Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grant-Nummer R21-HL094828-01 geht an Dr. Poelzing unterstützt.

1. Bereiten Lärm Funktion und Eingangssignal <ol><li> Erstellen Sie eine Lärm-Funktion mit der gewünschten Frequenz-Komponenten. Dies kann durch die Beschreibung der gewünschten Frequenz-Komponenten im Frequenzbereich und dann die Berechnung der inversen schnellen Fourier-Transformation durchgeführt werden. In dieser Studie 1 bis 15 kHz verwendet. Alle Fourier-Transformationen und inverse Fourier-Transformationen in dieser Studie beschrieben wurden mit Matlab FFT und IFFT-Funktionen. </li><li> Skalieren Sie die Amplitude des Rauschens Funktion angemessen. In dieser Studie wurde der Lärm-Funktion wurde so skaliert, dass die Null zur Amplitude des Rauschens Funktion peak 50 oder 100 mV wurde. </li><li> Erstellen Sie ein Stimulus-Datei mit geeigneten Methoden für den Erwerb verwendeten Software. Für CLAMPEX 8, erstellen Sie zunächst eine Textdatei mit dem entsprechenden Header. Unterhalb der Kopfzeile, legen Sie die Zeit-Schritten für einen einzigen Durchlauf in der ersten Spalte. Die Zeit-Schritten sollen die gleichen zeitlichen Abstand wie das Abtastintervall in die Messungen verwendet. Für jeden Sweep in der Spannung Schritt-Protokoll legen Sie die genaue Spannungen zu jedem Zeitpunkt gewünscht. Dies sollte auch die Lärm-Funktion. </li></ol> 2. Führen Sie Voltage Clamp Messungen <ol><li> Erstellen Sie ein Messprotokoll innerhalb der Erfassungs-Software, die kompatibel mit der Reiz-Datei generiert zuvor ist. In CLAMPEX, gibt es ein Menü, dass der Benutzer auf einen Reiz-Datei mit dem aktuellen Protokoll zugeordnet werden können. </li><li> Bringen Sie ein Modell (oder biologische) Zelle, um die Messtechnik. </li><li> Führen Sie das Experiment wie geplant. Zur Kontrolle, stellen Sie sicher, regelmäßige Messungen, die keine keine Geräusche Funktionen erweitert. </li></ol> 3. Beitrag Experiment Analysis <ol><li> Berechnen Sie die IV-Kurve für eine einzelne Aufnahme. Wenn sich die Aufnahme in einem stabilen Zustand, wenn der Lärm-Funktion angewendet wird, kann die IV-Kurve erstellt mit Hilfe eines steady state Teil der Aufnahme zeitlich außerhalb des Bereichs der Lärm-Funktion. Wenn die Aufnahme war nicht in einem stabilen Zustand, der Lärm-Funktion kann mit der Berechnung der IV-Kurve stören, so dass eine zweite Aufnahme ohne den Lärm-Funktion vorhanden sein sollte vorgenommen werden. </li><li> Für jede Spannung Schritt in eine Aufnahme Berechnung der schnellen Fourier-Transformation des Anteils an der Aufnahme, wo der Lärm-Funktion eingefügt wurde. Kombinieren Sie die Fourier-Transformation für jede Spannung Schritt in mxn Matrix, wobei m die Anzahl der Frequenzen in der FFT und n ist die Anzahl der Spannung Schritte. In dieser Konfiguration stellt jeder Zeile der Matrix die Amplitude einer einzigen Frequenz auf allen Spannungsebenen Schritte in das Experiment. </li><li> Für jede Frequenz (dh jede Zeile in der obigen Matrix) korrelieren die Zeile mit der IV-Kurve in 3.1 generiert und Aufzeichnung der Korrelationskoeffizient. </li><li> Plot der Korrelationskoeffizient vs Frequenz auf Frequenzen, die stark mit dem IV-Kurve zu visualisieren. Da die DC-Komponente innerhalb der ersten Frequenz des FFT enthalten ist, sollte der Korrelationskoeffizient für diese Frequenz immer&gt; 0,99 sein. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Vertreter Voltage-Clamp-Messungen sind für ein Modell Zelle ohne (Abbildung 1A) und mit (Abbildung 1B) ein Geräusch Funktion in der Spannung Schritt-Protokoll eingefügt gezeigt. Die IV-Kurve wurde auch für das Modell Zelle (Abbildung 1C) berechnet. Für jeden Sweep, in dem Aufnahmen aus Abbildung 1 wurde die FFT über den zeitlichen Rahmen, wo der Lärm-Funktion eingesetzt wurde (siehe roter Kasten in den Figuren 1A, 1B) berechnet. 2A und 2B zeigen die FFTs für die Aufnahmen in Abbildung 1A und 1B gezeigt, jeweils berechnet. Bei visueller Betrachtung erscheint die DC-Komponente (rot markiert), um die Form der IV-Kurve zu imitieren. Ohne den Lärm-Funktion erscheinen alle Frequenzen oberhalb von DC bis Amplituden nahe Null (Abbildung 2A) haben. Wenn der Lärm-Funktion eingesetzt wird, haben Frequenzen zwischen 1 und 15 kHz optisch deutlichen Amplituden (Abbildung 2B). Abbildung 3 zeigt das Ergebnis der Korrelation von einzelnen Frequenz-Amplituden im Bereich von Spannung Schritte gegen die IV-Kurve. Abbildung 3A-C zeigt die Korrelationskoeffizienten, wenn das Experiment unter Kontrollbedingungen (kein Lärm-Funktion) und mit Rauschamplituden von 50 und 100 mV bzw. durchgeführt wurde. Beachten Sie in jedem Fall erscheint die DC-Komponente auf nahezu perfekt korrelieren mit der IV-Kurve. In der Tat, für alle Aufnahmen, betrug der Korrelationskoeffizient für diese Frequenz größer als 0,99 (R = 0,9996 ± 1E-5, Mittelwert ± Standardabweichung). Als wir bei 3A (Kontrollbedingungen) aussehen, gibt es keine Frequenzen neben der DC-Komponente, deren Amplitude deutlich korreliert mit der IV-Kurve. Genauer gesagt, haben keine dieser Frequenzen Korrelationskoeffizienten größer als 0,5. Beim Einsetzen der niedrigsten Amplitudenrauschen Funktion (50 mV), die gleichen Frequenzen noch Korrelationskoeffizienten kleiner als 0,5. Die Korrelationskoeffizienten für diese Frequenzen auch nicht größer geworden als 0,5, wenn das Rauschen Amplitude auf 100 mV erhöht wurde. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> . Abbildung 1 Modell Zelle Recordings: Voltage Clamp Messungen sind für ein Modell Zelle ohne (1A) und mit (1B) ein Geräusch Funktion in der Spannung Schritt-Protokoll enthalten angezeigt. Für den ersten und letzten 20 ms von jedem Sweep, war das Potential an der Holding Potential (0 mV) gehalten. Jede Spannung Schritt war 80 ms lang, und der Lärm-Funktion lag bei 40 ms nach dem Beginn des Schrittes eingesetzt. Der Lärm Funktion hatte eine Laufzeit von 30 ms und enthielt Frequenzen zwischen 1 und 15 kHz. Spannung war fro, trat -150 bis +50 mV in 5 mV-Schritten. Ein IV-Kurve für das Modell Zelle wird auch gezeigt, (1C). Um die Aufnahmen leichter zu lesen, war nur jeder fünfte Sweep in 1A und 1B enthalten, aber alle Sweeps wurden in 1C enthalten. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2 FFT der Aufnahmen:. Die FFT wurde für die 30 ms Teil jedes fegen, wo der Lärm-Funktion eingefügt (das Gebiet durch die rote Box in den Figuren 1A, 1B begrenzt) berechnet werden. 2A und 2B zeigen die FFTs ohne und mit dem Lärm-Funktion berechnet, jeweils. Wieder einmal ist der Übersichtlichkeit halber nur die FFT von jedem fünften Sweep in der Zahl nicht enthalten, aber alle Sweeps wurden in die künftige Berechnung verwendet. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> . Abbildung 3 IV Frequency Korrelationen: Die Ergebnisse der Korrelationen zwischen den IV-Kurve einer Aufnahme und die Amplitude der einzelnen Frequenzen im Bereich von Spannung Schritte gezeigt. 1A - 1C zeigen die Korrelationskoeffizienten für Frequenzen von 0 bis 20 kHz unter Kontrollbedingungen und in Gegenwart von 50 oder 100 mV Lärm Funktionen bzw.. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4 Re-Creation der IV-Kurve:. Die IV-Kurve für das Modell Zelle (wie Abbildung 1C) und die Größe der beiden Frequenzen wurden überlagert. Die erste Frequenz war die DC-Komponente (R = 0,995) und der zweite war ein zufällig ausgewähltes Frequenz mit geringer Korrelation (R = 0,3212). Die Frequenz Amplituden wurden auf etwa die gleiche Amplitude wie die IV-Kurve skaliert.

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Es gibt technische Hindernisse, die derzeit verhindern, Forscher aus der Messung mehrerer Ionenkanal-Typen gleichzeitig mit der Absicht, später zu bestimmen, wie viel Strom sollte für jeden Kanal-Typ zugeordnet werden. Aufgrund dieser Einschränkung sind Ionenkanäle in der Regel individuell mit Hilfe von Techniken wie Spannung, Strom, und Aktionspotential Klammer untersucht. 1 Um individuelle Kanaltypen, heterologe Expressionssysteme werden oft verwendet, zu studieren. 2 Bei der Arbeit mit Zellen aus dem Gewebe isoliert, wie Kardiomyozyten , müssen andere Mittel verwendet, um verschiedene Ionenkanäle blockieren. Zum Beispiel Natrium-Kanäle durch eine langsame depolarisierende Spannungsrampe inaktiviert werden kann, können 3 nach innen Behebung Kalium-Kanäle mit extrazellulären BaCl2 blockiert werden, 4 und Calcium-Kanäle blockiert mit Verapamil werden. 5 Eine Methode verwendet, die teilweise überwindet diese Einschränkung ist es, aktuelle Fluss durch zwei Kanäle Typen gleichzeitig messen Sie dann die Messung zu wiederholen, nachdem eine selektive Blockade eines Kanals Typ mit einem geeigneten Agenten. Subtraktion der beiden Messungen kann dann verwendet werden, um die Menge des Stroms auf die Kanal-Typ, der blockiert wurde, zu schätzen. 6 Es gibt jedoch zwei wesentliche Einschränkungen dieser Technik. Zunächst chemischen Mitteln nicht identifiziert worden, die selektiv blockieren Ionenkanal, und einige weit verbreitete Drogen haben unspezifische Wechselwirkungen mit anderen Kanal-Typen. 5,7 Zweitens kann es nicht von dieser Technik festgestellt werden, ob ein Kanal moduliert durch eine andere Kanal. Zum Beispiel hat heterogene Expression von NAV 1.5 und 2.1 in Kir Meerschweinchen Ventrikel gezeigt worden, und es wurde vorgeschlagen, dass eine synergistische Beziehung zwischen den beiden Kanälen besteht, so dass höhere Kir 2,1 Ausdruck in der rechten Herzkammer Leitgeschwindigkeit drückt. 8 Derzeit Dies kann nicht verifiziert werden. In dieser Studie empfehlen wir, dass Impedanzspektroskopie kann ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung mehrerer Ionenkanal-Typen gleichzeitig gemessen werden. Obwohl das vorgestellte Verfahren noch nie benutzt worden, um Ströme von Zwei-Kanal-Typen gleichzeitig gemessen zu erkennen, hat Impedanzspektroskopie verwendet worden, um eine Reihe von anderen Aspekten der Ionenkanal-Funktion zu untersuchen. Goodman und Kunst zeigte mit Schildkröte auditive Haarzellen, die Stromzange Protokolle geändert werden, um eine Zelle auf verschiedene Frequenzen einstellen werden können, und die Schwingungen in der Transmembran-Potential ist durch ein Wechselspiel zwischen einer inneren Gleichrichtung K +-Kanal und einen Ca 2 +-Kanal. 9 Han und Frazier gezeigt, dass Impedanz kann in einer einzelnen Zelle über einen weiten Bereich von Frequenzen (100 Hz bis 5 MHz) gemessen werden, und der Anstieg der Impedanz beobachtet werden, wenn K + oder Ca 2 +-Kanäle blockiert waren ein einfaches Mittel sein könnte, um erkennen Kanalblock in hohem Durchsatz Drogen-Bildschirme. 10 Hayashi und Fishman haben komplexe Leitwert zur kinetischen Eigenschaften einer inneren Gleichrichtung K + Kanal. 11 Andere Gruppen haben eine einzige Frequenz in den Voltage-Clamp-Protokoll verschiedener Kanäle eingesetzt und zeigte, dass die beobachtet Frequenzgang stimmte mit der erwarteten Antwort für einige Frequenzen, andere aber nicht. 12,13 Millonas und Hanck schlug der Grund, warum einige Frequenzen nicht vorgelegt habe die erwartete Antwort ist die Anwesenheit von mehreren Geschwindigkeitskonstanten in der Markov-Modell. 12 Studien wie diese, sowie andere, haben gezeigt, dass es Fälle, in denen Ionenströme von Ionenkanälen gemessen, während mit Impedanzspektroskopie nicht mit den theoretischen Frequenzgang zustimmen. Dies ist kein Problem in dieser Studie, weil der Zweck des Verfahrens in dieser Studie ist die Frequenzen, die mit der aktuellen Amplitude unabhängig von der zugrunde liegenden Annahmen der Membran Stromkreis korrelieren zu identifizieren. Furtheremore, ist die Stromamplitude von Teilen der Aufnahmen, die haben noch keine Lärm-Funktionen in sie eingefügt berechnet. Eine Reihe von anderen Studien ebenfalls anwesend Modelle zahlreicher Ionenkanäle ausstellenden zahlreichen leitenden und nicht-Leitungszuständen alle mit ihren eigenen Geschwindigkeitskonstanten. 14,15,16 Thompson et al zeigten, dass die Selektivität des Filters KcsA Kanal verschiedene Bindungsstellen für Na hat +, Li + und K +, und die energetischen Kosten des Übergangs von einer Bindungsstelle zu einem anderen als Ion bewegt sich durch die Selektivitätsfilter macht der Kanal bevorzugt Verhalten K +-Ionen durch ihre Poren. 17 In diesem Papier haben wir eingefügt eine Reihe von Frequenzen (Lärm-Funktion) in eine Spannung Schritt-Protokoll und sah für Frequenzen, deren Amplitude sehr zufrieden mit dem gesamten Stromamplitude korrelieren. Da starke Beweise vorgelegt hat darauf hindeutet, mehrere Geschwindigkeitskonstanten spielen eine Rolle bei Ionenleitung durch different-Kanäle, die Einführung der Frequenzen mit diesen Geschwindigkeitskonstanten verbundene kann bestimmte Frequenzen zu schwingen oder stark mit der Stromamplitude, die nicht über die sonst zu korrelieren. Die Technik in dieser Studie gezeigt, basiert auf einem Modell-Zelle, die eine parallele RC-Schaltung, die normalerweise verwendet wird, um die Voltage-Clamp-Schaltung und den Erwerb Ausrüstung durchgeführt wird. Es wird nicht erwartet, dass alle Frequenzen außer DC würde mit der aktuellen Größenordnung korrelieren, und das ist in unserer Datenbank angezeigt. Wir zeigen auch, dass neben der Lärm-Funktion nicht die Ursache für alle Frequenzen zu stark mit der Stromamplitude zu korrelieren. Diese beiden Ergebnisse sind kritisch, weil sie zeigen, dass die Messgeräte und Lärm-Funktion nicht selbst verursacht keine Frequenzen mit der Stromamplitude zu korrelieren. Wenn zukünftige Studien-Messungen mit Membranen, die Ionenkanäle zu machen, ist zu erwarten, dass, abhängig von der verwendeten Kanal, Frequenzen, die Geschwindigkeitskonstanten im Selektivitätsfilter oder eventuell die Poren entsprechen, werden der Frequenzgang des Kanals beeinflussen und Auswirkungen auf die Frequenzen hoch gewesen oder geringe Korrelation mit der Stromamplitude. Da diese Methode ist eine neue Technik zur Untersuchung von Ionenkanälen, gibt es eine Reihe von Richtungen zukünftigen Studien könnten folgen. Erstens sollte die Technik verwendet, um den Frequenzgang der spezifischen isolierte Kanäle zu charakterisieren. Zusätzliche Arbeit muss auch getan werden, um die Frequenz Amplituden der Stromamplituden zu kalibrieren. Sobald mehrere Kanäle einzeln gekennzeichnet sind, sollten mehrere Kanal-Typen gleichzeitig gemessen werden. Die Technik könnte auch für den Einsatz in Aktionspotential Klemme, Stromzange und Feld Stimulation Studien angepasst werden. Zwar ist dies eine neue Technik, zeigt es, was kann eine leistungsfähige Methode zur elektrophysiologischen Messungen, die bisher nicht möglich zu gestalten und liefern wertvolle neue Erkenntnisse über die physiologische Rolle von Ionenkanälen werden.

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<td>&nbsp;</td>
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<td>Model Cell</td>
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<td>Molecular Devices</td>
<td>Patch 1 Model Cell</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
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		</table>
		</div>

recapitulation of an ion channel iv curve using frequency components

EINFÜHRUNG: Derzeit gibt es keine etablierten Methoden, um mehrere Ionenkanal-Typen gleichzeitig zu messen und zersetzen sich der gemessene Strom in Portionen, die den einzelnen Kanal-Typ. Diese Studie zeigt, wie Impedanzspektroskopie verwendet werden, um spezifische Frequenzen, die stark mit der stationären Stromamplitude während Voltage-Clamp-Experimenten gemessen zu identifizieren. Das Verfahren beinhaltet das Einfügen eines Lärm-Funktion, die bestimmte Frequenzen in der Spannung Schritt-Protokoll. In der vorliegenden Arbeit wird ein Modell Zelle verwendet werden, um nachzuweisen, dass keine hohen Korrelationen der Voltage-Clamp-Schaltung eingeführt werden, und auch, dass der Lärm Funktion selbst führt keine hohen Korrelationen, wenn keine Ionenkanäle vorhanden sind. Diese Überprüfung ist notwendig, bevor die Technik, um Zubereitungen, die Ionenkanäle angewendet werden können. Der Zweck des Protokolls vorgelegt wird, um zu demonstrieren, wie man den Frequenzgang eines einzelnen Ionenkanal-Typ in einen Rausch zu charakterisieren. Sobald bestimmte Frequenzen in einem einzelnen Kanal-Typ identifiziert worden sind, können sie verwendet werden, um die stationäre Strom-Spannungs-(IV)-Kurve zu reproduzieren. Frequenzen, die stark mit einem Kanal-Typ und minimal korrelieren mit anderen Kanal-Typen können dann verwendet werden, um die aktuelle Beitrag von Mehrkanal-Typen gleichzeitig gemessen zu schätzen. Methodik: Voltage Clamp-Messungen wurden an einem Modell-Zelle mit einem Standard-Spannung Schritt-Protokoll (-150 bis +50 mV, 5mV Schritten) durchgeführt. Lärm-Funktionen, die gleiche Größenordnung von 1-15 kHz Frequenzen (null bis Spitzenamplituden: 50 oder 100 mV) wurden in jede Spannung Schritt eingefügt. Der Realteil der Fast Fourier Transformation (FFT) des Ausgangssignals wurde mit und ohne Lärm für jeden Schritt Potential berechnet. Die Größe der einzelnen Frequenz als Funktion der Spannung Schritt wurde mit der Stromamplitude bei den entsprechenden Spannungen korreliert. Ergebnisse und Schlussfolgerungen: In der Abwesenheit von Lärm (Kontrolle), Größen aller Frequenzen mit Ausnahme der DC-Komponente korreliert schlecht (| R | &lt;0,5) mit der IV-Kurve, während die DC-Komponente war ein Korrelationskoeffizient größer als 0,999 in allen Maßen. Die Qualität der Korrelation zwischen einzelnen Frequenzen und die IV-Kurve nicht ändern, wenn ein Geräusch Funktion, um die Spannung Schritt-Protokoll aufgenommen wurde. Ebenso die Erhöhung der Amplitude des Rauschens Funktion auch nicht zu einer Erhöhung der Korrelation. Kontrollmessungen zeigen, dass die Voltage-Clamp-Schaltung an sich verursacht keine Frequenzen oberhalb von 0 Hz bis sehr zufrieden mit dem Steady-State-IV-Kurve korrelieren. Ebenso zeigen Messungen in Anwesenheit des Lärm-Funktion, die den Lärm-Funktion verursacht keine Frequenzen oberhalb von 0 Hz bis die steady-state IV-Kurve korrelieren, wenn keine Ionenkanäle vorhanden sind. Auf der Grundlage dieser Überprüfung kann die Methode nun Zubereitungen, die ein einzelner Ionenkanal-Typ mit der Absicht, die Identifizierung Frequenzen, deren Amplituden korrelieren speziell mit diesem Kanal Typ angewendet werden.

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Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

Es gibt technische Hindernisse für die Messung der Stromfluss durch mehrere Ionen-Kanäle gleichzeitig und später erkennen, was Teil der transmembrane Strom wird durch jeden Kanal-Typ. Um diesen Bedarf, stellt diese Methode eine Möglichkeit, die IV-Kurve der einzelnen Kanal-Typen mit spezifischen Frequenz-Komponenten zu erzeugen.

Rekapitulation eines Ionenkanals IV Curve mit Frequenzkomponenten

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

recapitulation-of-an-ion-channel-iv-curve-using-frequency-components

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Biology

13.4K Aufrufe.  University of Utah. Es gibt technische Hindernisse für die Messung der Stromfluss durch mehrere Ionen-Kanäle gleichzeitig und später erkennen, was Teil der transmembrane Strom wird durch jeden Kanal-Typ. Um diesen Bedarf, stellt diese Methode eine Möglichkeit, die IV-Kurve der einzelnen Kanal-Typen mit spezifischen Frequenz-Komponenten zu erzeugen.

Serie: Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

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Forschung

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The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

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Wesentliche Komponenten des Lichtmikroskops

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Hausgemachte Mutagenese von Whole Plasmide

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

Die Quantifizierung der Häufigkeit von Tumor-Ausbreitung Cells Mit Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngene Zebrafisch

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Exploring arteriellen glatten Muskelzellen KV7 Kalium Kanal Funktion mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Druck Myographie

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Rekonstitution der ein Transmembranprotein, das spannungsgesteuerten Ionenkanal, KvAP, in Riesen unilamellare Vesikel für Mikroskopie und Patch-Clamp-Studien

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Funktionelle Charakterisierung von Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Wärmetauscher von intrazellulären Kompartimente Mit Proton-Tötung Selection man sie an der Plasmamembran Express

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Die Messung der extrazellulären Ionenflüsse Verwendung der ionenselektiven selbst verweisMikroElektroden-Technik

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...