המחבר מבקש להודות Bhagawat סבראמאניאן, צ'נג יי (ג'ייסון), פול Randazzo, קרול האב לקרוא ולהעיר על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מגזר תוכנית המחקר של המכון הלאומי לסרטן, מכוני הבריאות הלאומיים.

1. ציפוי של מנות (יום 1)
הערה: הקפד לא להשאיר טביעות אצבעות או לכלוך בתחתית הצלחת בעת טיפול זה.
<ol><li>הפשרת העכבר קולגן הרביעי על קרח, לדלל את זה עם 50 מ"מ HCl (pH 1.3) להכין 3 מ"ל של פתרון הרביעי 10 µg/mL קולגן. הערה: קולגן לזרז ב 37 º C. לכן חשוב לשמור את הפתרון קולגן בטמפרטורה נמוכה בעת מפשיר ובעבודה עם זה. להימנע מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה על-ידי הכנת aliquots בגודל מתאים ואחסונם ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להוסיף 250 פתרון קולגן הרביעי µL כל טוב של לוחות זכוכית 12-ובכן, למקם אותם לתוך קופסת פלסטיק בגודל מתאים, סגירה הדוקה. מניחים מגבת נייר רטובה מעל ומסביב הלוחות מייצרים תא לח ולסגור את תיבת. דגירה הלוחות ללילה בטמפרטורת החדר. הערה: כפי רק את אזור הגידול צריך להיות מצופה, זה מספיק לכסות רק על הרכב כיסוי, אשר מצורף בתחתית הלוח, עם פתרון קולגן (ראה איור 1A, B עבור סכימטי של צלחת).</li>
	<li>למחרת בבוקר לשטוף צלחות עם יונים H2O פעמיים כדי להסיר קולגן שאינו נספג ומאגר. לכוון את המים עד לקצה הלוח לא עד הקצה שהוקמה על ידי בתחתית צלחת של coverslip (אם מים זה pipetted לתוך האיזור שזה ישחה). מילה נהדרת הלוחות בשכונה זרימה שכבתית. השתמש צלחות מיד או לאחסן ב 4 ° C עד 5 ימים. הערה: שורות תאים שונים עשויים לדרוש שונים ציפוי, כגון fibronectin או קולגן אני.</li>
</ol>2. ציפוי וזמינותו נקודה (יום 2)
<ol><li>
הכנת התליה תא
	<ol>
<li>כדי להכין תא ההשעיה, להשתמש בתאים כך כבר גדלו בקערה תרביות רקמה 60 מ מ בינוני DMEM/F12 בתוספת 5% סרום סוס כדי 80% הנהרות</li>
		<li>לשטוף את התאים בתמיסת פוספט באגירה של סידן, מגנזיום-ללא Dulbecco (DPBS) פעם אחת, להוסיף µL 500 טריפסין-EDTA (בטמפרטורת החדר), דגירה התאים למשך 3-5 דקות באינקובטור 37 ° C, 5% CO2, אווירה humidified.</li>
		<li>להשעות את התאים מנותקת במדיום תרבות 4.5 מ ל להפסיק פעילות טריפסין, נחשב 20 µL aliquot של התליה תא ב hemocytometer.</li>
		<li>גלולה התאים הנותרים צינור חרוטי 15 מ"ל על ידי צנטריפוגה ב g x 200 למשך 3 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע ולאחר resuspend את התאים תרבות בינוני 3 x 106 תאים/מ ל.... הערה: עבור אחרים ציפוי דיאלקטריים ו/או שורות תאים, צפיפות תא אופטימלי יש ליצור בסדרה דילול. 3 x 106 תאים למ"ל מומלצת כנקודת התחלה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תאי ציפוי
	<ol>
<li>המקום טיפת 10 µL תא ההשעיה במרכזו של כל תלוש הכיסוי של הקולגן הרביעי מצופה צלחת זכוכית 12-ובכן התחתון בלי לגעת או לשרוט את הציפוי (איור 1א', ב'). דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, האווירה humidified, כדי לאפשר את התאים לצרף. צ'ק במיקרוסקופ הפוך התאים מחוברים. הערה: ניתן בצורה הטובה ביותר לראות בקצה הירידה, איפה היווצרות טפט יכול להיות שנצפו (איור 1C). במידת הצורך, דגירה את הצלחת עד ה 3 להיות בטוח כי הלחות בחממה הוא מספיק גבוה כפי הטיפות יכול להתייבש במהירות. אם נצפית ירידה של אמצעי האחסון טיפה במהלך שלב זה, להוסיף החללים בין הבארות כדי להגדיל את הלחות PBS.</li>
		<li>יש לשטוף בעדינות הבארות עם 1 מ"ל של תרבות בינוני פעמיים כדי להסיר תאים שאינם מצורפים. להוסיף 1 מ"ל תרבות בינוני כל טוב. צ'ק במיקרוסקופ הפוך כי לא התאים צפים נשארים, אחרת לשטוף שוב את הבארות. דגירה תאים בין לילה-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, האווירה humidified, כדי לקבל גיליונות תא מוגדרים היטב. הערה: תאים צף סביר כדי לצרף מחדש הצלחת ואת להקים מושבות תאים לא רצויים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. גירוי תאים (יום 3)
<ol><li>בדוק כל הבארות באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שתא מושבות גדלו כראוי. במידת הצורך, מארק בארות ומבניות, אל תשתמש בהם.</li>
	<li>תווית מכל קידוח של צלחת הולם עבור כל תנאי חקר. הפעל כל תנאי כפול או משולש.</li>
	<li>לשנות את המדיום לרעוב התאים DMEM/F12 המכיל סרום הסוס 0.1% (רעב בינוני) h 3 לפני התאים הם גירוי.</li>
	<li>לגרות את התאים על ידי תוספת של EGF (ריכוז סופי 5 ng/mL) או עוד מגשרים הרצוי ומערבבים בעדינות את המדיום באמצעות micropipettor 1 מ"ל או על-ידי מתערבל לצלחת.</li>
	<li>דגירה שלוחית 1-4 ימים לבחון את קצה הזחה וירידה קצה מתאר כמתואר בסעיף 4.1 או לבצע הדמיה בצילום מואץ כמתואר בסעיף 4.2.</li>
</ol>4. ויזואליזציה של מושבות תאים, נדידת תאים
<ol><li>
Hematoxylin-אאוזין (הוא) צביעת למדידת צמיחה המושבה (היום 4-7)
	<ol>
<li>לתקן תאים ב- 70% אתנול (1 מ"ל/טוב) ~ 2 דקות.</li>
		<li>כתם גרעינים עם hematoxylin (1 מ"ל/טוב), ~ 2 דקות.</li>
		<li>תאים תשטוף עם מים מהברז (1 מ"ל/טוב) עד הגרעינים הם כחול, 5-10 דקות.</li>
		<li>הציטופלסמה הכתם עם אאוזין (1 מ"ל/טוב), ~ 2 דקות.</li>
		<li>לשטוף עם מים יונים (1 מ"ל/טוב). הערה: Hematoxylin ופתרונות אאוזין יכול להיות ונשתמש בהם מספר פעמים עד ההכתמה הופך להיות חלש.</li>
		<li>מילה נהדרת צלחת.</li>
		<li>הפוך את הצלחת ולמדוד את הקוטר נקודה עם סרגל. לחלופין, לצלם תמונות של הצלחת עם מצלמה, ולנתח נקודה בקוטר של ImageJ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
זמן לשגות מיקרוסקופ (3 ביום)
	<ol>
<li>. הפעילי את המיקרוסקופ חממה ולהתאים את הטמפרטורה ל- 37 מעלות צלזיוס. למלא מעשיר dH2O. התאם CO2 ל 5%. ודא כי תא חממה הוא humidified כי השלב ממונע יכול לנוע בחופשיות. לסגור את תא חממה ולאפשר המיקרוסקופ להסתגל 37 מעלות צלזיוס. הערה: המיקרוסקופ (ראה טבלה של החומרים) להשתמש כאן צריך להיות מחומם עד 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות לפני התאים הם צילמו כדי למנוע היסחפות של המוקד.</li>
		<li>למקם את הצלחת על השלב של המיקרוסקופ חממה והגדר את הרשימה הבמה. תמונת שני קצוות מנוגדים, המרכז של כל נקודה תא (איור 1א').</li>
		<li>קח תמונות כל 3 דקות, עבור h 15-24 באמצעות המטרה X 10. להוריד את הנתונים ולהמשיך עם ניתוח תמונות בתוכנית של בחירה, למשל, ImageJ או Matlab.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liang, C. -. C., Park, A. Y., Guan, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration.">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li><li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery.">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li><li>Weiger, M. C., Vedham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+motion+analysis+reveals+cell+directionality+as+an+indicator+of+breast+cancer+progression.">Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression.</a> PLOS ONE. 8 (3), 58859 (2013).</li><li>Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+migration+of+an+epithelial+monolayer+in+response+to+a+model+wound.">Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).</li><li>Sunyer, R., Conte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+durotaxis+emerges+from+long-range+intercellular+force+transmission.">Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission.</a> Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).</li><li>Bazelli&#232;res, E., Conte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+tumor-fibroblast+interactions+increase+tumor+cell+malignancy+by+a+TGF-Beta+mediated+mechanism+in+a+mouse+xenograft+model+of+breast+cancer.">Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer.</a> PLOS ONE. 5 (3), 9832 (2010).</li><li>Normanno, N., De Luca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+signaling+in+cancer.">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer.</a> Gene. 366 (1), 2-16 (2006).</li><li>Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA,+HGF,+and+EGF+utilize+distinct+combinations+of+signaling+pathways+to+promote+migration+and+invasion+of+MDA-MB-231+breast+carcinoma+cells.">LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 13, 501 (2013).</li><li>Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+MCF10CA1+cell+lines+derived+from+premalignant+human+breast+epithelial+MCF10AT+cells.">Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).</li><li>Tang, B., Vu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+switches+from+tumor+suppressor+to+prometastatic+factor+in+a+model+of+breast+cancer+progression.">TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression.</a> J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).</li><li>Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+over+long+time+scales+reveals+distinct+phenotypes.">Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes.</a> Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001 (2016).</li><li>Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+stretching+and+rearrangement+in+epithelial+sheet+migration.">Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration.</a> New J Phys. 15 (2), (2013).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+analysis+of+collective+cell+migration+using+the+wound+healing+assay.">Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay.</a> J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).</li><li>Rosen, P., Misfeldt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+determines+epithelial+migration+in+culture.">Cell density determines epithelial migration in culture.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).</li></ol>

המחבר אין לחשוף.

במהלך הגידול התקדמות התאים נודדים מן הרקמה ממוצא לפלוש הרקמה שמסביב, גרורות באתרים מרוחקים15. נדידה של תאים מן מושבה התא יכול להיות שנצפו ב- dot וזמינותו. . הנה, וזמינותו נקודה מודגם על ידי ניתוח של פנוטיפ הנדידה של תאי סרטן השד אנושי בתגובה EGF.
כדי להשיג תוצאות מדוי...

העברת מבחני נמצאים בשימוש נרחב כדי להעריך את הפוטנציאל פולשני ולא גרורתי של גידול תאים במבחנה. הנפוץ ביותר הפצע או גירוד assay משמש כדי להעריך את ההעברה של אפיתל גיליונות2,31,אזור תא מסומנת. כדי לבצע את הבדיקה מאפס, התאים הם מצופים לתוך טפט, "שריטה" או מאזור תא נוצר עם טיפ פיפטה. וזמינותו גירוד קל להגדיר עם תרביות רקמה זמין נפוץ אספקה, ניתן לבצע גם צלחות רב טוב, ומאפשרת עיבוד של דגימות מרובים. עם זאת, כפי השריטה נעשית, התאים יוסרו פיזית טפט, לעיתים קרובות עוברים מוות של תאים. יתר על כן, מטריצה חוץ-תאית מחובר לצלחת פגום לעיתים קרובות במהלך התהליך של גירוד. בדומה לכך, השימוש של סיליקון מוסיף (כגון Ibidi צ'יימברס4) או של סטנסילים5,6,7 יכול להוביל להפרעה מכנית של התאים הסרת חלקי של מטריקס חלבון ציפוי צלחות. חיסרון נוסף של מבחני פיקוח על סגירתו של פצעים או שריטות הוא קורס שלהם לזמן מוגבל, רק יכול להיות מנותח נדידת תאים עד השריטה סגורה.
ביצוע וזמינותו נקודה, התאים הם מצופה כמושבה מעגלית על גבי צלחת עם או בלי ציפוי8. הרציונל שאסטרטגיה זו ציפוי הוא לקבל תא סדינים עם קצוות מוגדרים, שניתן להעביר או לפלוש לתוך האזורים הסמוכים נטול תאים מבלי להפריע את התרבות על ידי הסרה של תאים או מוסיף. המטרה הכוללת של וזמינותו נקודה היא לבחון את ההעברה של גיליונות תא כפי שנמדד על-ידי קצה העקירה או מושבת קוטר, כמו גם כדי לבצע הדמיה בצילום מואץ כדי לנתח את פנוטיפ הנדידה של תאים בעתיים רזולוציה גבוהה יותר.
נדידת תאים יכולים להיות מושפעים מגוון של רמזים microenvironmental כמו נוגדנים, ציטוקינים גורמי גדילה כגון EGF. EGF הוא פקטור גדילה זה מפעיל את השפעותיו ביולוגי באמצעות קשירה לקולטן שלו, EGF קולטן9, ומגביר את התנהגות פולשנית ולא גרורתי של גידול תאים4,9,10. כאן, וזמינותו נקודה משמש ללמוד EGF מגורה נדידת תאים במושבה האנושי פולשני, ריאות ויוצרים השד סרטן תא קו (MCF10CA1a)8,11,12.

<table><tbody><tr><td>MCF10CA1a cells</td><td>Karmanos Research Institute</td><td>N/A</td><td>cells used for assay</td></tr><tr><td>mouse collagen IV</td><td>BD Biosciences</td><td>354233</td><td>used to coat plates</td></tr><tr><td>trypsin / EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300054</td><td>used to remove cells from tissue culture plates</td></tr><tr><td>DPBS&amp;nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td>used to wash cells</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320082</td><td>used as culture medium</td></tr><tr><td>horse serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>26050088</td><td>used to supplement culture medium</td></tr><tr><td>12 well glass bottom plate</td><td>MatTek</td><td>P12G-1.5-14-F</td><td>used to grow cells for imaging</td></tr><tr><td>EGF (epidermal growth factor, human recombinant)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>used to stimulate cells</td></tr><tr><td>fatty acid free BSA</td><td>Sigma</td><td>A8806-1G</td><td>used to make buffer for EGF</td></tr><tr><td>hematoxylin</td><td>Sigma</td><td>HHS32</td><td>used to stain colonies</td></tr><tr><td>eosin</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26051-10</td><td>used to stain colonies</td></tr><tr><td>37 &amp;#176;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Sanyo</td><td>model MCO-18AIC (UV)</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage</td><td>Zeiss</td><td>model Axio Observer.Z1</td><td>used for time lapse imaging</td></tr><tr><td>ORCA Flash LT sCMOS camera</td><td>BioVision</td><td>C11440-42U-KIT</td><td>used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>BioVision</td><td>MMACQMIC</td><td>software used for time lapse imaging</td></tr><tr><td>inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>model IX70</td><td>used to count cells and to check colonies in tissue culture</td></tr><tr><td>plastic box</td><td>Lock&amp;amp;Lock</td><td>N/A</td><td>used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)</td></tr></tbody></table>

using the dot assay to analyze migration of cell sheets

אף אורגניזם מורכב מופיעות סטטי, הרקמות שלהם נמצאים תחת מחזור רציף. כמו תאים גיל, למות, והם יוחלפו על ידי תאים חדשים, תאים להעביר בתוך רקמות באופן הדוק מתוזמר. במהלך התפתחות גידולים, את האיזון מופר, ולהשאיר תאים סרטניים האפיתל ממוצא לפלוש את microenvironment המקומי, כדי לנסוע לאתרים מרוחקים, ובסופו של דבר להקים גידולים גרורות באתרים מרוחקים. וזמינותו נקודה היא assay פשוטה, מימדי ההעברה ללא הגבלה, כדי להעריך את התנועה נטו של גיליונות תא לתוך אזור ללא תא, וכדי לנתח את הפרמטרים של נדידת תאים באמצעות הדמיה בצילום מואץ. . הנה, וזמינותו נקודה הוכח שימוש של האדם פולשני, ריאות המושבה ויוצרים השד סרטן תאים בטור, MCF10CA1a, כדי לנתח בתגובה הנדידה התאים גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), אשר ידוע כדי להגדיל את פוטנציאל ממאיר של תאים סרטניים בשד, כדי לשנות את פנוטיפ הנדידה של תאים.

וזמינותו נקודה המובאת כאן (איור 1) בוצעה באמצעות פולשני, ריאות המושבה ויוצרים תאים סרטניים בשד (MCF10CA1a) כמערכת מודל. וזמינותו נקודה התשואות תא מאוד לשחזור נקודות אפילו בידו של מתחילים נוחה וקלה לביצוע assay (איור 1D). וזמינותו נקודה בשי?...

Watch this Scientific Journal Video about Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets at JoVE.com

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

באמצעות וזמינותו נקודה כדי לנתח את ההעברה של גיליונות תא

נדידת תאים הוא חיוני עבור פיתוח, רקמות תחזוקה ותיקון, ו tumorigenesis, מוסדר על ידי גורמי גדילה, נוגדנים, ציטוקינים. פרוטוקול זה מתאר נקודה וזמינותו, העברה דו מימדי, ולמשחקי הנועד להעריך את פנוטיפ הנדידה של גיליונות המצורפת, מלוכדת תא בתגובה רמזים microenvironmental.

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

using-the-dot-assay-to-analyze-migration-of-cell-sheets

Research

JoVE Journal

Cancer Research

6.8K Views.  National Institutes of Health. נדידת תאים הוא חיוני עבור פיתוח, רקמות תחזוקה ותיקון, ו tumorigenesis, מוסדר על ידי גורמי גדילה, נוגדנים, ציטוקינים. פרוטוקול זה מתאר נקודה וזמינותו, העברה דו מימדי, ולמשחקי הנועד להעריך את פנוטיפ הנדידה של גיליונות המצורפת, מלוכדת תא בתגובה רמזים microenvironmental.

Video: Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

הערכה של נדידת תאי האנדותל לאחר חשיפה לכימיקלים רעילים

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Developmental Biology

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

חקר נדידת תאים בערוצי Microfabricated

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Bioengineering

From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a consequence, for the clinical management of patients. In the present work we will describe an optimized proteomic approach for the identification of molecules involved in the progression of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). In detail, leukemic cell lysates are resolved by 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and visualized as &#8220;spots&#8221; on the 2DE gels. Comparative analysis of proteomic maps allows the identification of differentially expressed proteins (in terms of abundance and post-translational modifications) that are picked, isolated and identified by Mass Spectrometry (MS). The biological function of the identified candidates can be tested by different assays (i.e. migration, adhesion and F-actin polymerization), that we have optimized for primary leukemic cells.

Here we describe a protocol that couples two proteomic techniques, namely 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and Mass Spectrometry (MS), to identify differentially expressed/post-translational modified proteins among two or more groups of primary samples. This approach, together with functional experiments, allows the identification and characterization of prognostic markers/therapeutic targets.

מספוט 2DE-ג&#39;ל לתפקוד חלבון: לקח מHS1 בכרוני לימפוציטית לוקמיה

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

Medicine

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Neuroscience

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

כימות נדידת תאים תלת מימדית בתוך ובתוך ביו-חומרים הידרוג'ל גרגירים

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between cells, the extracellular matrix, and soluble and non-soluble chemical factors (e.g., chemoattractants). Standard methods for measuring the migration of cells, such as the Boyden chamber assay, work by counting cells on either side of a divider. These techniques are easy to use; however, they offer little geometric modification for different applications. In contrast, microfluidic devices can be used to observe cell migration with customizable concentration gradients of soluble factors1,2. However, methods for making microfluidics based assays can be difficult to learn.
Here, we describe an easy method for creating cell culture chambers to measure cell migration in response to chemical concentration gradients. Our cell migration chamber method can create different linear concentration gradients in order to study cell migration for a variety of applications. This method is relatively easy to use and is typically performed by undergraduate students.
The microchannel chamber was created by placing an acrylic insert in the shape of the final microchannel chamber well into a Petri dish. After this, poly(dimethylsiloxane) (PDMS) was poured on top of the insert. The PDMS was allowed to harden and then the insert was removed. This allowed for the creation of wells in any desired shape or size. Cells may be subsequently added to the microchannel chamber, and soluble agents can be added to one of the wells by soaking an agarose block in the desired agent. The agarose block is added to one of the wells, and time-lapse images can be taken of the microchannel chamber in order to quantify cell migration. Variations to this method can be made for a given application, making this method highly customizable.

This protocol details a customizable method to measure cell migration in response to chemoattractants that may also be used to determine the diffusion rate of a drug out of a polymer matrix.

תא להתאמה אישי עבור נדידת תאים מדידות

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

Biology

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

מערכת בודדת של תא להערכת בקרה מכנית של התנועה הסלולרית ואירועי איתות קשורים

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

The Transwell Migration Assay

Cells migration in response to chemical cues is crucial to development, immunity and disease states such as cancer. To quantify cell migration, a simple assay was developed in 1961 by Dr. Stephen Boyden, which is now known as the transwell migration assay or Boyden chamber assay. This set-up consists an insert which separates the wells of a multiwell plate into top and bottom compartments. Cells whose migration is to be studied are seeded into the top compartment and the chemoattractant solution is placed in the bottom compartment. After incubation, counting the cells in the bottom compartment allows quantification of migration induced by chemoattractants.
This video will review the commonly used experimental set-up for cell migration studies. Then we'll highlight a few key considerations, and outline a generalized protocol for running an experiment involving adherent cells. Lastly, we'll review various adaptations of this set-up currently being used to study different factors that affect migration.

The Transwell Migration Assay and Chemo-attractants

אסיית ההגירה של טרנסוול

Cells migration in response to chemical cues is crucial to development, immunity and disease states such as cancer.  To quantify cell migration, a simple ...