Der Autor bedankt sich bei Bhagawat Subramanian, Chang Yi (Jason), Paul Randazzo und Carole Parent fürs Lesen und kommentieren auf dem Manuskript. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Intramurale Research Program des National Cancer Institute, National Institutes of Health.

(1) Beschichtung der Gerichte (Tag 1)
Hinweis: Stellen Sie sicher nicht, Fingerabdrücke oder Schmutz auf der Unterseite der Platte zu verlassen, beim Umgang.
<ol><li>Tauen Sie Maus Kollagen IV auf Eis auf, und verdünnen Sie es mit 50 mM HCl (pH 1.3) um 3 mL einer 10 µg/mL Kollagen IV Lösung vorzubereiten. Hinweis: Kollagen wird Niederschlag bei 37 ° C. Es ist daher wichtig, die Kollagen-Lösung bei niedriger Temperatur zu halten, beim Auftauen und mit ihm arbeiten. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Wechseln durch die Vorbereitung entsprechend dimensionierte Aliquote und speichert sie bei-80 ° C.</li>
	<li>Jede Vertiefung des 12-Well Glas Bodenplatten 250 µL Kollagen IV Lösung hinzu, und legen Sie sie in eine entsprechend dimensionierte, dicht schließender Kunststoff-Box. Feuchten Papiertuch über und um die Platten für die Herstellung einer feuchten Kammer und schließen Sie das Feld zu platzieren. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur. Hinweis: Da nur das Wachstumsfeld werden beschichtet muss, es ist ausreichend, nur das Deckglas abdecken, die an der Unterseite der Platte, die mit Kollagen-Lösung verbunden ist (siehe Abbildung 1A, B für eine schematische Darstellung der Platte).</li>
	<li>Am nächsten Morgen spülen Sie Platten mit entionisiertem H2O zweimal, nicht absorbiert Kollagen und Puffer zu entfernen. Richten Sie das Wasser an den Rand der Platte gut, nicht an den Rand von Platte unten und das Deckglas (wenn Wasser in diesem Bereich können sie Spritzen wird pipettiert) gebildet. Trocknen Sie die Platten in der Laminar-Flow-Haube an der Luft. Platten sofort verwenden oder für bis zu 5 Tage bei 4 ° C lagern. Hinweis: Verschiedene Zelllinien benötigen unterschiedliche Beschichtung, z. B. Fibronektin oder Kollagen ich.</li>
</ol>(2) Beschichtung der Dot-Assay (Tag 2)
<ol><li>
Vorbereitung der Zellsuspension
	<ol>
<li>Zur Vorbereitung der Zellsuspension verwenden Sie Zellen, die angebaut wurden in einer 60 mm Gewebe Kulturschale in DMEM/F12 Medium mit 5 % Pferd Serum zu 80 % Zusammenfluss ergänzt</li>
		<li>Spülen Sie die Zellen mit Kalzium und Magnesium-freie Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) einmal fügen Sie 500 µL Trypsin-EDTA (Raumtemperatur hinzu) und inkubieren Sie die Zellen für 3-5 min. im Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2, feuchte Atmosphäre.</li>
		<li>Aussetzen der freistehenden Zellen in 4,5 mL Kulturmedium zu stoppen Trypsin Aktivität und zählen eine 20 µL aliquoten die Zellsuspension in eine Hemocytometer.</li>
		<li>Pellet-die restlichen Zellen in einem 15 mL konische Röhrchen durch Zentrifugation bei 200 X g 3 min, Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Zellen in Kulturmedium bis 3 x 106 Zellen/mL. Hinweis: Für andere Beschichtung Substraten und/oder Zelllinien, muss die optimale Zelldichte in einer Verdünnungsreihe hergestellt werden. 3 x 106 Zellen/mL empfiehlt sich als Ausgangspunkt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Galvanischen Zellen
	<ol>
<li>Statt einen Tropfen 10 µL Zellsuspension in der Mitte der einzelnen Deckglas des Kollagen IV beschichtet 12-Well Glas Bodenplatte ohne berühren oder kratzen die Beschichtung (Abbildung 1A, B). Inkubieren Sie die Platte für 30 min bei 37 ° C, feuchte Atmosphäre, damit die Zellen befestigen. Check-in einem inversen Mikroskop, dass die Zellen verbunden sind. Hinweis: Dies kann am besten gesehen werden am Rand des Tropfens, wo kann Bildung von einem monomolekularen Film (Abbildung 1C) beobachtet werden. Bei Bedarf, brüten die Platte bis zu 3 h. sicher sein, dass die Luftfeuchtigkeit im Inkubator hoch genug ist, wie die Tropfen schnell austrocknen können. Wird eine Reduzierung des Volumens Tropfen während dieses Schritts eingehalten, fügen Sie PBS hinzu, die Zwischenräume zwischen den Brunnen um die Luftfeuchtigkeit zu erhöhen.</li>
		<li>Waschen Sie vorsichtig die Brunnen mit 1 mL Kulturmedium zweimal um die fraktionslosen Zellen zu entfernen. Fügen Sie 1 mL Kulturmedium in jede Vertiefung. Check-in einem inversen Mikroskop, dass keine schwimmenden Zellen bleiben, sonst die Brunnen wieder waschen. Inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2, befeuchtete Atmosphäre, gut definierte Zelle Blätter zu erhalten. Hinweis: Schwimmende Zellen sind wahrscheinlich auf die Platte wieder anzubringen und zu unerwünschten Zelle Kolonien bilden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Förderung der Zellen (Tag 3)
<ol><li>Überprüfen Sie alle Brunnen mit einem inversen Mikroskop um diese Zelle sicherzustellen, die Kolonien richtig gewachsen sind. Ggf. Markieren Sie ungeeignete Brunnen und verwenden Sie sie nicht.</li>
	<li>Beschriften Sie jede Vertiefung der Platte entsprechend für jede Bedingung untersucht. Führen Sie jede Bedingung in doppelt oder dreifach.</li>
	<li>Ändern Sie das Medium, um die Zellen in DMEM/F12 mit 0,1 % Pferd Serum (hungernden Medium) verhungern 3 h bevor Zellen stimuliert werden.</li>
	<li>Stimulieren die Zellen durch Zugabe von EGF (Endkonzentration 5 ng/mL) oder andere gewünschte Mediatoren und vorsichtig mischen das Medium mit einer 1 mL Micropipettor oder durch Schütteln der Plattenrandes.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte für 1-4 Tage, Rand Verschiebung und Rand Kontur zu beobachten, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben oder Zeitraffer Bildgebung durchführen, wie in Abschnitt 4.2 beschrieben.</li>
</ol>(4) Visualisierung der Zelle Kolonien und Zellwanderung
<ol><li>
Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbung zur Messung der Koloniewachstum (Tag 4-7)
	<ol>
<li>Zellen in 70 % igem Ethanol (1 mL/Na) für ~ 2 min zu beheben.</li>
		<li>Kerne mit Hämatoxylin (1 mL/gut), ~ 2 min. Fleck.</li>
		<li>Waschen Zellen mit Leitungswasser (1 mL/Na) bis Kerne sind blau, 5-10 Minuten.</li>
		<li>Fleck Zytoplasma mit Eosin (1 mL/gut), ~ 2 min.</li>
		<li>Spülen Sie mit entionisiertem Wasser (1 mL/Na). Hinweis: Hämatoxylin und Eosin Lösungen gesammelt und verwendet werden können mehrere Male, bis die Färbung ohnmächtig wird.</li>
		<li>Trocknen Sie Platte an der Luft.</li>
		<li>Drehen Sie die Platte und gemessen Sie der Punkt-Durchmesser mit einem Lineal. Alternativ die Platte mit einer Kamera fotografieren und analysieren des Punkt-Durchmessers in ImageJ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zeitraffer-Mikroskopie (Tag3)
	<ol>
<li>Schalten Sie das Inkubator-Mikroskop und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C. Füllen Sie den Luftbefeuchter mit dH2O. Adjust CO2 auf 5 %. Stellen Sie sicher, dass die Inkubator Kammer befeuchtet ist und dass die motorisierte Bühne frei bewegen kann. Die Inkubator-Kammer in der Nähe und lassen Sie das Mikroskop auf 37 ° c einstellen Hinweis: Das Mikroskop verwendet (siehe Tabelle Material) hier sollte auf 37 ° C für mindestens 3 h erhitzt werden, bevor die Zellen abgebildet werden, um zu vermeiden, driften die Schärfentiefe.</li>
		<li>Die Platte auf der Bühne des Mikroskops Inkubator und richten Sie die Bühne-Liste. Bild zwei gegenüberliegenden Kanten und das Zentrum von jeder Zelle Punkt (Abb. 1A).</li>
		<li>Nehmen Sie Bilder alle 3 min für 15-24 h mit 10 X-Objektiv. Laden Sie die Daten und fahren Sie mit Bildanalyse in einem Programm Ihrer Wahl, z.B.ImageJ oder Matlab.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liang, C. -. C., Park, A. Y., Guan, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration.">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li><li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery.">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li><li>Weiger, M. C., Vedham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+motion+analysis+reveals+cell+directionality+as+an+indicator+of+breast+cancer+progression.">Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression.</a> PLOS ONE. 8 (3), 58859 (2013).</li><li>Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+migration+of+an+epithelial+monolayer+in+response+to+a+model+wound.">Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).</li><li>Sunyer, R., Conte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+durotaxis+emerges+from+long-range+intercellular+force+transmission.">Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission.</a> Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).</li><li>Bazelli&#232;res, E., Conte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+tumor-fibroblast+interactions+increase+tumor+cell+malignancy+by+a+TGF-Beta+mediated+mechanism+in+a+mouse+xenograft+model+of+breast+cancer.">Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer.</a> PLOS ONE. 5 (3), 9832 (2010).</li><li>Normanno, N., De Luca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+signaling+in+cancer.">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer.</a> Gene. 366 (1), 2-16 (2006).</li><li>Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA,+HGF,+and+EGF+utilize+distinct+combinations+of+signaling+pathways+to+promote+migration+and+invasion+of+MDA-MB-231+breast+carcinoma+cells.">LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 13, 501 (2013).</li><li>Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+MCF10CA1+cell+lines+derived+from+premalignant+human+breast+epithelial+MCF10AT+cells.">Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).</li><li>Tang, B., Vu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+switches+from+tumor+suppressor+to+prometastatic+factor+in+a+model+of+breast+cancer+progression.">TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression.</a> J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).</li><li>Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+over+long+time+scales+reveals+distinct+phenotypes.">Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes.</a> Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001 (2016).</li><li>Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+stretching+and+rearrangement+in+epithelial+sheet+migration.">Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration.</a> New J Phys. 15 (2), (2013).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+analysis+of+collective+cell+migration+using+the+wound+healing+assay.">Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay.</a> J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).</li><li>Rosen, P., Misfeldt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+determines+epithelial+migration+in+culture.">Cell density determines epithelial migration in culture.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).</li></ol>

Der Autor hat nichts preisgeben.

Migrieren Sie bei Fortschreiten der Tumorzellen vom Gewebe des Ursprungs das umliegende Gewebe einzudringen und Metastasen in entfernten Standorten15. Wanderung von Zellen von einer Zelle Kolonie kann in der Dot-Probe beobachtet werden. Hier ist der Dot-Test dargestellt, durch die Analyse des wandernden Phänotyps von menschlichen Brustkrebszellen in Reaktion auf EGF.
Um genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten mehrere Schritte bei der Einrichtung des Punktes s...

Migration-Assays sind weit verbreitet, die invasive und metastatische Potential der Tumor Zellen in Vitrozu bewerten. Am häufigsten wird die Wunde oder Kratzer Assay verwendet, um Migration von epithelialen Blätter in eine Zelle gelöscht Bereich1,2,3bewerten. Um der Scratch-Test durchzuführen, sind Zellen in einem monomolekularen Film beschichtet und einen "Kratzer" oder zellfreie Bereich wird mit einer Pipettenspitze erstellt. Der Scratch-Test ist einfach mit handelsüblichen Gewebekultur Lieferungen einzurichten und im Multi-well-Platten, so dass für die Verarbeitung mehrerer Proben durchgeführt werden kann. Jedoch da der Kratzer hergestellt wird, Zellen sind physisch aus der Monolage entfernt und oft durchlaufen Zelltod. Extrazellulärer Matrix an der Platte befestigt ist darüber hinaus oft kratzen dabei beschädigt. Ebenso die Verwendung von Silizium wird eingefügt (z. B. Ibidi Kammern4) oder Schablonen5,6,7 zu mechanischen Störungen der Zellen und der teilweisen Entfernung der Matrixproteine Beschichtung führen die Platten. Ein weiterer Nachteil von Assays Überwachung Verschluss von Wunden oder Kratzer ist ihre begrenzte Zeit natürlich da Zellwanderung nur analysiert werden kann, bis der Kratzer geschlossen wird.
Bei der Durchführung des Dot-Tests, sind Zellen als eine kreisförmige Kolonie auf einer beschichteten oder unbeschichteten Platte8vergoldet. Die Gründe für diese Beschichtung-Strategie soll Zelle Blätter mit definierten Kanten zu erhalten, die dringen in die Zelle-freie Umgebung ohne zu stören die Kultur durch Abbau von Zellen oder Beilagen oder migrieren können. Das übergeordnete Ziel des Dot-Assays ist Migration der Zelle Blätter gemessen am Rande Verschiebung oder Kolonie Durchmesser, sowie hinsichtlich durchführen, Time-Lapse imaging zu analysieren, die wandernden Phänotyp der Zellen in räumlich-zeitliche Auflösung beobachten.
Zellwanderung kann durch eine Vielzahl von microenvironmental Signale wie Chemokine, Zytokine und Wachstumsfaktoren wie EGF beeinträchtigt werden. EGF ist ein Wachstumsfaktor, der übt seine biologische Wirkung über Bindung an seinen Rezeptor EGF-Rezeptor-9, und invasive und metastasierten Verhalten von Tumor Zellen4,9,10erhöht. Hier ist der Dot-Test zur Untersuchung EGF stimuliert Zellwanderung in eine menschliche invasive, Lunge koloniebildenden Brust Krebs Zelle Linie (MCF10CA1a)8,11,12.

<table><tbody><tr><td>MCF10CA1a cells</td><td>Karmanos Research Institute</td><td>N/A</td><td>cells used for assay</td></tr><tr><td>mouse collagen IV</td><td>BD Biosciences</td><td>354233</td><td>used to coat plates</td></tr><tr><td>trypsin / EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300054</td><td>used to remove cells from tissue culture plates</td></tr><tr><td>DPBS&amp;nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td>used to wash cells</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320082</td><td>used as culture medium</td></tr><tr><td>horse serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>26050088</td><td>used to supplement culture medium</td></tr><tr><td>12 well glass bottom plate</td><td>MatTek</td><td>P12G-1.5-14-F</td><td>used to grow cells for imaging</td></tr><tr><td>EGF (epidermal growth factor, human recombinant)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>used to stimulate cells</td></tr><tr><td>fatty acid free BSA</td><td>Sigma</td><td>A8806-1G</td><td>used to make buffer for EGF</td></tr><tr><td>hematoxylin</td><td>Sigma</td><td>HHS32</td><td>used to stain colonies</td></tr><tr><td>eosin</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26051-10</td><td>used to stain colonies</td></tr><tr><td>37 &amp;#176;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Sanyo</td><td>model MCO-18AIC (UV)</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage</td><td>Zeiss</td><td>model Axio Observer.Z1</td><td>used for time lapse imaging</td></tr><tr><td>ORCA Flash LT sCMOS camera</td><td>BioVision</td><td>C11440-42U-KIT</td><td>used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>BioVision</td><td>MMACQMIC</td><td>software used for time lapse imaging</td></tr><tr><td>inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>model IX70</td><td>used to count cells and to check colonies in tissue culture</td></tr><tr><td>plastic box</td><td>Lock&amp;amp;Lock</td><td>N/A</td><td>used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)</td></tr></tbody></table>

using the dot assay to analyze migration of cell sheets

Auch wenn komplexe Organismen statisch erscheinen, sind ihre Gewebe unter einem kontinuierlichen Umsatz. Als Alter Zellen, bewegen sterben und werden durch neue Zellen ersetzt Zellen in den Geweben in gewissem Sinne dicht orchestrierte. Während der Entwicklung von Tumoren ist dieses Gleichgewicht gestört, und Tumorzellen lassen das Epithel des Ursprungs, der lokalen Mikroumgebung, ferne Orte bereisen und bilden schließlich metastasierten Tumoren an entfernten Standorten zu erobern. Die Dot-Assay ist ein einfache, zweidimensionale ungezwungene Migration Assay, Nettobewegung Zelle Blätter in einem zellfreien Bereich bewerten und Parameter der Zellwanderung mit Zeitraffer-Bildgebung zu analysieren. Hier der Dot-Test zeigt sich mit einem menschlichen invasive, Lunge koloniebildenden Brust-Krebs-Zell-Linie, MCF10CA1a, wandernden Reaktion der Zellen auf epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), analysieren die bekannt ist, bösartige Potenzial von Brustkrebs-Zellen zu erhöhen und die wandernden Phänotyp der Zellen ändern.

Die Dot-Assay präsentiert hier (Abbildung 1) erfolgte mittels invasiver, Lunge koloniebildenden Brustkrebs-Zellen (MCF10CA1a) als Modellsystem. Der Dot-Test ergibt hoch reproduzierbare Zelle Punkte selbst in der Hand von Anfängern, so dass es eine bequeme und leicht auszuführende Assay (Abbildung 1D). Die Dot-Assay kombiniert mit er Färbung oder Zeitraffer Bildgebung und nachfolgenden Partikel Image Velocimet...

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Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Mit Hilfe der Dot-Assay, Migration der Zelle Blätter zu analysieren

Zellmigration ist entscheidend für Entwicklung, Gewebe-Wartung und Reparatur und Tumorgenese und wird durch Zytokine, Wachstumsfaktoren und Chemokine reguliert. Dieses Protokoll beschreibt Dot-Test, eine zweidimensionale, ungezwungene Migration Assay den wandernden Phänotyp der beigefügten, geschlossene Zelle Blätter als Reaktion auf microenvironmental Hinweise zu beurteilen.

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

using-the-dot-assay-to-analyze-migration-of-cell-sheets

Research

JoVE Journal

Cancer Research

6.8K Aufrufe.  National Institutes of Health. Zellmigration ist entscheidend für Entwicklung, Gewebe-Wartung und Reparatur und Tumorgenese und wird durch Zytokine, Wachstumsfaktoren und Chemokine reguliert. Dieses Protokoll beschreibt Dot-Test, eine zweidimensionale, ungezwungene Migration Assay den wandernden Phänotyp der beigefügten, geschlossene Zelle Blätter als Reaktion auf microenvironmental Hinweise zu beurteilen.

Serie: Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Bewertung der Endothelzellmigration nach der Exposition gegenüber toxischen Chemikalien

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

Bewertung der Zelle Invasion und Migration-Prozess: ein Vergleich des Video Mikroskop-basierte Kratzers Wunde Assay und der Boyden Kammer-Test

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Krebsforschung

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

Eine einfache Migration/Invasion Workflow mit einer automatisierten Leben-Zelle-Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

Studium der Zellmigration in Microfabricated Kanäle

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Biotechnik

From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a consequence, for the clinical management of patients. In the present work we will describe an optimized proteomic approach for the identification of molecules involved in the progression of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). In detail, leukemic cell lysates are resolved by 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and visualized as &#8220;spots&#8221; on the 2DE gels. Comparative analysis of proteomic maps allows the identification of differentially expressed proteins (in terms of abundance and post-translational modifications) that are picked, isolated and identified by Mass Spectrometry (MS). The biological function of the identified candidates can be tested by different assays (i.e. migration, adhesion and F-actin polymerization), that we have optimized for primary leukemic cells.

Here we describe a protocol that couples two proteomic techniques, namely 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and Mass Spectrometry (MS), to identify differentially expressed/post-translational modified proteins among two or more groups of primary samples. This approach, together with functional experiments, allows the identification and characterization of prognostic markers/therapeutic targets.

Von einem 2DE-Gel-Spot die Proteinfunktion: Lektion gelernt von HS1 in chronischer lymphatischer Leukämie

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

Medizin

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Migration, Chemo-Attraktion und Co-Culture-Assays für menschliche Stammzell-abgeleitete Endothelzellen und GABAerge Neuronen

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Neurowissenschaften

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

Quantifizierung der dreidimensionalen Zellmigration innerhalb und in granuläre Hydrogel-Biomaterialien

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between cells, the extracellular matrix, and soluble and non-soluble chemical factors (e.g., chemoattractants). Standard methods for measuring the migration of cells, such as the Boyden chamber assay, work by counting cells on either side of a divider. These techniques are easy to use; however, they offer little geometric modification for different applications. In contrast, microfluidic devices can be used to observe cell migration with customizable concentration gradients of soluble factors1,2. However, methods for making microfluidics based assays can be difficult to learn.
Here, we describe an easy method for creating cell culture chambers to measure cell migration in response to chemical concentration gradients. Our cell migration chamber method can create different linear concentration gradients in order to study cell migration for a variety of applications. This method is relatively easy to use and is typically performed by undergraduate students.
The microchannel chamber was created by placing an acrylic insert in the shape of the final microchannel chamber well into a Petri dish. After this, poly(dimethylsiloxane) (PDMS) was poured on top of the insert. The PDMS was allowed to harden and then the insert was removed. This allowed for the creation of wells in any desired shape or size. Cells may be subsequently added to the microchannel chamber, and soluble agents can be added to one of the wells by soaking an agarose block in the desired agent. The agarose block is added to one of the wells, and time-lapse images can be taken of the microchannel chamber in order to quantify cell migration. Variations to this method can be made for a given application, making this method highly customizable.

This protocol details a customizable method to measure cell migration in response to chemoattractants that may also be used to determine the diffusion rate of a drug out of a polymer matrix.

Eine Anpassbare Kammer zur Messung der Zellmigration

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

Biologie

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

Einzelzelle Durotaxis Assay zur Beurteilung der mechanischen Steuerung der zellulären Bewegung und verwandter Signalereignisse

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

The Transwell Migration Assay

Cells migration in response to chemical cues is crucial to development, immunity and disease states such as cancer. To quantify cell migration, a simple assay was developed in 1961 by Dr. Stephen Boyden, which is now known as the transwell migration assay or Boyden chamber assay. This set-up consists an insert which separates the wells of a multiwell plate into top and bottom compartments. Cells whose migration is to be studied are seeded into the top compartment and the chemoattractant solution is placed in the bottom compartment. After incubation, counting the cells in the bottom compartment allows quantification of migration induced by chemoattractants.
This video will review the commonly used experimental set-up for cell migration studies. Then we'll highlight a few key considerations, and outline a generalized protocol for running an experiment involving adherent cells. Lastly, we'll review various adaptations of this set-up currently being used to study different factors that affect migration.

The Transwell Migration Assay and Chemo-attractants

Der Transwell-Migration-Assay

Cells migration in response to chemical cues is crucial to development, immunity and disease states such as cancer.  To quantify cell migration, a simple ...