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Nota: Tutti i protocolli e i metodi utilizzati negli oggetti animali sono stati approvati da istituzionale Animal Care e uso comitati (IACUC) della Taipei Medical University (numeri di protocollo: LAC-2014-0387)
1. preparazione di sistemi di infusione pompa Micro-osmotica
Nota: Preparare la pompa, liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) buffer e droga (soluzione di proteina Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL in aCSF)) in condizioni sterili i buffer filtrata con filtri di 0,2 µm e condurre tutte le procedure sotto il cofano di cultura con guanti. Le procedure di chirurgia sono condotte come segue:
<ol>
	<li>Preparare le pompe micro-osmotiche un giorno prima dell'intervento chirurgico: riempire la pompa micro-osmotica di cervello con liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) con una siringa da 1 mL e un ago smussato-testa fornito con il kit. Immergere la pompa micro-osmotica in aCSF e metterlo su uno shaker e agitare delicatamente durante la notte. Attenzione: La pompa deve essere riempita con aCSF, e bolle d'aria deve essere evitata all'interno della pompa (Figura 1A).</li>
	<li>Prima di iniziare l'intervento chirurgico, preparare la soluzione della proteina ricombinante per Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL, diluito in aCSF) per essere utilizzato nell'esperimento. Rimuovere aCSF dalla pompa e riempire la pompa con la soluzione di farmaco lentamente fino a quando fuoriesce l'eccesso. Nota: 15ml aCSF o Met-CCL5/RANTES soluzione è sufficiente per 5-8 pompe. Attenzione: Ripetere la procedura per verificare che la pompa è completamente riempita con il farmaco senza bolle all'interno.</li>
	<li>Tagliare i tubi del catetere nella lunghezza desiderata e fissarli con l'ago di infusione smussato-fine cervello nel kit di infusione di cervello. Riempire il kit di infusione e tubi con la droga.</li>
	<li>Infine, montare e fissare il kit di infusione del cervello alla pompa micro-osmotica. Attenzione: Nessun bolle dovrebbero essere formato il tubo o la pompa (Figura 1A).</li>
	<li>Immergere la fusione di intera pompa osmotica-cervello situata in aCSF in un tubo da 50ml sterilizzati per evitare che la pompa dall'asciugarsi. Il set di fusione osmotica pompa-cervello è ora pronto per essere utilizzato per la chirurgia. Nota: I sistemi di micro-osmotica pompa possono essere utilizzati per infusione di farmaci a lungo termine. Questo assicura un modo sicuro e conveniente di consegna della droga nel cervello del mouse.</li>
</ol>
2. intracerebral ventricolare chirurgia – l'impianto della pompa osmotica micro
Attenzione: Sterilizzare l'ambiente chirurgico con 75% di etanolo e garantire che le persone coinvolte nello studio indossa guanti sterili e un camice da laboratorio pulito. Strumenti chirurgici / strumenti devono essere autoclavato e asciugato prima dell'uso e successivamente sterilizzato con interventi chirurgici di topi-tra 75% etanolo.
<ol>
	<li>Pesare il mouse e anestetizzare tramite iniezione intra-peritoneale (IP) con chetamina/xilazina (ketamina 50 mg/kg, xilazina 10 mg/kg). Attenzione: Inferiore a 24 g del peso corporeo di topi non è raccomandabili per la chirurgia di impianto pompa osmotica.</li>
	<li>Montare e fissare la testa del mouse sul apparato stereotassica (Figura 1B).</li>
	<li>Utilizzare un paio di forbici e pinze per tagliare la pelle esterna che copre il cranio. Utilizzare lo iodio per pulire il cranio periferico.</li>
	<li>Separare lo strato più esterno della pelle dalla pelle sottocutanea con l'aiuto di un paio di tenaglie di blunt-testa vicino alla regione del collo per l'impianto di pompa osmotica-cervello fusion set (Figura 1).</li>
	<li>Segnare il punto di infusione con riferimento alla mappa del cervello (Figura 1) mediante l'apparato stereotassica. In questo esperimento, l'ago deve essere impiantato nella regione ventricolo 3rd (Bregma: 0.0 mm laterale, 1,3 mm posteriormente, 5,7 mm ventrale).</li>
	<li>Forare con un trapano unghia intorno alla zona segnata sul cranio (Figura 1E). Attenzione: Fare attenzione a non rompere il mouse meningi e vasi sanguigni, evitando così l'interruzione dei micro-vasi sanguigni nel cervello.</li>
	<li>Posizionare l'apparecchio di fusione di micro-osmotica pompa-cervello contenente aCSF (come controllo) o droga (soluzione della proteina Met-CCL5/RANTES) sotto la pelle dietro la regione del collo e inserire l'infusione di cervello dell'ago nel foro di infondere il farmaco nel cervello del topo ( Figura 1E). L'ago si penetra le meningi e ottenere nel ventricolo. Fissare l'ago sul cranio usando gel desensibilizzante superficie (Figura 1F) e attendere 1-2 min, fino a quando la colla si asciuga. Successivamente, tagliare la parte sporgente sopra l'ago (Figura 1- H).</li>
	<li>Utilizzare una colla per tessuti per guarire l'operazione ferita sulla testa. Applicare 50 µ l della colla sulla parte superiore della ferita, tirare entrambi i lati della pelle insieme e tenere per 30 s per permettere alla pelle di foca (Figura 1I). Attenzione: Utilizzare 100% tampone imbevuto di alcool per pulire la ferita dopo chirurgia e 100 ul penicillina con streptomicina per prevenire l'infezione. Nota: La pelle del topo sarà formare tessuto cicatriziale e guarire in pochi giorni dopo la somministrazione della colla chirurgica. Il vantaggio principale della colla è l'evitare punti di sutura chirurgiche che può causare irritazione o infiammazione.</li>
	<li>Luogo il mouse in una gabbia pulita tenuto su una piastra calda (riscaldata fino a 37 ° C) e attendere fino a quando il mouse si recupera dall'effetto anestetico. Attenzione: È fondamentale per mantenere la temperatura corporea del mouse per aumentare la probabilità di sopravvivenza dopo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Dopo un periodo di una settimana di recupero, i topi sarà pronti per ulteriori esperimenti, come il Test di tolleranza orale al glucosio (OGTT) e Test di tolleranza dell'insulina (ITT).</li>
</ol>
3. Test di tolleranza al glucosio orale (OGTT)
Nota: Eseguire il test di tolleranza al glucosio orale 7 giorni dopo l'infusione di aCSF e MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 µ l). Mantenere un 6h veloce per i topi prima OGTT con sufficiente approvvigionamento di acqua. Tenere gli animali sul banco di lavoro stesso dove gli esperimenti saranno effettuati affinché essi può acclimatarsi all'ambiente per ridurre lo stress durante la procedura.
<ol>
	<li>Preparazione di soluzione di glucosio: prima di condurre l'esperimento, preparare la soluzione di glucosio sciogliendo 3,75 g di glucosio in 15 mL di acqua distillata H2O.</li>
	<li>Impostare un calendario per registrare le letture durante la procedura sperimentale (tabella 1). Nota: È importante impostare un orario con un adeguato intervallo tra ogni esame del sangue per consentire accurata registrazione durante l'esperimento.</li>
	<li>Pesare ogni mouse dopo il digiuno e calcolare la quantità appropriata di glucosio deve essere iniettato.</li></ol>Ad esempio, se il mouse pesa 30 g, la quantità di soluzione di glucosio da somministrare dovrebbe essere 300 µ l.
	<li>Preparare i seguenti strumenti presso il banco di lavoro:<ol>
		<li>Controllo glicemico (premere il pulsante start per controllare lo stato della batteria, assicurarsi che esso sia funzionante prima della prova).</li>
		<li>Chip di glucosio</li>
		<li>Siringa da insulina (siringa da insulina 0,3 mL)</li>
		<li>Lame di rasoio</li>
		<li>Timer</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Una volta impostata la panchina, misurare e registrare il livello di glucosio nel sangue come segue: mettere un pulito e nuovo glucosio chip nel glucometro e premere il pulsante di start a zero si.</li>
	<li>Sollevare il mouse dalla parte posteriore del collo e la coda del colpo un paio di volte a garantire sufficiente flusso di sangue alla regione della coda.</li>
	<li>Utilizzando una nuova lama di rasoio per tagliare un piccolo pezzo della coda e spremere una piccola goccia di sangue (circa 10-20 µ l) nel chip del glucosio. Il sangue dovrebbe riempire il chip per consentire la misurazione accurata. Il glucometro visualizzerà immediatamente il livello di glucosio. Se la macchina presenta "errore", ripetere la procedura con un nuovo chip di glucosio. Nota: Il chip di glucosio richiede una sola goccia di sangue. Quando il campione di sangue deve essere raccolto più di una volta, semplicemente applicare pressione eseguendo le dita lungo la coda di topo più volte tenendo l'estremità della coda direttamente sopra il chip per raccogliere il sangue. Non è necessario tagliare l'estremità di coda ogni volta che durante la raccolta di campioni di sangue.</li>
	<li>Successivamente, nutrire i topi glucosio (0,25 g/mL) per via orale utilizzando la tecnica sonda gastrica intragastrico. La quantità di glucosio deve essere somministrato deve essere calcolata utilizzando la formula: 10 X soluzione di glucosio di peso (BW) µ l del corpo (ad esempio, se la pesa del mouse 30g, la quantità di soluzione di glucosio deve essere somministrato sarà 300 µ l). Avviare il timer immediatamente dopo la somministrazione orale di glucosio.</li>
	<li>Ripetere la procedura di misurazione del glucosio alle 15, 30, 60, 90 e 120 min.</li>
	<li>Dopo che sono state registrate tutte le letture del livello di glucosio, glucosio chip in un contenitore di biohazard e scartare le lame di rasoio. Rimettere il cibo le gabbie di topi e restituirli alla sala degli animali.</li>

4. Test di tolleranza insulina (ITT)
Nota: La prova di tolleranza dell'insulina e test di tolleranza al glucosio orale deve essere pianificate almeno 7 giorni di distanza per ridurre l'effetto digiuno sugli animali. Per la prova di tolleranza dell'insulina (ITT), insulina umana (0.75 U/Kg) sarà somministrato tramite iniezione del IP.
<ol>
	<li>Preparazione della soluzione di insulina 0,25 U: diluire 100U insulina umana al rapporto di 1: 400 in soluzione salina.</li>
	<li>Pesare ogni mouse dopo il digiuno e calcolare di conseguenza la quantità iniettata di insulina: il volume (µ l) di 0,25 insulina U per essere iniettato IP = 3 X BW (0.75 U insulina/Kg di peso corporeo). Ad esempio: per un mouse 28,8 g di peso, iniettare: 28,8 X 3 = 86,4 µ l (insulina 0,25 U diluito) (tabella 2). Attenzione: Gli stessi animali potrebbero avere pesi corporei differenti dopo 6 h di digiuno in giorni diversi. Pertanto, è necessario misurare il peso del corpo prima e dopo il digiuno e condotta che l'OGTT e ITT test. Peso corporeo del mouse potrebbe scendere a seconda della specie, genere e durata del digiuno. Dosaggi più alti di insulina potrebbero causare shock insulinico e portano alla morte dell'animale.</li>
	<li>Impostare una tabella (tabella 2) per registrare le letture durante la procedura sperimentale. Ripetere i passaggi 3.4. a 3,8. per il misurazione i livelli della glicemia.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il meccanismo di infiammazione cronica e citochine correlate, quali CCL5 e del suo recettore – CCR5 nello sviluppo del diabete di tipo 2 rimane poco chiaro. L'infiammazione cronica provoca l'infiltrazione del macrofago in tessuto adiposo e colpisce il regolamento di adipochine; nel frattempo, inoltre, attira le β-cellule e altera la secrezione dell'insulina dalle isole di Langerhans in risposta al glucosio nel sangue. Ipotalamo nel cervello svolge un ruolo importante come centro di controllo nel coordinamento dell'insulina e adipokine segnali dai tessuti periferici sistemici nella regolazione dell'appetito, metabolismo del glucosio di anima periferica e risposta dell'insulina. Molti studi indicano anche che l'infiammazione ipotalamico conduce a difettosa regolazione dell'omeostasi energetica, nonché dell'isolotto pancreatico difettoso e funzione epatica2,3,9,10. CCL5 nel cervello contribuisce alla regolazione della temperatura aspirazione e corpo cibo nell'ipotalamo11,12; Tuttavia, la correlazione di CCL5 con segnalazione ipotalamica e sistemica dell'insulina è poco chiara. Un mouse di knockout di tutto il corpo CCL5 (CCL5- / -) è stato generato per rispondere a questo interrogativo, che mostra un fenotipo di resistenza di insulina con livelli elevati dell'insulina e i livelli ematici del glucosio nel sangue8. Tuttavia, richiede molto tempo per sviluppare il fenotipo di T2DM ed è difficile indagare il ruolo e il meccanismo di CCL5 nel segnale ipotalamico dell'insulina a causa di possibili effetti compensativi a lungo termine. Di conseguenza, una manipolazione diretta di CCL5 segnalazione nei neuroni ipotalamici è l'approccio migliore. Ci sono, tuttavia, più tipi di neuroni nella regione ipotalamica ed è abbastanza costoso e richiede tempo per generare topi knockout specifico delle cellule. Utilizzando un ICV sistema di infusione può così risparmiare tempo e fornire un approccio più specifico per manipolare CCL5 funzione direttamente nel cervello, evitando possibili reazioni infiammatorie periferiche.
Studi che utilizzano pompe osmotiche sono già stati pubblicati in precedenza, fornendo grandi esempi e dimostrazioni di tecniche inerenti l'impianto di pompe osmotiche in roditori13. Tuttavia, abbiamo affrontato alcune sfide mentre a seguito di questi protocolli nel nostro studio. In primo luogo, alcune delle attrezzature utilizzate nel protocollo è piuttosto costoso, compreso 1) il sistema elettrico per raggiungere la posizione, disegnare e inserire l'ago nel cervello di topo, 2) il sistema thermo per il mantenimento della temperatura corporea del mouse e 3) l'ossigeno-isoflurano sistema di fornitura per somministrazione di anestesia ai topi. In secondo luogo, le tecniche descritte in altri articoli erano difficili da replicare perché eravamo solo in grado di utilizzare gli animali all'interno di una piccola gamma di pesi corporei e a certe età per il nostro studio. Siamo consapevoli che i topi più grandi sono più adatti per la chirurgia e l'impianto. Tuttavia, nel nostro studio, abbiamo dovuto usare topi più piccoli e più giovani per evitare il sovrappeso e gli effetti di invecchiamento sul regolamento di glucosio insulina e sangue: solo topi maschi con corpo peso 25 ± 2 g e l'età circa 2 mesi di età sono stati scelti nello studio. Così, è difficile eseguire un intervento chirurgico e suturare la ferita sulla testa del mouse. In terzo luogo, la risposta infiammatoria deve essere ridotto al minimo dopo l'intervento chirurgico poiché una citochina infiammatoria è l'obiettivo in questo studio. Topi e ratti possono rimuovere la sutura e ferite aperte facilmente dopo la chirurgia, che causare infiammazione e aumentare le reazioni delle chemochine. Di conseguenza, è necessaria una strategia per raggiungere la posizione e disegnare e inserire l'ago nel cervello di topo che evita l'infezione secondaria. Di conseguenza, abbiamo modificato i protocolli descritti in precedenza per rendere questa tecnica conveniente, più facile e meno dannosi per gli animali, come descritto nel paragrafo seguente.
In primo luogo, abbiamo usato un chiodo trapano per manualmente un foro intorno alla zona di destinazione contrassegnata sul cranio, come descritto al punto 2.6. Questo metodo è conveniente e permette di monitorare l'intera procedura in modo da evitare di danneggiare il mouse meningi e vasi sanguigni. Regolazione del glucosio di anima è alterata dopo il colpo acuto, ad esempio un'emorragia nel cervello. L'iperglicemia acuta e diabete-come le sindromi sono state osservate anche dopo il colpo in contesti clinici14,15. Allo stesso modo, abbiamo anche trovato risposta dell'insulina e livello alterato del glucosio nei topi con emorragia e pus nel cervello. Siamo consapevoli che migliore controllo della chirurgia basata su manuale è necessaria per garantire la coerenza dei risultati. In secondo luogo, abbiamo approfittato di un biomateriale medico recente sviluppato comunemente utilizzato nelle cliniche, colla per tessuti (punto 2.8), per sigillare la pelle sulla testa del mouse dopo la chirurgia, quindi, evitando punti di sutura e accelerando il tasso di guarigione. Questo rende più facile per eseguire le procedure chirurgiche e riduce la possibilità di infiammazione secondaria. In terzo luogo, il tempo necessario per eseguire l'intera procedura chirurgica è comparativamente più breve, che aumenta la probabilità di sopravvivenza per i topi e abbassa il dosaggio del farmaco anestetico viene iniettato intraperitonealmente. Abbiamo osservato un alto tasso di sopravvivenza (95%) e ha ottenuto risultati relativamente accurati seguendo questo protocollo modificato.
La limitazione di questa tecnica è il lasso di tempo relativamente breve di consegna della droga. Anche se una pompa osmotica può essere posizionato nel corpo del mouse in alternativa senza riapertura il cervello, il nostro studio solo si concentra sull'effetto delle chemochine infiammatorie sul cervello per regolare la segnalazione insulina periferica sistemica. Ulteriori interventi chirurgici nei tessuti periferici possibilmente potrebbero indurre una reazione infiammatoria nei tessuti periferici, che sarebbe poi aumentano l'espressione di chemochine infiammatorie e influenzare i risultati. In secondo luogo, il tempo di dimezzamento del farmaco limita inoltre la durata dello studio. Proteine ricombinanti come chemokine di solito hanno un'emivita più breve, che perde la sua attività nel corso del tempo, anche se permette anche di studiare l'effetto di blocco CCL5 segnalazione nel cervello nel breve termine. Nostri studi precedenti hanno anche descritto un approccio di modificazione genetica per la generazione di un topo knockout CCL5, che fornisce un modello a lungo termine effetti8.
Ci sono alcune nuove tecniche e metodi alternativi per consegnare i farmaci nel cervello. La nanotecnologia è una tecnica potente, che può essere utilizzata per consegnare i farmaci nel sistema nervoso centrale. Tuttavia, molti farmaci sono termosensibili e possono essere distrutti quando si cerca di assemblarli in nanoparticelle16. Inoltre, le nanoparticelle possono passare attraverso BBB ed essere uptaken dalle cellule che sono adatti per siRNA o farmaci più comuni, ma non si tratta di un metodo ideale per legame ligando-recettore.CCL5 richiede l'associazione al suo recettore, CCR5, nei neuroni dell'ipotalamo ARC a prendere effetto8, e la consegna di CCL5 antagonista CCL5 Metin neuroni attraverso nanoparticelle potrebbe causare una perdita della capacità di legare e bloccare CCR5 sulla cella superficie.
Il livello di glucosio nel sangue era significativamente più alto nei topi amministrati con il CCL5 MetCCL5-antagonista rispetto ai comandi (topi amministrati con aCSF) nel test di tolleranza al glucosio orale. La somministrazione di insulina aggiuntivi (prova di tolleranza dell'insulina) era in grado di abbassare il livello della glicemia in MetCCL5 ricezione topi (Figura 4B), che suggerisce che l'insulina endogena sia esterna non può ridurre i livelli di glucosio nel sangue Quando il blocco ipotalamico CCL5 segnalazione. Topi è diventato resistenti dell'insulina senza CCL5 attività nell'ipotalamo. Serine302 aumentata fosforilazione di IRS-1 è stata trovata in topi che ricevono Met-CCL5 rispetto ai topi di controllo ricezione aCSF (Figura 5A-B). Fosforilazione della serina 302 di IRS-1 è stata indicata per indurre una dissociazione fisica di IRS-1 dal ricevitore dell'insulina, che è delle principali cause di insulino resistenza6; l'insulina è in grado di attivare segnali a valle come la PI3K-Akt. Un ex vivo insulina stimolazione studio ha confermato l'insulina molecola di segnalazione a valle Akt (p-AktS473) non è stata attivata dall'insulina nel tessuto ipotalamico del mouse infuso con Met-CCL5 e, invece, ha aumentato la fosforilazione della serina 302. Complessivamente, sia dati fisiologici (OGTT e ITT) e studio molecolare dimostrano che ipotalamico CCL5 segnalazione media il regolamento del segnale ipotalamico dell'insulina, che contribuisce al metabolismo di glucosio e resistenza di insulina sistematica.
Il ruolo e il meccanismo di CCL5 e CCR5 in associate all'obesità diabete rimane poco chiaro. Kitade et al ha segnalato che la carenza di CCR5 topi protetti da infiammazione obesità-indotta, del reclutamento del macrofago e insulino resistenza17. Tuttavia, altri studi di Kennedy et al. trovato risultati opposti che indica che la carenza di CCR5 altera la tolleranza al glucosio sistemico nonché segnalazione18dell'insulina del muscolo e degli adipociti. Entrambi gli studi applicati una dieta ad alta percentuale di grassi per indurre l'obesità, che conduce all'infiammazione cronica di tutto il corpo e risposta compensativa. Questi studi non forniscono meccanismi puliti e chiari di CCL5 e CCR5 nel regolamento di segnalazione dell'insulina. D'altra parte, la tecnica di pompa osmotica consente un'infusione di specifici del cervello ed evita risposta compensativa con relativa consegna di tempo limitato.
In conclusione, anche se la pompa osmotica con il sistema di infusione del cervello sembra essere una tecnica "all'antica", fornisce un metodo più economico, più facile e meno nocivo di drug delivery e aiuta a studiare la funzione del ligando-recettore segnalazione nella cervello.

Insulina interessa un'ampia varietà di tessuti compreso il cervello. L'insulina passa attraverso la barriera emato - encefalica, entra nel sistema nervoso centrale (SNC) e si lega con il recettore dell'insulina (IR) nell'ipotalamo di regolare assunzione di cibo, attività simpatica e periferica dell'insulina risposta. Infiammazione cronica in tessuti adiposi periferici è stata proposta per contribuire al diabete mellito tipo 2 (T2DM), ma come queste reazioni infiammatorie influenzano insulina segnala nell'ipotalamo di mediare sistemica dell'insulina risposta e intolleranza al glucosio rimane poco chiaro. Alcune chemochine partecipare alla regolazione dell'appetito e regolazione della temperatura corporea in ipotalamo1 come fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF), interleuchina (IL) -6, IL-1 β, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) e CCL5 (ligando di motivo C-C 5 ). Inoltre, l'infiammazione nell'ipotalamo conduce ad insulino-resistenza nel T2DM2,3.
Tra queste chemochine, l'alterazione dei livelli di espressione di chemochine CCL5 e del suo recettore, CCR5, in tessuti adiposi è stato associato con arteriosclerosi e intolleranza al glucosio in T2DM in esseri umani così come gli animali. CCL5 ha anche funzioni neuroendocrine, tra cui la regolazione della temperatura di corpo e l'assunzione di cibo, nell'ipotalamo. Così è importante indagare se CCL5 partecipa l'attivazione del segnale dell'insulina all'interno dell'ipotalamo o tessuti periferici.
Segnalazione dell'insulina è strettamente regolato all'interno delle cellule. L'associazione dei recettori di insulina (IR) attiva proteine di substrato (IRS) del ricevitore dell'insulina, seguite da fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) e della proteina chinasi B (PKB/AKT) attivazione e glucosio transporter-4 (GLUT4) traslocazione di membrana4 . Le proteine IRS sono i regolatori chiave in questa via di segnalazione: hanno più residui di serina e tirosina, che possono essere fosforilati in risposta a positivo o negativo dell'insulina segnala5. Ad esempio, fosforilazione della serina 302 su IRS-1 può portare alla dissociazione fisica di IRS-1 da IR e bloccare la trasduzione del segnale dell'insulina, che porta a insulina resistenza6. La compromissione dell'attività delle proteine IRS nell'ipotalamo è stata indicata per indurre l'insulino-resistenza e intolleranza al glucosio in topi7.
Un modo comune per studiare la funzione di un gene specifico è la manipolazione dell'espressione di geni bersaglio distribuiti in tutto il corpo dell'organismo. Tuttavia, questo può avere diversi inconvenienti: 1) potrebbe generare effetti di regolamentazione o compensativo di feedback diverso nel tempo e 2) questo metodo non ci aiuta a illustrare il ruolo della proteina bersaglio nelle regioni specifiche del cervello. Inoltre, tessuto e cellula-specifico gene knockout animali richiedere molto tempo per riprodursi e sono costosi. Quindi, utilizziamo un sistema a breve termine cervello infusione pompa osmotica - un modo relativamente rapido e conveniente per interferire con la segnalazione della proteina nel cervello usando il farmaco antagonista per superare i problemi di cui sopra. Stereotactic iniezioni richiedeva abilità chirurgica intricato e ingenti investimenti in strumentazione e tempo. In questo protocollo, forniamo un modo semplice e sicuro per eseguire l'iniezione stereotactic e un metodo rapido, meno nocivo e istantaneo per rilevare la concentrazione di glucosio nel sangue e indagare il ruolo di CCL5 nella segnalazione regolamento ipotalamico dell'insulina.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>#1049SB</td>
			<td>The glue used to seal the lesion site on the mouse head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOCTITE 454 instant adhesive</td>
			<td>Durect Corporation</td>
			<td>#8670</td>
			<td>The glue used to fix the needle on the mouse skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzet Micro- Osmotic Pump</td>
			<td>Durect Corporation</td>
			<td>#9922</td>
			<td>0.11 &#956;l per hour, 28 days</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain infusion system</td>
			<td>Durect Corporation</td>
			<td>#8851</td>
			<td>1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucometer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#06870244001</td>
			<td>Used to measure the blood glucose level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose chip</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#06454011020</td>
			<td>Used to load the blood sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evan&#39;s blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#MKBK0523V</td>
			<td>To demonstrate the drug infusion area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>#3232145 C</td>
			<td>Used to administer insulin intraperitoneally</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIO NE116 CONTROL UNIT 
			(nail drill)</td>
			<td>Mio System</td>
			<td>#E235-015</td>
			<td>To drill a hole in the skull of the mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL5/Met-RANTES Protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>#ADB0111081</td>
			<td>Recombinant Human CCL5, E-coli derived</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCSF formula</td>
			<td>119 mM NaCl 
			26.2 mM NaHCO3 
			2.5 mM KCl 
			1 mM NaH2PO4 
			1.3 mM MgCl2 
			10 mM glucose</td>
			<td></td>
			<td>Filter sterilize with a 0.22 &#956;m filter apparatus, and store at 4&#176;C. 
			aCSF is stable for 3-4 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-IRS-1 Serine302 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12879</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRS-1 (D23G12) antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12879</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Akt Serine 473 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9916</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt (pan) (C67E7) antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9916</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals: C57BL/6</td>
			<td>NAR Labs</td>
			<td></td>
			<td>Wild type mice strain used in the study</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the hypothalamic insulin signal to peripheral glucose intolerance with a continuous drug infusion system into the mouse brain

Insulina regola metabolismo sistematica nell'ipotalamo e la risposta dell'insulina periferica. Una reazione infiammatoria nei tessuti periferici adiposo contribuisce allo sviluppo di diabete mellito (T2DM) tipo 2 e regolazione dell'appetito nell'ipotalamo. Tipo del ricevitore di chemokine di Chemokine CCL5 e C-C 5 livelli (CCR5) sono stati suggeriti per mediare arteriosclerosi e intolleranza al glucosio in diabete mellito di tipo 2 (T2DM). Inoltre, CCL5 gioca un ruolo neuroendocrino nell'ipotalamo regolando cibo l'assunzione e la temperatura corporea, così, ci spinge a indagare la sua funzione nella segnalazione dell'insulina ipotalamico e la regolazione del metabolismo del glucosio periferico.
Il sistema di infusione cervello pompa micro-osmotica è un modo rapido e preciso per manipolare CCL5 funzione e studiare il suo effetto nel cervello. Fornisce inoltre un conveniente approccio alternativo per generare un animale transgenico knockout. In questo sistema, CCL5 segnalazione è stato bloccato da infusione intracerebroventricular (ICV) del suo antagonista, MetCCL5, utilizzando una pompa micro-osmotica. La reattività del metabolismo e dell'insulina periferica del glucosio è stata rilevata dal Test di tolleranza orale al glucosio (OGTT) e Test di tolleranza dell'insulina (ITT). Attività di segnalazione dell'insulina è stato quindi analizzato dalla macchia di proteina da campioni di tessuto derivati dagli animali.
Dopo 7-14 giorni di infusione MetCCL5, il metabolismo del glucosio e dell'insulina è stata alterata reattività nei topi, come visto nei risultati dell'OGTT e ITT. La fosforilazione di serine302 di IRS-1 è stata aumentata e l'attività di Akt è stata ridotta in neuroni ipotalamici topi dopo CCL5 inibizione. Complessivamente, i nostri dati suggeriscono che bloccando CCL5 nel cervello del topo aumenta la fosforilazione di IRS-1 S302 e interrompe la trasmissione del segnale insulinico ipotalamico, portando ad una diminuzione nella funzione dell'insulina nei tessuti periferici, come pure il danno del glucosio metabolismo.

Gli impianti chirurgici osmotico di pompe di infusione contenente entrambi aCSF come controllo o CCL5 antagonista MetCCL5 (per bloccare CCL5 effetti nel cervello) sono stati condotti sui topi. Alle 7 e 14 giorni dopo la chirurgia, la tolleranza al glucosio periferico e la risposta dell'insulina dei topi sono stati analizzati usando OGTT (dopo 7 giorni) e ITT (dopo 14 giorni), come indicato nel protocollo. Il test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) e la prova di tolleranza dell'insulina (ITT) di topi sono stati effettuati dopo 6 ore di digiuno. Topi sono stati amministrati con glucosio per via orale, con l'importo basato sul loro rispettivo peso corporei. I cambiamenti nei livelli della glicemia sono stati registrati, come mostrato nella Figura 3. Il test di sensibilità dell'insulina è stato effettuato tramite l'iniezione dell'insulina (IP) intraperitoneale nei topi e il cambiamento del livello di glucosio nel sangue è stato misurato immediatamente. Le modifiche dei livelli di glucosio nel sangue attraverso la stimolazione di insulina nei topi con farmaci diversi infusione sono state registrate, come mostrato nella Figura 4. Il livello di glucosio nel sangue è stata solo leggermente ridotta dopo somministrazione di glucosio (Figura 3B) e l'iniezione dell'insulina (Figura 4B) in topi con infusione di antagonista (MetCCL5) CCL5 rispetto ai topi con aCSF infusione. Questi risultati indicano i danni nella funzione dell'insulina sul metabolismo periferico del glucosio nei topi con MetCCL5 amministrato nel cervello.
Successivamente, abbiamo analizzato l'attivazione del segnale dell'insulina valutando la fosforilazione di IRS-1 e i livelli di attivazione di Akt nei tessuti ipotalamici. La fosforilazione della serina su 302 di IRS-1 è stata indotta in topi trattati con l'antagonista (MetCCL5) (figura 5B-C) quando i topi sono stati alimentati normalmente. Nel gruppo di controllo, è stato amministrato aCSF all'ipotalamo di topi e la sfida di insulina attiva la molecola di segnale a valle Akt (fosforilato Akt serina 473) (Figura 5, F) senza aumentare (attivazione di IRS-1 serine302 Figura 5 -E) e fosforilazione di Akt serine473. Al contrario, il segnale Akt non è stato aumentato di topi infusi con MetCCL5, ma c'era un aumento nella fosforilazione della serina di IRS-1 302 invece. Nel frattempo, bloccando il segnale CCL5 nel cervello del topo interrotto l'attività dell'insulina nell'ipotalamo e nella funzione alterata dell'insulina periferica. Dai nostri risultati globali, ad esempio i risultati dalla ITT, OGTT ed ex vivo sfida dell'insulina, abbiamo concluso che CCL5 nell'ipotalamo contribuisce all'attivazione del segnale dell'insulina e il metabolismo del glucosio periferico dopo stimolazione dell'insulina.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig1.jpg"> 
Figura 1. Procedura chirurgica preparazione e l'impianto della pompa osmotica in mouse. Preparazione di kit e pompa (A), l'infusione di cervello irrorata con soluzione della droga. Le frecce rosse indicano i tubi di catetere riempiti di liquido. (B) Fix e montare la testina del mouse sull'apparato stereotassica. (C) separato lo strato più esterno della pelle dalla pelle sottocutanea per l'impianto di micro-osmotica pompa-cervello set di infusione; Dash linee indicano la posizione degli impianti pompa osmotica. (D), la freccia indica il lato di infusione. (E) eseguire un foro intorno l'area contrassegnata sul cranio. (F) posto l'infusione pompa osmotica-cervello impostato nella parte posteriore del mouse e inserire l'ago di infusione di cervello nel foro (dash cerchiato). (G) fissare l'ago sul cranio usando colla adesivo del tessuto e staccare la parte superiore dell'ago (forbice aguzza in G) come mostrato in (H). (io) guarnizione utilizzando la ferita del tessuto colla adesiva. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig2.jpg"> 
Figura 2. Immagini rappresentative della zona di diffusione di droga quando il farmaco viene somministrato nella regione ventricolare utilizzando la pompa osmotica. Blu di Evan è il rappresentanza farmaco usato per l'illustrazione di infusione pompa osmotica droga nella regione ventricolare (A) e la diffusione nei ventricoli laterali e terzi (B). Barra della scala = 0,5 cm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig2large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig3.jpg"> 
Figura 3. Metabolismo del glucosio dei topi dopo chirurgia misurata con il test di tolleranza al glucosio orale (OGTT). La distribuzione dei livelli di glucosio nel sangue ha cambiato segue la somministrazione orale di glucosio nei topi WT infuso con aCSF (A) e antagonista, CCL5 M(B). Dati riportati come media ± SE. (figura per volta da8). * p &#60; 0.05, mediante ANOVA a due vie. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig4.jpg"> 
Figura 4. Funzione dell'insulina in glucosio nel sangue in topi - il test di tolleranza dell'insulina (ITT). La distribuzione dei livelli di glucosio nel sangue ha cambiato dopo l'iniezione di insulina nei topi WT infuso con aCSF (A) e infuso con antagonista, CCL5 M(B). Dati presentati come media ± SE (figura per volta da8). p &#60; 0,001, mediante ANOVA a due vie. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig5.jpg"> 
Figura 5. Attività di segnalazione dell'insulina nei topi dopo chirurgia. (A) Western blotting di inibitoria forma di fosforilazione di serina 302 di IRS-1 (insulina risposta substrato-1, pIRS1S302) nei tessuti ipotalamo topi trattati con aCSF o antagonista CCL5, MetCCL5 (CCL5M) pompa di infusione. (B) relativi livelli di fosforo-IRS-1S302 dopo infusione nell'ipotalamo di topi con alimentazione normale.(C) macchiare occidentale della fosforilazione di Akt e IRS-1 attivazione (fosforo-Akt S473, pAktS473) con o senza stimolazione dell'insulina nel tessuto ipotalamico dopo aCSF o infusione METCCL5 S302. (D-E) Livelli relativi di pIRS-1S302e pS6KT421pAktS473. (acronimo di "2" in ogni grafico a barre: n = 2 per tutte le quantificazioni). (Le barre vuote in 5D-E, a sinistra: senza insulina; le barre di strisce in 5D-E, a destra: con insulina). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>ID del mouse</td>
			<td>Corpo</td>
			<td>Glucosio</td>
			<td>Inizio</td>
			<td>0</td>
			<td>15</td>
			<td>30</td>
			<td>60</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>peso</td>
			<td>ΜL = 10xBW</td>
			<td>tempo</td>
			<td>min</td>
			<td>min</td>
			<td>min</td>
			<td>min</td>
			<td>min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>501</td>
			<td>25,8 g</td>
			<td>258</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:15</td>
			<td>09:30</td>
			<td>10:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>502</td>
			<td>25,3 g</td>
			<td>253</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:22</td>
			<td>09:37</td>
			<td>10:07</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1. Calendario per la registrazione del Test di tolleranza orale al glucosio (OGTT)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>ID del mouse</td>
			<td>Corpo</td>
			<td>Insulina 0,25 IU</td>
			<td>Inizio</td>
			<td>0</td>
			<td>15</td>
			<td>30</td>
			<td>60</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>peso</td>
			<td>ΜL = 3xBW</td>
			<td>tempo</td>
			<td>min</td>
			<td>min</td>
			<td>min</td>
			<td>min</td>
			<td>min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>501</td>
			<td>28,8 g</td>
			<td>86,4</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:15</td>
			<td>09:30</td>
			<td>10:00</td>
			<td>10:30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>502</td>
			<td>25,3 g</td>
			<td>75,9</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:22</td>
			<td>09:37</td>
			<td>10:07</td>
			<td>10:37</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2. Calendario per la registrazione del Test di tolleranza dell'insulina (ITT)

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Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Questo protocollo studia il ruolo del ligando di chemochina (motivo C-C) 5 (CCL5) nell'ipotalamo fornendo un antagonista, MetCCL5, nel cervello del mouse utilizzando un sistema di infusione cervello pompa micro-osmotica. Questa inibizione transitoria di CCL5 attività interrotta ipotalamico insulina segnalazione, che conduce ad intolleranza al glucosio e la sensibilità periferica dell'insulina sistemica.

Studiando il segnale ipotalamico insulina ad intolleranza al glucosio periferico con un sistema di infusione del farmaco continuo nel cervello del Mouse

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

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10.1K Views.  Taipei Medical University and National Health Research. Questo protocollo studia il ruolo del ligando di chemochina (motivo C-C) 5 (CCL5) nell'ipotalamo fornendo un antagonista, MetCCL5, nel cervello del mouse utilizzando un sistema di infusione cervello pompa micro-osmotica. Questa inibizione transitoria di CCL5 attività interrotta ipotalamico insulina segnalazione, che conduce ad intolleranza al glucosio e la sensibilità periferica dell'insulina sistemica.