trials. Thus, studying seizures in acute models that faithfully replicate the electrographic and dynamical signatures of a clinical seizure will be essential for making clinically relevant findings. Studying ictal events in acute seizure models prepared from human tissue is also important for making findings that are clinically relevant. The key focus in this paper is on the cortical 4-AP model due to its versatility in generating ictal events in both in vivo and in vitro studies, as well as in both mouse and human tissue. The methods in this paper will also describe an alternative method of seizure induction using the Zero-Mg2+ model and provide a detailed overview of the advantages and limitations of the epileptiform-like activity generated in the different acute seizure models. Moreover, by taking advantage of commercially available optogenetic mouse strains, a brief (30 ms) light pulse can be used to trigger an ictal event identical to those occurring spontaneously. Similarly, 30 - 100 ms puffs of neurotransmitters (Gamma-Amino Butyric Acid or glutamate) can be applied to the human tissue to trigger ictal events that are identical to those occurring spontaneously. The ability to trigger ictal events on-demand in acute seizure models offers the newfound ability to observe the exact sequence of events that underlie seizure initiation dynamics and efficiently evaluate potential anti-seizure therapies.

Acute seizure models are important for studying the mechanisms underlying epileptiform events. Furthermore, the ability to generate epileptiform events on-demand provides a highly efficient method to study the exact sequence of events underlying their initiation. Here, we describe the acute 4-aminopyridine cortical seizure models established in mouse and human tissue.

Iniziazione di generazione e On-Demand di attività Ictal acuta nel tessuto umano e del roditore

Controlling seizures remains a challenging issue for the medical community. To make progress, researchers need a way to extensively study seizure dynamics ...

Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect distinct cellular and network components of these circuits remains unclear. Ex vivo brain slices provide a means by which investigators may probe discrete components of complex networks and disentangle potential mechanisms underlying the effects of volatile anesthetics on evoked responses. To isolate potential cell type- and pathway-specific drug effects in brain slices, investigators must be able to independently activate afferent fiber pathways, identify non-overlapping populations of cells, and apply volatile anesthetics to the tissue in aqueous solution. In this protocol, methods to measure optogenetically-evoked responses to two independent afferent pathways to neocortex in ex vivo brain slices are described. Extracellular responses are recorded to assay network activity and targeted whole-cell patch clamp recordings are conducted in somatostatin- and parvalbumin-positive interneurons. Delivery of physiologically relevant concentrations of isoflurane via artificial cerebral spinal fluid to modulate cellular and network responses is described.

Ex vivo brain slices can be used to study the effects of volatile anesthetics on evoked responses to afferent inputs. Optogenetics are employed to independently activate thalamocortical and corticocortical afferents to non-primary neocortex, and synaptic and network responses are modulated with isoflurane.

Attivazione optogenetica delle vie afferenti nelle fette cerebrali e modulazione delle risposte mediante anestetici volatili

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Fette ippocampali orizzontali del cervello del topo

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Recording Whole-Cell Currents with GABA Puffing in a Mouse Brain Slice

Source: Feng, Y. et al., <a href="https://app.jove.com/v/56387">Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the recording of whole-cell currents induced by gamma-aminobutyric acid, or GABA, in a mouse prefrontal cortical brain slice. Controlled delivery of GABA opens chloride channels in a postsynaptic neuron, generating inhibitory postsynaptic currents, or IPSCs. These IPSCs increase with higher GABA concentrations, reflecting GABA&#39;s inhibitory activity on synaptic transmission.

Registrazione di correnti di cellule intere con il GABA che sbuffa in una fetta di cervello di topo

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Preparation of Solutions

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Cellule intere correnti indotte dall'applicazione di Puff di GABA nelle fette del cervello

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Correnti a singolo canale e Tonico GABA-attivati in fettine di cervello di ratto

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell'ippocampo

Slice It Hot: acuta cervello adulto affettare in fisiologica Temperatura

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Metodi per la scoperta di nuovi composti modulando un recettore dell'acido Gamma - aminobutirrico tipo una neurotrasmissione

Iniziazione di generazione e On-Demand di attività Ictal acuta nel tessuto umano e del roditore

Attivazione optogenetica delle vie afferenti nelle fette cerebrali e modulazione delle risposte mediante anestetici volatili

Fette ippocampali orizzontali del cervello del topo

Registrazione di correnti di cellule intere con il GABA che sbuffa in una fetta di cervello di topo

Cellule intere correnti indotte dall'applicazione di Puff di GABA nelle fette del cervello

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Correnti a singolo canale e Tonico GABA-attivati ​​in fettine di cervello di ratto

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell'ippocampo

Slice It Hot: acuta cervello adulto affettare in fisiologica Temperatura

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Metodi per la scoperta di nuovi composti modulando un recettore dell'acido Gamma - aminobutirrico tipo una neurotrasmissione

Iniziazione di generazione e On-Demand di attività Ictal acuta nel tessuto umano e del roditore

Attivazione optogenetica delle vie afferenti nelle fette cerebrali e modulazione delle risposte mediante anestetici volatili

Fette ippocampali orizzontali del cervello del topo

Registrazione di correnti di cellule intere con il GABA che sbuffa in una fetta di cervello di topo

Correnti a singolo canale e Tonico GABA-attivati in fettine di cervello di ratto