Name: characterization of cell membrane extensions and studying their roles in cancer cell adhesion dynamics
Uploaded: 2018-03-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
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A Fundação de Grant Sesma financiado este trabalho.

1. célula características de extensão
<ol><li>Manter SW-13, SW-Neo e SW-DKK3 células em uma padrão incubadora umidificada 37,0 ° c e 5% de CO2 em meio de águia de Dulbecco modificado suplementado com 10% de soro fetal bovino e 10.000 de U/mL penicilina e estreptomicina (designado como 'meio de crescimento').<ol>
<li>Contar as células usando um hemocytometer e placa de 5.000 células por poço para SW-13, SW-Neo e SW-DKK3 linhas em chapas separadas 6-poços e cresce durante a noite no meio de crescimento as lamelas de vidro estéril.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Depois de crescimento durante a noite, para cada poço, Aspire o meio de crescimento, lavar as células com 1 mL de quente fosfato salino (PBS) e em seguida fixar as células com 1 mL de formaldeído de 3,7% por 10 min.</li>
	<li>Aspirado de formaldeído e mancha de células em cada poço com 1 mL de violeta de cristal de 0.05% por 30 min. excesso de lavagem tingem usando três lavagens de 1 mL de água desionizada. Nota: Dependendo do nível de absorção de corante, várias lavagens adicionais podem ser necessários para remover a coloração para promover a visualização de célula de plano de fundo.<ol>
<li>Usando a pinça com ponta fina, recuperar as lamelas e colocá-los face para baixo sobre uma lâmina de vidro rotulado com uma gota de reagente de montagem clara.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sob um microscópio de luz, escolha aleatoriamente 20 visualizações de células não-sobreposição de cada lamela para o ensaio de extensão de célula.<ol>
<li>Leve fotomicrografias ampliação de 400 x de cada campo de visão. Conte diretamente o número de cada tipo de extensão para cada uma das 20 células representativas. Nota: como tal, 20 células isoladas devem ser examinadas para cada condição testada garantir resultados confiáveis. Filopodia foram definidos por extensões celulares com uma base de 5 mícrons ou menos e um único vértice. Lobopodia foram definidos por extensões celulares com uma base de 5 a 20 microns de contendo extensões de comprimento com vários ápices. Lamellipodia foram definidos por extensões de célula que são superiores a 20 mícrons de comprimento e com ou sem ápices. Dependendo do tipo de célula testado, os tamanhos das extensões de célula podem ser diferentes e podem exigir o refinamento de identificar parâmetros.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine o número médio de cada extensão de célula em cada tipo de célula (i.e., SW-13, Neo-SW, SW-DDK) através dos 6 poços examinados.</li>
	<li>Usando um teste estatístico unidirecional análise de variância (ANOVA), compare as diferenças no percentual médio de extensões da membrana celular entre os teste diferentes tipos de células.</li>
</ol>2. adesão ensaio
<ol><li>Manter SW-13, SW-Neo e SW-DKK3 células numa incubadora umidificado padrão no 37,0 ° C e 5% CO2 em meio de crescimento.<ol>
<li>Usando um hemocytometer, contar e placa 100.000 células de SW-13 e Neo-SW SW-DKK3 por bem em chapas separadas 6-poços e crescer durante a noite, no meio de crescimento.</li>
		<li>Placas de 6 boas sementes para cada tipo de célula testaram, usando uma placa para cada um dos 6 pontos designados tempo testados abaixo. Nota: Os pontos de tempo podem variar para diferentes tipos de células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a incubação durante a noite, lavar as células com PBS quente uma vez, em seguida, adicionar 0,5 mL de solução de dissociação de célula não-enzimática de 1x a cada poço.<ol>
<li>Agite a placa para espalhar a solução de dissociação de célula. Aspirar a placa designada em pontos de tempo definido (isto é, 1, 2, 3, 5, 10 e 15 min) e em seguida lavar com 1 mL de solução de PBS quente três vezes.</li>
		<li>Entre lavagens, bata levemente as placas para desanexar células frouxamente anexadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspire qualquer restantes PBS e fixar as células restantes anexadas à placa com 1 mL de formaldeído de 3,7% por 10 min.</li>
	<li>Mancha de células com 1 mL de violeta de cristal de 0.05% por 30 min, em seguida, lave o corante em excesso com 1 mL de água desionizada. Titula-se lavagem para promover a visualização da célula. Nota: Dependendo do nível de absorção de corante, várias lavagens adicionais podem ser necessários para promover a visualização da célula.</li>
	<li>Usando um microscópio de luz, ampliação de 100 x, conte as células restantes anexadas em cada poço para cada placa. Nota: Uso de réguas transparentes ou marcar guias caneta fina no lado inferior da placa irá ajudar a evitar a repetida contagem das mesmas células.</li>
	<li>Determine o número médio de células anexados por bem para cada placa.</li>
	<li>Compare a taxa de desprendimento de célula entre 13-SW, SW-Neo e SW-DDK3 células durante o período de tempo determinado usando um teste estatístico de ANOVA nos dois sentidos.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+cancer:+pathophysiology+and+clinical+management.">Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management.</a> Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).</li><li>Veeck, J., Dahl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Wnt+pathway+in+cancer:+the+emerging+role+of+Dickkopf-3.">Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3.</a> Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-type+calcium+channels+regulate+filopodia+stability+and+cancer+cell+invasion+downstream+of+integrin+signalling.">L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling.</a> Nat Commun. 7, 13297 (2016).</li><li>Machesky, L. M., Li, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin:+Invasive+filopodia+promoting+metastasis.">Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis.</a> Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).</li><li>Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+the+nuclear+piston+mechanism+of+3D+migration+in+tumor+cells.">Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells.</a> J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).</li><li>Korah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+RASSF1A+deregulates+cytoskeleton+and+promotes+malignant+behavior+of+adrenocortical+carcinoma.">Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma.</a> Molecular cancer. 12, 87 (2013).</li><li>Cheng, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+FOXO1-mediated+dedifferentiation+blocking+role+for+DKK3+in+adrenocortical+carcinogenesis.">A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis.</a> BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Cliffe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+analysis+of+complex+single+border+cell+behaviors+in+coordinated+collective+cell+migration.">Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration.</a> Nat Commun. 8, 14905 (2017).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui nós descrevemos um em vitro método quantitativo para caracterizar as extensões de células com facilidade, algumas armadilhas e reprodutibilidade confiável que pode ser aplicada para as várias condições de teste. Além disso, ensaios de aderência e/ou motilidade simples e quantificáveis podem ser executados simultaneamente para correlacionar o potencial significado funcional das alterações observadas nas extensões da membrana celular.
No entanto, estes métodos podem apresentar algumas limitações potenciais. Em primeiro lugar, os critérios especificados aqui para identificar diferentes tipos de extensões de célula baseiam-se na morfologia de célula adrenocortical SW-13 e daí provavelmente precisam de refinamento na classificação dos parâmetros quando aplicado a outros tipos de células e/ou condições experimentais. Além disso, em experiências de tempo-curso estendidas, as potenciais influências de alterações de extensão da membrana celular no ciclo celular e morte celular precisam ser considerados.
Em segundo lugar, o protocolo pode invocar potencial individualizado chamando pelo examinador, que pode limitar a reprodutibilidade do ensaio devido a variação inter observador. O elevado número de células que são examinadas para cada grupo de teste provavelmente supera parte deste viés; especificamente, quando 20 células são examinadas para cada ensaio. Inclusão de vários indivíduos para realizar extensão ligando de forma cega é sugerido para atenuar o potencial viés chamado subjetivo.
Finalmente, deve ter cuidado ao associar alterações nas propriedades de fixação, onde uma versão simplificada das propriedades de adesão pode ser o resultado de mudanças no interruptor de classe de extensão de célula alterada preferência para substrato de fixação em vez a afinidade alterada para o substrato testado. O interruptor de classe de extensão de célula de acoplamento com a migração ou invasão no contexto de vários componentes da matriz extra-celular poderia esclarecer as propriedades observadas de adesão.
Em conclusão, o protocolo descrito aqui fornece um método simples e confiável para medir o significado funcional da membrana celular extensão interruptor sob várias condições de teste.

Dysregulated WNT sinalização desempenha um papel crítico na malignidades adrenocortical1. Os métodos utilizados neste estudo investigam se silenciar de DKK3, um regulador negativo de sinalização WNT, representa um evento de quê no córtex adrenal e promove a formação de tumor no contexto de alterações de repertório de célula-extensão. DKK3 é um 38 kDa secretado glicoproteína com um peptídeo sinal do N-terminal e estudos anteriores demonstraram que sua expressão forçada resultou na detenção do ciclo celular, inibiu o comportamento agressivo do maligno e invertida epitelial-mesenquimal transição2.
O comportamento maligno do carcinoma adrenocortical (ACC) e outros tipos de câncer é, em parte, influenciada pela capacidade de células tumorais para fazer a interface com as superfícies circundantes, incluindo a matriz extracelular, que por sua vez facilita a invasão de células do tumor e migração de3. O papel das extensões específicas de membrana celular na progressão do câncer é cada vez mais sendo demonstrado em diversos contextos, principalmente através da formação de filopodia. Por exemplo, foi encontrado para induzir a formação de filopodia e promover de invasão de células de tumor4superexpressão dos canais de cálcio tipo L. Da mesma forma, Fascin, um ligação proteína minimamente o actínio expressa em tecido normal, é também Blumental em células cancerosas em associação com filopodia formação5. Lobopodia formação permite que não-malignas fibroblastos efetivamente migrar através da matriz extra-celular, no entanto, tem sido demonstrado que células de Fibrossarcoma dependem de metaloproteinase atividade substituem lobopodia para facilitar a migração celular e invasão de6. Mostramos esse tumor supressores, incluindo Ras Associação domínio família 1 isoform um (RASSF1A) e DKK3, pode funcionar para alterar elementos do citoesqueleto e promover a formação de lamellipodia e obste Propriedades invasivas7,8.
Como tal, é fundamental para caracterizar os efeitos de genes envolvidos na carcinogênese e sua relação com alterações de extensão da membrana celular, avaliando especificamente a formação filopodia, lobopodia e lamellipodia sob condições de teste. Atual estado da arte técnicas incluem o uso de métodos cada vez mais sofisticados de microscopia, etiquetando fluorescente e/ou algoritmos de computador complexo para aquisição de dados e interpretação. Enquanto esses métodos fornecem novas e poderosas ferramentas analíticas, sua complexidade limita sua utilização generalizada e adaptabilidade em experimentos de biologia celular. Além disso, a quantificação precisa e observação de alterações na morfologia de extensão de célula não é normalmente medido9,10. Em contrapartida, apresentamos aqui uma técnica que quantifica com precisão alterações de extensão de célula usando técnicas padrão microscópicas e facilmente adaptável em vitro métodos. Esses métodos também quantificar cada tipo de extensão de células simultaneamente para cada célula analisado e determinar mudanças gerais no repertório de extensão da membrana celular. Também mostramos como essas alterações podem se relacionar Propriedades de adesão celular.
Como um exemplo experimental, vamos usar uma linha de celular criado anteriormente de SW-13, designado SW-DDK3, que tem sido estàvel transfected com vetores de plasmídeo pCMV6-entrada/DKK3 e constitutivamente overexpresses DKK3, um factor diferenciador na glândula adrenal. Non-transfectadas SW-13 células e células SW-13 estàvel transfectadas com vetor vazio (pCMV6-entrada), designado SW-Neo, servirá como controles experimentais.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11965-092</td><td>Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin</td></tr><tr><td>Deulbeco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>1X solution, used directly</td></tr><tr><td>3.7% formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Dilute stock solution</td></tr><tr><td>0.05% crystal violet&amp;nbsp;</td><td>Harleco</td><td>192-12</td><td>Dilute stock solution</td></tr><tr><td>De-ionized water</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>Microscope with 400X magnification&amp;nbsp;</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>353046</td><td>NA</td></tr><tr><td>Cell dissociation solution non-enzymatic 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5914&amp;nbsp;</td><td>1X solution, used directly</td></tr></tbody></table>

characterization of cell membrane extensions and studying their roles in cancer cell adhesion dynamics

Repertório de extensão da membrana celular modula vários comportamentos malignos das células cancerosas, incluindo seus potenciais de adesivo e migratórias. A capacidade de precisão de classificar e quantificar as extensões de célula e medir o efeito sobre a capacidade adesiva da célula é fundamental para determinar como célula-sinalização de eventos impacto câncer célula comportamento e agressividade. Aqui, descrevemos em vitro concepção e utilização de um celular extensão quantificação método em conjunto com um ensaio de capacidade de aderência em um modelo estabelecido em vitro para carcinoma adrenocortical (ACC). Especificamente, nós testamos os efeitos da DKK3, um supressor de tumor putativo e um fator de pró-diferenciação, sobre o fenótipo de extensão de membrana da linha celular ACC, SW-13. Propomos estes ensaios para fornecer relativamente simples, confiável e facilmente interpretável métricas para as medidas estas características sob diferentes condições experimentais.

Os efeitos da superexpressão de DKK3 na célula extensão morfologia e propriedades de aderência de célula usando os ensaios acima, foram testados na linha celular estabelecida ACC SW-13, em vitro. Células superexpressão DKK3 foram geradas por estàvel transfecting SW-13 células com Myc-DDK etiquetado plasmídeo pCMV6-entrada/DKK3 vectores e designado como SW-DKK3. Da mesma forma, células estàvel transfectadas com vetor vazio pCMV6-entrada foram criadas como um controle do transfection e passagem e definidas como SW-Neo. SW-13 células foram usadas como um controle adicional-célula-mãe. Superexpressão de DKK3 em SW-DKK3 foi confirmada por PCR quantitativo em tempo real e Western blot técnicas8.
Brevemente, células testadas 13-SW, SW-Neo e SW-DKK3 cresceram durante a noite em 6 pratos bem em lamínulas. As células foram então fixo com formaldeído e coradas com violeta cristal. Características de extensão de célula então foram quantificadas sob microscopia pelos parâmetros descritos acima. Na análise, SW-DKK3 células exibido um fenótipo mais diferenciado, anotado por aumento lobopodia e polaridade celular multidirecional (p = 0,01, One-Way ANOVA, Figura 1 e Figura 2), sugestivo de uma falta de motilidade direcional. Em contraste, células SW-13 e SW-Neo parentais mantida polaridade e exibido maior filopodia disposto em uma orientação planar (p = 0,01, One-Way ANOVA, Figura 1 e Figura 2)8.
Para determinar se aumento lobopodia formação alterado Propriedades de fixação da célula, foi realizado um ensaio de aderência de célula. Resumidamente, as células foram cultivadas durante a noite e desprendimento de células foi realizado com solução de dissociação de célula não enzimáticos em tempo progressivo de intervalos de até 15 min. de células foram então fixo com formaldeído, manchado com violeta de cristal e contados usando uma luz microscópio. SW-DKK3 células mostraram uma afinidade de ligação significativamente maior em comparação com células SW-13 e SW-Neo (p < 0,01, 2-way ANOVA, Figura 3). Estes resultados indicam que DKK3 promove a formação de lobopodios, que por sua vez promove a célula anexo8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56560/56560fig1.jpg"> Figura 1: expressão forçada de DKK3 altera as extensões da membrana celular. SW-13 (A), SW-Neo (B)e SW-DKK3 (C) as células foram cultivadas em lamelas de vidro, fixadas com formol, manchadas com violeta de cristal e fotografadas. Fotomicrografias são tiradas usando um microscópio de luz na ampliação de x 400. SW-13 e SW-Neo células formaram principalmente filopodia (setas vermelhas) e extensões de célula de lamellipodia (arco azul). Em contraste, SW-DKK3 células formaram mais lobopodia (pequenos arcos verdes), com a quase ausência de lamellipodia e muito poucos filopodia. Enquanto as SW-13 (A) e SW-Neo (B) as células parecem ser polarizadas (setas laranja) com filopodia na vanguarda e lamellipodia na borda do revestimento, SW-DKK3 células (C) mostrou lobopodia multidirecional uniformemente distribuída. Experimentos foram realizados em duplicado. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56560/56560fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56560/56560fig2.jpg"> Figura 2: DKK3 promove a formação de lobopodios. A representação relativa de filopodia lobopodia e lamellipodia por célula para cada tipo de célula foram calculados por tabulação extensões de célula em células individuais. Células em vinte fotomicrografias de campo microscópico aleatoriamente tomada de vistas (ampliação de 400 x) 13-SW, SW-Neo e SW-DKK foram utilizadas para a quantificação. Barras de erro indicaram o desvio padrão e (*) indica p < 0,01 usando uma ANOVA One-Way que representa um aumento significativo no número de lobopodios nas células SW-DKK. Um total de 20 células foram examinados para cada tipo de célula testado e experimentos foram realizados em duplicado. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56560/56560fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56560/56560fig3.jpg"> Figura 3: DKK promove a adesão celular. Cem mil SW-13, SW-Neo e SW-DKK3 células por poço de placas boas 6 foram autorizadas a crescer durante a noite e foram tratadas por destacamento em pontos de tempo designado (eixo x). As células restantes anexado foram fixadas, manchadas e contadas e as porcentagens de células restantes anexado foram plotado (eixo y). Barras de erro indicam o desvio padrão e (*) indica p < 0,01 e (*) indica p < 0,001 usando uma ANOVA de 2 vias, que representa um aumento significativo no SW-DKK celular força de fixação. Cada experimento começou com 100.000 células e experimentos foram realizados em duplicado. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56560/56560fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Este estudo demonstra a utilidade e a facilidade de medição de extensão quantitativa da membrana celular e sua correlação com capacidade adesiva de células. Como um exemplo representativo, mostramos aqui essa proteína relacionada ao Dickkopf 3 (DKK3) promove aumento lobopodia formação e aderência de célula em carcinoma adrenocortical em vitrode células.

Caracterização de extensões da membrana celular e estudando seus papéis na dinâmica de adesão celular câncer

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.6K visualizações.  Yale University School of Medicine. Este estudo demonstra a utilidade e a facilidade de medição de extensão quantitativa da membrana celular e sua correlação com capacidade adesiva de células. Como um exemplo representativo, mostramos aqui essa proteína relacionada ao Dickkopf 3 (DKK3) promove aumento lobopodia formação e aderência de célula em carcinoma adrenocortical em vitrode células.

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Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modelagem e imagem 3-Dimensional Invasion cela coletiva

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Medicina

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. While 75% of bladder cancers are non-invasive and unlikely to metastasize, about 25% progress to an invasive growth pattern. Up to half of the patients with invasive cancers will develop lethal metastatic relapse. Thus, understanding the mechanism of invasive progression in bladder cancer is crucial to predict patient outcomes and prevent lethal metastases. In this article, we present a three-dimensional cancer invasion model which allows incorporation of tumor cells and stromal components to mimic in vivo conditions occurring in the bladder tumor microenvironment. This model provides the opportunity to observe the invasive process in real time using time-lapse imaging, interrogate the molecular pathways involved using confocal immunofluorescent imaging and screen compounds with the potential to block invasion. While this protocol focuses on bladder cancer, it is likely that similar methods could be used to examine invasion and motility in other tumor types as well.

The processes governing bladder cancer invasion represent opportunities for biomarker and therapeutic development. Here we present a bladder cancer invasion model which incorporates 3-D culture of tumor spheroids, time-lapse imaging and confocal microscopy. This technique is useful for defining the features of the invasive process and for screening therapeutic agents.

Sistema de cultura de células 3D para estudar a invasão e avaliação terapêutica em câncer de bexiga

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Pesquisa do câncer

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Análise da migração celular dentro de uma matriz de colagénio tridimensional

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Bioengenharia

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the homeostasis of adult tissues. Interestingly, oxidative stress can alter these processes, thus contributing to the pathophysiology of diseases such as metastatic cancer. Therefore, understanding the mechanism(s) of how cells attach and spread on the ECM during perturbations in redox status can provide insight into normal and disease states. Described below is a step-wise protocol that utilizes an immunofluorescence-based assay to specifically quantify cell adhesion and spreading of immortalized fibroblast cells on fibronectin (FN) in vitro. Briefly, anchorage-dependent cells are held in suspension and exposed to the ATM kinase inhibitor Ku55933 to induce oxidative stress. Cells are then plated on FN-coated surface and allowed to attach for predetermined periods of time. Cells that remain attached are fixed and labeled with fluorescence-based antibody markers of adhesion (e.g., paxillin) and spreading (e.g., F-actin). Data acquisition and analysis are performed using commonly available laboratory equipment, including an epifluorescence microscope and freely available Fiji software. This procedure is highly versatile and can be modified for a variety of cell lines, ECM proteins, or inhibitors in order to examine a broad range of biological questions.

This method is useful for quantifying the early dynamics of cellular adhesion and spreading of anchorage-dependent cells onto the fibronectin. Furthermore, this assay can be used to investigate the effects of altered redox homeostasis on cell spreading and/or cell adhesion-related intracellular signaling pathways.

Examinando a dinâmica da adesão celular e disseminação de células epiteliais em fibronectina durante o estresse oxidativo

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Bioquímica

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration in more appropriate 3D environments, which better resemble the dimensionality of the physiological processes in question. Migratory cells can substantially differ in their morphology and mode of migration depending on whether they are moving on 2D or 3D substrates. Due to technical difficulties and incompatibilities with most standard protocols, structural and functional analysis of cells embedded within 3D matrices still remains uncommon. This article describes methods for preparation and imaging of 3D cancer cell cultures, either as single cells or spheroids. As an appropriate ECM substrate for cancer cell migration, we use nonpepsinized rat tail collagen I polymerized at room-temperature and fluorescently labeled to facilitate visualization using standard confocal microscopes. This work also includes a protocol for 3D immunofluorescent labeling of endogenous cell cytoskeleton. Using these protocols we hope to contribute to a better description of the molecular composition, localization, and functions of cellular structures in 3D.

This article presents a method to fluorescently label collagen that can be further used for both fix and live imaging of 3D cell cultures. We also provide an optimized protocol to visualize endogenous cytoskeletal proteins of cells cultured in 3D environments.

Revelando a Organização do citoesqueleto das células invasoras câncer em 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Adherent cells in culture maintain a polarized state to support movement and intercellular interactions. Nanopodia are thin, elongated, largely F-actin-negative membrane projections in endothelial and cancer cells that can be visualized through TM4SF1 (Transmembrane-4-L-six-family-1) immunofluorescence staining. TM4SF1 clusters in 100-300 &#956;m diameter TMED (TM4SF1 enriched microdomains) containing 3 to as many as 14 individual TM4SF1 molecules. TMED are arranged intermittently along nanopodia at a regular spacing of 1 to 3 TMED per &#956;m and firmly anchor nanopodia to matrix. This enables nanopodia to extend more than 100 &#956;m from the leading front or trailing rear of polarized endothelial or tumor cells, and causes membrane residues to be left behind on matrix when the cell moves away. TMED and nanopodia have been overlooked because of their extreme fragility and sensitivity to temperature. Routine washing and fixation disrupt the structure. Nanopodia are preserved by direct fixation in paraformaldehyde (PFA) at 37 &#176;C, followed by brief exposure to 0.01% Triton X-100 before staining. Nanopodia open new vistas in cell biology: they promise to reshape our understanding of how cells sense their environment, detect and identify other cells at a distance, initiate intercellular interactions at close contact, and of the signaling mechanisms involved in movement, proliferation, and cell-cell communications. The methods that are developed for studying TM4SF1-derived nanopodia may be useful for studies of nanopodia that form in other cell types through the agency of classic tetraspanins, notably the ubiquitously expressed CD9, CD81, and CD151.

Nanopodia are thin but fragile membrane channels that extend up to 100 &#956;m from a cell's leading front or trailing rear and sense the cellular environment. Direct fixation at 37 &#176;C, gentle washing, and avoidance of organic solvents like ethanol, methanol, or acetone and of higher Triton X-100 concentrations are required to observe these cellular structures.

Nanopodia - finas, Projeções frágil membrana com papéis em Movimento Celular e intercelulares Interações

Adherent cells in culture maintain a polarized state to support movement and intercellular interactions. Nanopodia are thin, elongated, largely ...

Biologia

Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out shape. Following the cell-substrate attachment, the cell forms a thin sheet of lamellipodia emanating from the cell body. In the lamellipodia, globular actin (G-actin) monomers polymerize into a dense filamentous actin (F-actin) meshwork that pushes against the plasma membrane, thereby providing the mechanical forces required for the cell to spread. Notably, the molecular players that control the actin polymerization in lamellipodia are essential for many other cellular processes, such as cell migration and endocytosis. 
Since spreading cells form continuous lamellipodia that span the entire cell periphery and persistently expand outward, cell spreading assays have become an efficient tool to assess the kinetics of lamellipodial protrusions. Although several technical implementations of the cell spreading assay have been developed, a detailed description of the workflow, which would include both a step-by-step protocol and computational tools for data analysis, is currently lacking. Here, we describe the experimental procedures of the cell spreading assay and present an open-source tool for quantitative and unbiased analysis of cell edge dynamics during spreading. When combined with pharmacological manipulations and/or gene-silencing techniques, this protocol is amenable to a large-scale screen of molecular players regulating lamellipodial protrusions.

In this protocol, we present the experimental procedures of a cell spreading assay that is based on live-cell microscopy. We provide an open-source computational tool for the unbiased segmentation of fluorescently labeled cells and quantitative analysis of lamellipodia dynamics during cell spreading.

Análise quantitativa da dinâmica da borda celular durante a disseminação celular

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.

A adesão molecular de imagem em rolamento celular por ensaio de pegada de adesão

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the construction and regeneration of tissues, and is critical in embryonic development, immunological responses, and wound healing. Dysregulation of cell motility contributes to pathological disorders, such as chronic inflammation and cancer metastasis. Cell migration, tissue invasion, axon, and dendrite outgrowth all initiate with actin polymerization-mediated cell-edge protrusions. Here, we describe a simple, efficient, time-saving method for the imaging and quantitative analysis of cell-edge protrusion dynamics during spreading. This method measures discrete features of cell-edge membrane dynamics, such as protrusions, retractions, and ruffles, and can be used to assess how manipulations of key actin regulators impact cell-edge protrusions in diverse contexts.

This protocol aims to measure the dynamic parameters (protrusions, retractions, ruffles) of protrusions at the edge of spreading cells.

Medindo a dinâmica de saliência da borda celular durante a disseminação usando microscopia de células vivas

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

Cell Adhesion Molecules - Types and Functions

Cell adhesion molecules (CAMs) are pivotal to multicellularity and the coordinated functioning of tissues and organ systems. They enable physical interactions between cells and provide mechanical strength to tissues. They also function as receptors for signal transmission across the plasma membrane. The CAMs are broadly classified into four families - integrins, cadherins, selectins, and immunoglobulin-like CAMs (IgCAMs).
CAM Families
The Integrin family of proteins is primarily&#160; involved in a cell&#8217;s interaction with its surrounding matrix. However, some integrins can bind CAMs on another cell&#8217;s surface and participate in direct cell-cell interactions. For example, the integrins on immune cells bind IgCAMs expressed on the vascular endothelium.
Cadherins are a superfamily of calcium-dependent glycoproteins primarily involved in establishing strong cell adhesions. They compose the adherens junctions and desmosomes in tissues, such as the epithelium.
Selectins and IgCAMs are involved in transient cell interactions and participate in directing cells towards target sites. For example, they help in the selective recruitment of lymphocytes to the secondary lymphoid organs.
CAM and Multicellularity
CAMs are found&#160; across virtually all multicellular organisms - from sponges and simple nematodes to complex invertebrates and vertebrates. The complexity of the cellular interactions, and therefore of the CAMs, increases with the complexity of the organisms. For example,&#160; while the fruit fly D.melanogaster has approximately&#160; 500 genes involved in cell adhesion, complex vertebrates like mammals have over a thousand genes that code for different types of CAMs.