Die Autoren danken Dr. Vasily Gurchenkov (Institut Curie) für Bild-Erfassung und Verarbeitung in Abbildung 3 und PICT-IBISA Imaging Facility (Institut Curie). Komplexe in vitro zellulären Modellen - Diese Arbeit wurde von ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 und PIC 3D unterstützt.

1. TAMRA-Kollagen I Labeling <ol><li> Bereiten Sie eine 10 mg / ml Lösung TAMRA durch Zugabe von 2,5 ml DMSO mit dem mitgelieferten 25 mg TAMRA Pulver. Löse es durch Vortexen bis zur vollständigen Auflösung. Lagerung bei -20 º C und vor Licht schützen. </li><li> Bereiten 2 l Labeling Buffer (0,25 M NaHCO 3, 0,4 M NaCl). Der pH-Wert auf 9,5 mit 10 M NaOH-Lösung. Halten bei 4 º C. Ab diesem Zeitpunkt werden alle Operationen bei 4 º C durchgeführt soweit nicht anders angegeben und fluoreszierendes Material von Licht mit Aluminiumfolie geschützt ist. </li><li> Füllen Sie eine 1 ml Einwegspritze mit 1 ml hochkonzentrierte Rattenschwanzkollagen I-Lösung. Hohe Konzentration Kollagen-Lösungen werden in der Regel in Konzentrationen von etwa 10 mg / ml zur Verfügung gestellt und sind sehr viskos. Seien Sie sicher, es langsam zu manipulieren, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. </li><li> Mit einer 21 G Kanüle injizieren das Kollagen in eine vorgetränkten 3 ml Dialysekassette von 10.000 MWCO abgeschnitten. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden damaGing der Membran mit der Nadel. Entfernen Sie alle Luft aus dem Dialysekassette durch Hochziehen Kolben der Spritze. Dialysieren es über Nacht gegen 1 l Labeling Buffer. </li><li> Mischen Sie 100 ul von 10 mg / ml Lösung TAMRA mit 900 ul Labeling Buffer. Hinweis: Dies sollte sowohl mit TAMRA Lösung und Labeling Buffer bei Raumtemperatur durchgeführt werden, da DMSO gefriert bei 4 º C. Nach dem Mischen, bringen die verdünnte Lösung TAMRA wieder auf 4 º C. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Kollagen aus der Dialyse-Kassette mit einer 2 ml Einwegspritze mit einer 21 G Kanüle. Mischen Sie 1 ml der dialysierten Kollagen-Lösung mit 1 ml der verdünnten Lösung durch Pipettieren TAMRA. </li><li> Übertragen Sie die Kollagen / TAMRA Mischung in eine 2 ml Mikrozentrifugenröhrchens und Inkubation über Nacht mit Drehung. </li><li> Übertragen Sie die 2 ml TAMRA-markiertes Kollagen in einer vorgetränkten 3 ml Dialysekassette und Dialyse gegen 1 l Labeling Buffer um den Überschuss an freiem Farbstoff zu entfernen Übernachtung. </li><li> Um die TAMRA-lab wiederherstelleneLED Kollagen an das Kollagen ursprüngliche Lösung, platzieren Sie den Dialyse-Kassette in 1 L von 0,2% (v / v) Essigsäure-Lösung, pH 4 und Dialyse über Nacht. </li><li> Messen der Endvolumen des TAMRA-markiertes Kollagen und berechnet seine Endkonzentration angesichts der ursprünglichen Volumens und der Konzentration der Collagen-Lösung verwendet. Lagern bei 4 º C. </li></ol> 2. 3D TAMRA-Kollagen-Matrices mit Embedded Einzelzellen <ol><li> Berechnen des Volumens von 2 mg / ml Collagen TAMRA-Mix, die für das Experiment. Immer werden 20% mehr zu berücksichtigen Pipettierverlusten aufgrund der Kollagen hohe Viskosität. </li><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 10x PBS und 1 N NaOH. Filtern sterilisieren und bei 4 º C zu halten Von diesem Punkt werden alle Operationen auf Eis durchgeführt, wenn nicht anders angegeben und unter sterilen Bedingungen. </li><li> Mix 10x PBS und 1 N NaOH in angemessenen Mengen, um die gewünschte Kollagen-Konzentration und pH 7,4 zu erreichen. Zum Beispiel für ein Endvolumen von 1 mlvon TAMRA-Collagen Mix bei pH 7,4, kombiniert 100 ul 10x PBS mit 5 ul 1N NaOH. Gut mischen. </li><li> Fügen Sie die entsprechenden Volumina der beiden TAMRA-markiertes Kollagen und unmarkiertem Kollagen in einer im Verhältnis 1:6, um eine endgültige insgesamt Kollagen-Konzentration von 2 mg / ml zu erreichen. Zum Beispiel für ein Endvolumen von 1 ml 2 mg / ml Collagen TAMRA-Mix, fügen 90,48 ul von 3,68 mg / ml TAMRA-markiertes Kollagen und 415,71 ul von 4,01 mg / ml unmarkiertes Kollagen. Gut mischen und langsam durch Pipettieren und vermeidet die Bildung von Luftbläschen. </li><li> Hinzufügen von Zellen in dem entsprechenden Volumen gekühlt Zelle ohne FBS suspendiert an das TAMRA-Kollagen-Mischung, um eine endgültige Zelldichte von 10 5 Zellen / ml und einen End Kollagen-Konzentration von 2 mg / ml zu erhalten. Zum Beispiel, für 1 ml 2 mg / ml Collagen TAMRA-Mix, fügen 388.81 ul Medium mit 10 5 Zellen. Gut mischen und langsam durch Pipettieren und vermeidet die Bildung von Luftbläschen. Bestätigen Sie durch Testen pH 10 ul der Mischung auf einen pH-Test sReise. </li><li> Je 100 ul Tropfen TAMRA-Collagen Mix auf Petrischalen mit Glasboden und lassen Sie es bei Raumtemperatur für 30-45 min polymerisieren. 100 ul Kollagen Tropfen haben einen typischen Durchmesser von 7 mm und 2 mm hoch. Wenn polymerisiert, schaltet sich das Kollagen in einem weißen Gel-ish. Anmerkung: Unter Berücksichtigung der Kollagen ohne Schließen der Schale polymerisiert wird die Bildung eines Wasserfilms auf der Kollagen Tropfen vermeiden, reduziert die Loslösung von dem Glas. Um die Einhaltung zu erhöhen, kann Glasschalen mit Poly-L-Lysin bei 100 ug / ml beschichtet werden. </li><li> Vorsichtig ausreichend Kulturmedium, um die Kollagen / Zelle Tropfen bedecken. Vermeiden Sie hohe Flüsse von Medien oder abrupte Bewegungen seit Kollagen Tropfen leicht lösen kann. Halten bei 37 ° C in 10% CO 2 befeuchteten Luft genügend Zeit, damit die Zellen in der Matrix (in der Regel 1-3 Tage) migrieren. </li></ol> 3. 3D TAMRA-Kollagen-Matrices mit Embedded Sphäroide <ol><li> Berechnen Sie das Volumen von 2 mg / ml TAMRA-Collagen Mix notwendig für das Experiment. Immer werden 20% mehr zu berücksichtigen Pipettierverlusten aufgrund der Kollagen hohe Viskosität. </li><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 10x PBS und 1 N NaOH. Filtern sterilisieren und bei 4 º C zu halten Von diesem Punkt werden alle Operationen auf Eis durchgeführt, wenn nicht anders angegeben und unter sterilen Bedingungen. </li><li> Mix 10x PBS, 1 N NaOH und Zell-Medium ohne FBS in angemessenen Mengen erzielen die gewünschte Kollagen-Konzentration und pH 7,4. Zum Beispiel für ein Endvolumen von 1 ml TAMRA-Collagen Mix bei pH 7,4, kombiniert 100 ul 10x PBS, 5 ul 1 N NaOH und 388.81 ul Medien. Gut mischen. </li><li> Fügen Sie die entsprechenden Volumina der beiden TAMRA-markiertes Kollagen und unmarkiertem Kollagen in einer im Verhältnis 1:6, um eine endgültige insgesamt Kollagen-Konzentration von 2 mg / ml zu erreichen. Zum Beispiel für ein Endvolumen von 1 ml von 2 mg / ml TAMRA-Collagen Mix, fügen 90.48 ul von 3,68 mg / ml TAMRA-markiertes Kollagen und 415,71 ul von 4,01 mg / ml UNLABeled Kollagen. Gut mischen und langsam durch Pipettieren und vermeidet die Bildung von Luftbläschen. Bestätigen Sie durch Testen pH 10 ul der Mischung auf einen pH-Teststreifen. </li><li> Je 100 ul Tropfen TAMRA-Collagen Mix auf Petrischalen mit Glasboden und lassen Sie es für 2-5 min Polymerisation zu initiieren. Dies wird helfen, Untergang der Sphäroide durch eine geringfügige Erhöhung der Gelviskosität verhindern. 100 ul Kollagen Tropfen haben einen typischen Durchmesser von 7 mm und 2 mm hoch. </li><li> Sammle eine Zelle Sphäroid und legen Sie sie auf eine saubere Petrischale. Entfernen Sie überschüssiges von flüssigen und resuspendieren es in 10 ul TAMRA-Collagen Mix. Dies ist wichtig, um eine Verdünnung des Kollagens mit Zellmedium verhindern. </li><li> Mit einer Pipette P20, sammeln das Kollagen suspendiert Sphäroid und legen Sie sie in der Mitte oben auf dem 100 ul TAMRA-Collagen Mix Drop. Hinweis: Legen Sie nicht mehr als eine pro Sphäroid Kollagen Tropfen, da sie sich gegenseitig Kapazität, um einzudringen und / oder Migration beeinflussen kann. </li><li> Lassen Sie die TAMRA-Collagen Mix zu PolyMerize bei Raumtemperatur für 30-45 min. Wenn polymerisiert, schaltet sich das Kollagen in einem weißen Gel-ish. Anmerkung: Unter Berücksichtigung der Kollagen ohne Schließen der Schale polymerisiert wird die Bildung eines Wasserfilms auf der Kollagen Tropfen vermeiden, reduziert die Loslösung von dem Glas. Um die Einhaltung zu erhöhen, kann Glasschalen mit Poly-L-Lysin bei 100 ug / ml beschichtet werden. </li><li> Vorsichtig ausreichend Kulturmedium, um das Kollagen / Sphäroide Tropfen bedecken. Vermeiden Sie hohe Flüsse von Medien oder abrupte Bewegungen seit Kollagen Tropfen leicht lösen kann. </li><li> Halten bei 37 º C in 10% CO 2 befeuchteten Luft genügend Zeit für Zellen einzudringen / in der Matrix (in der Regel 1-3 Tage) zu migrieren. </li></ol> 4. 3D Immunfluoreszenzfärbungen <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig die Zelle Medien und spülen Sie die Kollagen-Matrices mit Zellen / Sphäroide mit PBS. </li><li> Gleichzeitig fixieren und zu extrahieren Zellen durch Inkubation mit Extraktion / Fixierung Puffer (4% PFA, 0,3% Triton X-100, 5% Saccharose in PBS) für 5 min. Ergänzen Sie die Puffer mit 2 uM Phalloidin und 2 uM Taxol zur Visualisierung von Zytoskeletts oder Zytoskelett assoziierte Proteine. </li><li> Weiterhin fixieren die Zellen mit 4% PFA, 5% Saccharose in PBS für 30 min. Spülen mit 0,05% Tween-20 in PBS. </li><li> Bereiten Primärantikörper Lösungen in PBS. Inkubieren Zellen mit primären Antikörpern für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. Achten Sie darauf, genug, um die gesamte Lösung Kollagen Drop cover. Für eine 35 mm Glasboden Gericht, wird 1,5-2 ml Lösung notwendig sein. Hinweis: Um die Lautstärke der Antikörper-Lösung zu reduzieren, eine wasserunlösliche Barriere, wie eine Ringbahn Silikonfett oder einem PDMS-Ring, können rund um die Kollagen-Drop platziert werden. </li><li> Waschen 3x 30 Min. mit 0,05% Tween-20 in PBS. </li><li> Bereiten Alexa-konjugierten sekundären Antikörper, Alexa-Phalloidin und DAPI in PBS-Lösungen. Inkubieren Zellen mit den entsprechenden sekundären Antikörper für 2 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen 3x 30 min mit 0,05% Tween-20 in PBS. </li><li> Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, fügen Sie genug Eindeckmitteln den Glasboden Schale unten (ca. 500 ul) füllen und legen Sie eine 24 mm Deckglas oben zu versiegeln. Drücken Sie nicht das Deckglas zu vermeiden Komprimieren des Kollagen Tropfen und Schäden an der 3D-Organisation. </li></ol> 5. Beispiel Imaging Classic oder Kreiselscheibenapplikators konfokale Mikroskope verwendet werden. Eine invertierte sollte vorzugsweise verwendet, um den Abstand der abgebildeten Zellen aus dem Glasboden bestimmen. Das System für diese Arbeit verwendet wird, ist ein Inverted konfokale Spinning-Disk mit einem 40X/1.3NA und ein 60X/1.4NA Öl-Immersions-Objektive (Arbeitsabstand 200 um und 130 um, respectively), ein Photometrics CoolSNAP HQ2 Kamera, 1392 x 1040 ausgestattet Bildgebungsfeld, 6.45 x 6.45 Pixel um und kontrolliert durch Metamorph Imaging-Software. 405 nm, 491 nm, 561 nm und 633 nm Laser sind in der Regel bei 30-50% Energie, gewinnen 1 und Binning von 2x 2 zu verringern Belichtungszeiten. , FITC (EXC 478-495; em 510-555) und Texas Red (EXC 560-580;; Das Mikroskop ist auch mit einer Hg-Lampe und Filter Würfel für DAPI (em 450-465 exc 400-418 nm) ausgestattet em 600 -650), um mit dem Okular zu verwenden. <ol><li> Mit der Leuchtstofflampe, legen Sie das 40X-Objektiv in der Mitte des Kollagens Drop. Einen Überblick über die Probe, in der xy-Achse und in der z-Achse. Achten Sie darauf, nicht mehr als 100 um aus dem Gel Kante auf der xy Achse abweichen beim Erwerb der Bilder, um Randeffekte zu vermeiden. Bei der Abbildung Sphäroide, sicherzustellen, dass sie im Rahmen des Ziels Arbeitsabstand. Ändern Sie gegebenenfalls Ziel. </li><li> Wechseln Sie in das konfokale Live-Imaging-Modus. Durch die Verwendung der 561 nm-Laser, um die TAMRA-markierten Collagen sichtbar zu machen, ausgehend von der Glasboden Bestimmung der Z-Wert bei der Kollagenfasern beginnen zu erscheinen. Dies ist das Substrat unten und z = 0 ist. </li><li> Mit dem Fokusknopf, gehen bis 100 um von z = 0. Nur Zellen, bei z = 100 umoder höher sollte abzubildenden Spannung Effekte aus der starren Glasboden zu vermeiden. </li><li> Markieren Sie die Zellen, um Bild. Optimieren Kamera Belichtungszeiten und Laserleistung für jede Wellenlänge. Typische Belichtungszeiten für DAPI und Alexa-488-Phalloidin sind zwischen 100-200 ms. Die Belichtungszeiten für die Antikörper-Färbung kann variieren. </li><li> Auf konfokale Live-Modus mit dem entsprechenden Laser, um die Phalloidin Färbung und mit dem Fokusknopf visualisieren, definieren Sie die z-Serie Intervall, indem Sie oben und unten, um aktuelle Werte z. </li><li> Definieren Sie die z-Schrittweite. Für 40X Ziele, verwenden 1 um. Für 60X, verwenden 0,5 um. Starten Sie die Erfassung. </li></ol>

<ol>
	<li>Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha+2+beta+1+(VLA-2)+mediates+reorganization+and+contraction+of+collagen+matrices+by+human+cells.">Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells.</a> Cell. 67 (2), 403-410 (1991).</li><li>Klein, C. E., Dressel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha+2+beta+1+is+upregulated+in+fibroblasts+and+highly+aggressive+melanoma+cells+in+three-dimensional+collagen+lattices+and+mediates+the+reorganization+of+collagen+I+fibrils.">Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils.</a> J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).</li><li>Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Z&#228;nker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+highly+aggressive+MV3+melanoma+cells+in+3-dimensional+collagen+lattices+results+in+local+matrix+reorganization+and+shedding+of+alpha2+and+beta1+integrins+and+CD44.">Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44.</a> Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).</li><li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis.">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).</li><li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Fraley, S. I., Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility.">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li><li>Harunaga, J. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+adhesions+in+3D.">Cell-matrix adhesions in 3D.</a> Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).</li><li>Raub, C. B., Suresh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+assessment+of+collagen+gel+microstructure+and+mechanics+using+multiphoton+microscopy.">Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy.</a> Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).</li><li>Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cancer+cells+have+distinct+adhesions+in+3D+collagen+matrices+and+in+vivo?.">Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?.</a> Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).</li><li>Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+in+growth-cone+steering.">Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering.</a> J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li><li>Haji-Karim, M., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+viability+in+cellular+spheroids+of+human+origin.">Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin.</a> Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).</li><li>Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linking+in+collagen+and+elastin.">Cross-linking in collagen and elastin.</a> Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).</li><li>Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., B&#246;ni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+handy+assay+for+collagenase+using+reconstituted+fluorescein-labeled+collagen+fibrils.">A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils.</a> Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).</li><li>Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+extracting+the+network+geometry+of+three-dimensional+collagen+gels.">An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels.</a> J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).</li><li>Sabeh, F., Ota, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+traffic+through+the+extracellular+matrix+is+controlled+by+the+membrane-anchored+collagenase+MT1-MMP.">Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP.</a> J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).</li><li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix.">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).</li><li>Jawerth, L. M., M&#252;nster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blind+spot+in+confocal+reflection+microscopy:+the+dependence+of+fiber+brightness+on+fiber+orientation+in+imaging+biopolymer+networks.">A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks.</a> Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).</li><li>Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+molecular+structure+to+tissue+architecture:+collagen+organization+probed+by+SHG+microscopy.">From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy.</a> J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Das hier beschriebene Protokoll zur Fluoreszenz beschriften Kollagen I mit TAMRA bietet eine hervorragende Methode, um einfache Visualisierung des Kollagens Netzwerk-Organisation zu ermöglichen, durch die Verwendung eines Standard-konfokalen Mikroskop mit einer 561-nm-Laser ausgestattet. Ein Vorteil dieses Verfahrens im Vergleich zu Reflexionsvermögen konfokale Mikroskopie ist die Fähigkeit, Bild Kollagenfasern tiefer in die 3D-Matrix. Die Intensität und der Kontrast der Fasern Reflexion deutlich sinkt mit der Tiefe...

Das Feld der Zellwanderung wurde in der brandneuen dritten dimensionalen Welt trotzen. Es ist intuitiv zu Zellwanderung in einer Umgebung, die am ehesten die physiologischen und somit dreidimensionale (3D) zu studieren. Doch aufgrund technischer Einschränkungen haben die meisten Zellwanderung Studien durchgeführt, die Analyse Zellbewegung über starren zweidimensionalen (2D)-Substraten, entweder unbehandelt oder beschichtet mit entsprechenden extrazellulären Matrix (ECM)-Proteine. Die ersten Studien gewidmet Zellwanderung im dreidimensionalen Kollagen Gittern zurück über 20 Jahre 1-3. Doch erst in den letzten 5 Jahren ist klar geworden, dass wandernde Zellen konnten im Wesentlichen in ihrer Morphologie und die Art der Migration abhängig von der Dimensionalität des Substrats unterscheiden. In 2D Zellen nur dem Substrat in Berührung mit ihren ventralen Fläche mit fokalen Adhäsionen, was zur Bildung von breiten, flachen Vorsprünge (lamellipodia) miteingebettet Finger Fortsätze (Filopodien) an deren Vorderkante. Diese Strukturen, die mit Stress Fasern, die die Zelle vor Verbindung mit der Hinterkante, wird angenommen, dass entscheidend für Zellbewegung in 2D. In 3D-Matrices sind die Zellen im Allgemeinen länglichen, mit der gesamten Zelloberfläche Kontaktieren der ECM, die zu erheblichen Veränderungen in der Bildung und funktionelle Bedeutung von vielen dieser Strukturen. Umgekehrt gewinnen andere zelluläre Funktionen Relevanz in 3D Migration, wie nukleare Verformung und Strukturen in ECM Umbau 4 beteiligt. Trotz dieser bekannten morphologischen Veränderungen sowie Unterschiede in der Migration Modi 5-7, die je nach dem ECM-und Zelltypen, strukturelle und funktionelle Analyse von Zellen in 3D-Matrices eingebettet bleibt ungewöhnlich. Arbeiten mit dicke und dichte 3D-Matrices trägt technischen Schwierigkeiten, wie hochauflösende Mikroskopie und Inkompatibilitäten mit den meisten standard Protokolle für 2D-Kulturen optimiert, wie Immunfluoreszenz Kennzeichnung von endogenen Proteinen. Auch, weil die Verwendung von 3D-Matrices ist ein relativ neuer Ansatz sind die Forscher noch untersuchen die besten Voraussetzungen, um ähneln spezifische in vivo Situationen, wie dem normalen Stromazellen Architektur verschiedener Gewebe Organe oder der ECM Organisation um einen Tumor. Diskrepanzen in den Ergebnissen von verschiedenen Gruppen über, zum Beispiel, haben Krebszelle Modi der Migration oder die Existenz von fokalen Adhäsionen, einige Kontroversen 8 erzeugt. Mit viel Aufwand wurde kürzlich eingeweiht, um einen Konsens in Bezug auf ECM chemische Natur, Porengröße, Faser Dicke und Steifigkeit Matrix zu erreichen. Viele verschiedene Arten von 3D-ECM werden derzeit verwendet, variierend von Zellen abgeleiteten Matrizen im Handel erhältlich Matrigel, pepsinized Rinder-Kollagen I oder nonpepsinized Rattenschwanzkollagen I. Jede dieser Matrizen hat bestimmte physikalische und chemische Eigenschaften und man muss Beziehungente die Matrix der Wahl, um den physiologischen Prozess untersucht. Darüber hinaus kann die Porengröße und Faserdicke auf Polymerisationsbedingungen wie pH-Wert und Temperatur 9,10 abhängen. Die Bindung an und die Entfernung von starren Substraten wie Glas, können auch die elastischen Eigenschaften der Matrix 10,11. Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Erstellung und Darstellung von 3D-Krebs Zellkulturen, entweder als einzelne Zellen oder Kügelchen. Verfahren zur Herstellung von Krebszellen Sphäroide wurden bisher beschrieben, die populärsten ist der hängende Tropfen Methode 12,13 und die Agarose-beschichtete Platte 14 Verfahren. Als geeignete ECM Substrat für Krebszelle Migration wird nonpepsinized Rattenschwanzkollagen I bei Raumtemperatur polymerisiert bei 2 mg / ml verwendet. Nonpepsinized Säure extrahierten Kollagen I aus Rattenschwanz behält beide N-und C-terminalen Telopeptide, nichthelicale Teile des Kollagen-Molekül verantwortlich für natives Kollagen intermolekularedere Vernetzung und Stabilität fibrilar 15. Zusammen ermöglichen diese Bedingungen die Bildung von Kollagen-Netzwerke, die am ehesten Ähnlichkeit mit den in vivo 10 beobachtet. Um die Visualisierung der Kollagenfasern, sowohl in fixierten und lebenden Kulturen zu ermöglichen, wird ein ausführliches Protokoll vorgesehen, um Fluoreszenz beschriften Kollagen in vitro 10 mit 5 - (und-6)-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA), Succinimidylester. Dieses Protokoll wurde von Baici et al angepasst. 16,17, wo Fluoresceinisothiocyanat verwendet wird, um lösliche Kollagen-Moleküle zu markieren. Beispiel Fluorescein ist TAMRA eine Amino-reaktiven Fluoreszenzfarbstoff mit protonierten aliphatischen Aminogruppen von Proteinen, wie z. B. die freie Aminogruppe am N-Terminus und, noch wichtiger, der Seite Aminogruppe von Lysin reagiert. Diese Reaktion tritt nur bei basischem pH-Wert, wenn der Lysin-Aminogruppe in der protonierten Form. Neben TAMRA stabiler als Fluorescein überZeit fällt seine Emissionsspektren auf dem orange / roten Bereich (ex / em = 555/518 nm), die sinnvollerweise für Live Cell Imaging von GFP-markierten Proteine ​​können kombiniert werden. Verwendung von löslichem Kollagen markierten Moleküle mit Amino-Reaktivfarbstoffen hat keinen Einfluss auf die Polymerisation oder die Dichte, Porengröße und Vernetzen Status der Kollagenmatrix 10,16,18,19. Dieses Protokoll umfasst ferner ein Verfahren für die 3D-Immunfluoreszenz-Markierung von endogenen Proteinen, die weiter optimiert wurde, um die Zytoskelett oder Zytoskelett assoziierte Proteine ​​zu markieren. Der letzte Schwerpunkt dieses Protokoll ist auf Methoden, um hochauflösende Bilder von 3D-Kulturen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie mit reduzierter Beitrag von starren Deckgläschen auf die Kollagen-Matrix Spannung zu erwerben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<colgroup>
		<col span="2" />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TAMRA, SE</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">C-1171</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat tail Collagen High Concentration</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat tail Collagen</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phalloidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taxol (Paxitel)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-alpha Tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 488 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>106 226 89 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis Cassette</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>66380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dishes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaMorph Microscopy Automation &#38; Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris 7.2.3</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3d

Die Zellmigration wurde traditionell in 2D Substraten untersucht. Es hat sich jedoch zunehmend klar, dass es notwendig ist, die Zellmigration in geeigneter 3D-Umgebungen, die besser ähneln die Dimensionalität der physiologischen Prozesse in Frage zu untersuchen. Wandernde Zellen können im Wesentlichen in ihrer Morphologie und die Art der Migration unterscheiden sich je nachdem, ob sie auf 2D-oder 3D-Substrate bewegt. Aufgrund technischer Schwierigkeiten und Inkompatibilitäten mit den meisten Standard-Protokolle, strukturelle und funktionelle Analyse von Zellen in 3D-Matrices eingebettet bleibt ungewöhnlich. Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Erstellung und Darstellung von 3D-Krebs Zellkulturen, entweder als einzelne Zellen oder Kügelchen. Als geeignete ECM Substrat für Krebs Zellmigration, verwenden wir nonpepsinized Rattenschwanzkollagen I polymerisiert bei Raumtemperatur und fluoreszenzmarkierte, um die Visualisierung mit Standard Konfokalmikroskopen erleichtern. Diese Arbeit umfasst auch eine Protocol für 3D Immunfluoreszenz Kennzeichnung von endogenen Zelle Zytoskeletts. Mit diesen Protokollen wir hoffen auf eine bessere Beschreibung der molekularen Zusammensetzung, Lokalisierung und Funktionen der zellulären Strukturen in 3D beitragen.

Beschriftung Rattenschwanz Kollagen I mit TAMRA ermöglicht eine einfache Erstellung und Visualisierung von 3D-Kollagen-Netzwerke. Langsame Polymerisation bei Raumtemperatur führt zur Bildung von Kollagen Netzwerke mit vergleichbaren Organisation zu den in vivo 10 vorhanden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für Immunfluoreszenzfärbung des Zytoskeletts von CT26 Krebszellen, sowohl als Sphäroide und als einzelne Zellen. Um eine bessere Erhaltung des Zytoske...

Watch this Scientific Journal Video about Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D at JoVE.com

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Fluoreszenz beschriften Kollagen, das weiter für beide fix und Live-Darstellung von 3D-Zellkulturen verwendet werden kann. Wir bieten auch ein optimiertes Protokoll endogene Proteine ​​des Zytoskeletts von Zellen in 3D-Umgebungen kultiviert visualisieren.

Enthüllung des Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

revealing-the-cytoskeletal-organization-of-invasive-cancer-cells-in-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

15.6K Aufrufe.  Institut Curie.  Dieser Artikel stellt eine Methode zur Fluoreszenz beschriften Kollagen, das weiter für beide fix und Live-Darstellung von 3D-Zellkulturen verwendet werden kann. Wir bieten auch ein optimiertes Protokoll endogene Proteine ​​des Zytoskeletts von Zellen in 3D-Umgebungen kultiviert visualisieren. 

Serie: Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

Biomarker in einem Tiermodell für die Aufdeckung Neural, hämatologischen und Behavioral Korrelate der PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Forschung

Medizin

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Molecular Profiling von der invasiven Tumor-Microenvironment in einem 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells und<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Fibroblasten

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Murine Model for Non-invasive Imaging to Detect and Monitor Ovarian Cancer Recurrence

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of care consisting of surgical debulking and combination chemotherapy consisting of platinum and taxane compounds, almost 90% of patients recur within a few years. In these patients the development of chemoresistant disease limits the efficacy of currently available chemotherapy agents and therefore contributes to the high mortality. To discover novel therapy options that can target recurrent disease, appropriate animal models that closely mimic the clinical profile of patients with recurrent ovarian cancer are required. The challenge in monitoring intra-peritoneal (i.p.) disease limits the use of i.p. models and thus most xenografts are established subcutaneously. We have developed a sensitive optical imaging platform that allows the detection and anatomical location of i.p. tumor mass. The platform includes the use of optical reporters that extend from the visible light range to near infrared, which in combination with 2-dimensional X-ray co-registration can provide anatomical location of molecular signals. Detection is significantly improved by the use of a rotation system that drives the animal to multiple angular positions for 360 degree imaging, allowing the identification of tumors that are not visible in single orientation. This platform provides a unique model to non-invasively monitor tumor growth and evaluate the efficacy of new therapies for the prevention or treatment of recurrent ovarian cancer.

We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.

Mausmodell für nicht-invasive Bildgebungs zu erfassen und zu überwachen Eierstockkrebs Rezidiv

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.

We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

Nicht-invasive Beurteilung der Wirksamkeit neuer Therapeutika für Darmpathologien Verwenden der seriellen endoskopische Bildgebung von lebenden Mäusen

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish between invasive and non-invasive cells, and enables study of the effects of test compounds on tumor invasion. Cancer cells - either as aggregates or single cells - are confronted with fragments of embryonic chick heart. After organ culture in suspension for a few days or weeks the confronting cultures are fixed and embedded in paraffin for histological analysis. The three-dimensional interaction between the cancer cells and the normal tissue is then reconstructed from serial sections stained with hematoxylin-eosin or after immunohistochemical staining for epitopes in the heart tissue or the confronting cancer cells. The assay is consistent with the recent concept that cancer invasion is the result of molecular interactions between the cancer cells and their neighbouring stromal host elements (myofibroblasts, endothelial cells, extracellular matrix components, etc.). Here, this stromal environment is offered to the cancer cells as a living tissue fragment. Supporting aspects to the relevance of the assay are multiple. Invasion in the assay is in accordance with the criteria of cancer invasion: progressive occupation and replacement in time and space of the host tissue, and invasiveness and non-invasiveness in vivo of the confronting cells generally correlates with the outcome of the assay. Furthermore, the invasion pattern of cells in vivo, as defined by pathologists, is reflected in the histological images in the assay. Quantitative structure-activity relation (QSAR) analysis of the results obtained with numerous potentially anti-invasive organic congener compounds allowed the study of structure-activity relations for flavonoids and chalcones, and known anti-metastatic drugs used in the clinic (e.g., microtubule inhibitors) inhibit invasion in the assay as well. However, the assay does not take into account immunological contributions to cancer invasion.

Here, we present a protocol to study the invasion of tumor cells into living normal tissue fragments in three dimensions. This organ culture technique is mainly applied to test potentially anti-invasive drugs in vitro.

Küken-Herz-Invasion Assay zum Testen der Invasivität von Krebszellen und die Aktivität von Potenziell Anti-invasive Verbindungen

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Encapsulation Thermogenic Präadipozyten für die Transplantation in Fettgewebe Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

Isolierung und Vermehrung von zirkulierenden Tumorzellen aus einer Maus Cancer

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...