Der Autor dankt tief Dr. Asako Sugimoto (Tohoku University) für ihre hilfreiche Diskussion. wyIs251 war ein großzügiges Geschenk von Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 lieferte die CGC, das von NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Grant #17 H 05010 und #16 H 06536 und Daiichi Sankyo-Stiftung, Brain Science Foundation und Naito Foundation unterstützt.

1. Probenvorbereitung <ol><li>erzeugen eine transgene C. Elegans Belastung mit transgenen Methoden 18. Alternativ erhalten Sie geeignete Stämme von Caenorhabditis Genetik Center (CGC). Um axonalen Transport von synaptischen Vesikel Vorstufen zu visualisieren, verwenden die transgene Linie wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. IFT, transgene Linie mnIs17 [Osm-6::gfp] 19 erhalten zu beobachten. Diese Stämme sind in diesem Protokoll verwendeten. 
	Hinweis: Entweder extrachromosomale Array, genomischen Integration oder sogar GFP Knock-in arbeitet. Um Hintergrund Signale zu reduzieren, verwenden Sie zellspezifische Promotoren, sondern als Pan-neuronale Promotoren. 
	Hinweis: Die Wartung von Würmern ist in anderen Protokollen 20 beschrieben. Belastungen wurden mittlere (NGM) Platten (1,7 % (w/V) Agarose, 50 mM NaCl, 0,25 % (w/V) Pepton, 1 mM CaCl 2, 5 mg/mL Cholesterin, 25 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO auf Rasen Escherischia coli OP50 Feeder auf Nematoden Wachstum beibehalten. 4 auf 60 mm Durchmesser Kunststoffgeschirr) bei 20 ° c</li>
	<li>Grow worms bei 20 ° C auf NGM Platten zu jeder Phase des Lebenszyklus der Würmer. 
	Hinweis: Man kann in jedem Stadium axonalen Transport und IFT beobachten. Späten L4 zu jungen Erwachsenen ist eine gute positive Kontrolle, weil mehrere Publikationen, diese Phasen und visualisierte Menschenhandel Veranstaltungen 14 , 21 , 22 verwendet haben , 23.</li>
</ol> 2. Vorbereitung von 10 % Agarose Hinweis: viele Hersteller bieten ähnliche Produkte wie Agar Agar Pulver und Agarose. Verwenden Sie Elektrophorese Klasse Agarose (Stärke-gel &#62; 1200 g/cm 2). Billige Agar Pulver nicht funktionieren, weil die resultierende Gel nicht stark genug ist, um Würmer zu immobilisieren.
<ol><li>Mix 0,4 g Agarose in 4 mL destilliertem Wasser (DW) in einer Glasröhre (1,5 cm x 10,5 cm). Setzen Sie einen Deckel auf die Glasröhre um Verdunstung zu vermeiden.</li>
	<li>Setzen das Glasrohr auf einem Heizblock 95 ° C für 90 min. Darüber hinaus bereiten Sie ein weiteres Glasrohr (1,5 cm x 10,5 cm) gefüllt mit DW und halten Sie es bei 95 ° c stellen einen Pasteur Pipettieren in der 95 ° C DW ( Abb. 1 A). Viele kleine Bläschen zu sehen, in der Agarose-Röhre und die Lösung trüb werden sollte. Lassen Sie es, bis die Lösung klar wird. Dann mischen Sie durch Pipettieren rauf und runter, bis die Agarose-Lösung homogen wird. 
	Hinweis: Mikrowellen können nicht verwendet werden, zur Vorbereitung von 10 % Agarose-Lösung, wenn aus DW und Agarose. Kleine Bläschen, die durch Mikrowellen verursacht verhindern Agarose schmelzen. Jedoch kann wieder mit Hilfe einer Mikrowelle erstarrten 10 % Agarose-Gel leicht geschmolzen werden. Glasröhren mit 10 % Agarose-Gel werden vor der Zeit vorbereitet und bei 4 ° C für mindestens 6 Monate gelagert. Wenn dabei schmelzen die Lager mit Hilfe einer Mikrowelle bei Bedarf und ab Schritt 3 in diesem Protokoll. 
	Hinweis: Agarose verliert allmählich die Fähigkeit zu verfestigen, wenn für eine lange Zeit oder nach wiederholten Erstarrung und schmelzen bei 95 ° C inkubiert. In diesem Fall bereiten neue 10 % Agarose.</li>
</ol> 3. Vorbereitung der Agarose Pad <ol><li>mit der erwärmten Pasteur Pipettieren vorbereitet im Schritt 2.2, legen Sie 2 Tropfen 10 % Agarose auf einer Folie 76 x 22 mm.</li>
	<li>Erstarrt schnell Abdeckung mit einer zweiten 76 x 22 mm 2 Folie vor der Agarose-Tropfen, wie in Abbildung 1 B, und drücken Sie unten auf der zweiten Folie gezeigt, die Agarose-Lösung zu vereinfachen. Die Dicke sollte 0,5-1 mm.</li>
	<li>Spülen schnell Pasteurpipette Pipettieren 95 ° c DW rauf und runter, bis die Agarose-Lösung ausgewaschen ist. Andernfalls wird das Pipettieren von Agarosegel verstopft werden. Lassen Sie die Pipette stehen in der 95 ° C DW.</li>
	<li>Für 1 min warten. Die Agarose-Pad bildet und wird trüb. Schieben Sie die Folien voneinander entfernt per Hand ( Abbildung 1 C).</li>
</ol> 4. Montage von Würmern Hinweis: bereits geringe Mengen an Wurm Bewegung verhindern gute Beobachtung. Levamisol hat traditionell verwendet, um zu verhindern, dass Wurm Bewegung auf die Agarose Pad 24 , 25. Jedoch Levamisole hemmt neuronale Rezeptoren in C. Elegans und deshalb beeinträchtigen Menschenhandel Ereignisse in Neuronen 15. Mit Polystyrol Microbeads beschriebenen Hereis eine gute alternative 17.
<ol><li>Unter dem Stereo-Mikroskop mit einer verschiebbaren Spiegel durchleuchtbaren ausgestattet, übertragen ~ 30 transgenen Würmer mit dem Ausdruck der entsprechenden Markierungen, um eine neue NGM Platte ohne Bakterien mit einem Platindraht holen. 
	Hinweis: Eine Platindraht Pick ist aus Platindraht und Pasteur-Pipette (5 Zoll), und die Spitze der Platindraht wurde dem Erdboden gleichgemacht. Die Vorbereitung der Platindraht Picks und Handhabung von Würmern mit diesen sind beschrieben in der Wormbook (http://www.wormbook.org).</li>
	<li>Lassen Sie die Platte für 1 min. Bakterien werden automatisch entfernt von den Oberflächen des Würmer wie die Würmer auf NGM Agarose-Gel ohne Bakterien bewegen.</li>
	<li>Put a 0.5-1.0 µL Tropfen 2,6 % 100 nm Durchmesser Polystyrol Microbeads im Wasser auf das Agar-Pad ( Abbildung 1 D). Übertragen Sie 10-20 Würmer aus der bakterienfrei NGM-Platte auf die Microbeads. Tropfen und Verbreitung der Würmer mit der Platindraht auswählen, um zu vermeiden, die Überlappung der Wurm stellen ( Abbildung 1 E).</li>
	<li>Gelten ein 22 x 40 mm 2 Deckglas ( Abbildung 1 F). Drücken Sie vorsichtig um Luftblasen zu entfernen, aber vermeiden vernichtende Würmer. Die Probe ist nun bereit für die Abbilderstellung. 
	Hinweis: Da keine Narkose verabreicht wird, sind Würmer nur durch die Reibungskraft, erzeugt durch die Agar-Pad, Polystyrol Microbeads und Deckglas 17 behoben. Das Vorhandensein von Feeder Bakterien und/oder zuviel Lösung wird die Reibungskraft schwächer machen. 
	Hinweis: Verschiedene Größen von Deckgläsern (z.B., 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2) arbeiten. Jedoch größere Deckgläsern können verhindern, dass Wasser eintauchen oder Öl aus der Austritt von Flüssigkeit ins Proben während der Beobachtung Objektivlinse.</li>
</ol> 5. Beobachtung Hinweis: geeignete bildgebende Parameter (Laserleistung, Gewinn, binning, etc.) werden für jedes Mikroskop und Kamera unterscheiden. Hier dient ein Weitfeld-Mikroskop mit drehenden Scheibe konfokale Scanner und eine digitale CCD-Kamera ausgestattet.
<ol><li>Stellen der Temperaturregler der Bühne auf 20 ° C, oder passen Sie die Raumtemperatur auf 20 ° c</li>
	<li>Setzen die Beispielfolie auf den Mikroskoptisch. Verwenden Sie 100 X (numerische Apertur = 1,3 oder besser) Objektivlinse.</li>
	<li>Achten Sie auf die jeweiligen Bereiche in Abbildung 2 A (für wyIs251 und axonalen Transport) oder Abbildung 2 B (für mnIs17 und IFT) als Positivkontrollen . Andere Bereiche können analysiert werden, wie gut 22.</li>
	<li>Set-Parameter (CCD Gain = 200, Binning = 1 oder 2, Laserleistung bei 488 nm = 1,0-1,3 mW). Zeitraffer Zeiterfassung mit 4 Frames pro Sekunde für bis zu 1 min. Speicherdateien als Tcl/TK-TIFF-Format durchführen. 
	Hinweis: Wenn GLP signalisiert verschwinden und es ist schwierig, weiterhin beobachten, GFP::RAB-3 oder OSM-6::GFP für 30 s, die Laserleistung ist zu stark. In diesem Fall reduzieren Sie die Laserleistung. Umgekehrt, wenn keine vesikuläre Bewegung erfasst wird, ist die Laserleistung zu schwach. In diesem Fall erhöhen die Laserleistung.</li>
	<li>Beobachten einen anderen Wurm und 5.3 und 5.4 wiederholen. Die Beobachtungen können für bis zu 20 min dauern, aber jeder Wurm sollte nur einmal aufgezeichnet werden, um die Auswirkungen von p zu vermeidenHoto Schaden. 
	Hinweis: Würmer sind für mindestens 20 Minuten ohne wesentliche Mängel 7 , 27 , 28 beobachtet worden. Längere Beobachtung möglicherweise aber Haven &#39; t wurde noch nicht getestet. Ein deutliches Zeichen der neuronalen Tod ist die Änderung der neuronale Morphologie wie Neuriten Schwellung. Wie schwache Signale der GFP in Axone und Dendriten in wyIs251 und mnIs17 ersichtlich ist, kann die Neuriten Morphologie leicht überprüft werden, bei einem Blick auf Axone und Dendriten. Neuronale Morphologie ist in Abbildung 2 gezeigt.</li>
	<li>Film-Dateien zu erzeugen.
	<ol><li>Offene Multi-TIFF-Datei mit Fidschi-Software. Gehen Sie zu Datei &#62; öffnen und wählen Sie dann die Multi-TIFF-Datei in Schritt 5.4 gespeichert. 
		Hinweis: Fidschi kann bei jttps://fiji.sc heruntergeladen werden. Bild J und Plugins können auch verwendet werden, um Kymographs zu erzeugen. Wenn dabei die relevanten Anweisungen für das ausgewählte Plugin.</li> <li>Klicken Sie auf die &#34; rechteckige Auswahl &#34; ( Abb. 3 A, Pfeil) und wählen Sie den gewünschten Bereich durch Zeichnen eines Rechtecks mit einer Computer-Maus (gelbes Rechteck im Bild 3 A). Gehe zu Bild &#62; Stapel &#62; Tools &#62; Substacks und wählen Sie die Slice-Nummern, die im Film enthalten sind. Entsteht ein Substack.</li>
		<li>Das Substack-Fenster durch einen Klick aktivieren und zum Bild &#62; Adjust &#62; Helligkeit/Kontrast. Ein Fenster, um die Helligkeit und den Kontrast anpassen angezeigt wird. Schieben Sie in das Fenster oben bar (mindestens) auf der rechten Seite so dass das Hintergrundsignal verschwindet und die zweite nach oben bar (Maximum) auf der linken Seite so, dass der beweglichen Vesikel und Partikel können man ganz gut über dem Hintergrund.</li>
		<li>Zum Bild &#62; Stapel &#62; Zeit Stamper. Wie der Film mit 4 Frames/s in Schritt 5.4 aufgezeichnet ist, ist der zeitliche Abstand 0,25 s. So geben &#34; 0,25 &#34; Intervalls.</li>
		<li>Erzeugen eine Filmdatei speichern unter wählen &#62; AVI aus dem Menü "Datei" (Movie 1 und 2). 
		Hinweis: Durch die Verwendung geeigneter Plugins, Sie können die Datei speichern als andere Formate wie &#34; mpeg4 &#34; oder &#34; Mov &#34; Dateien.</li>
	</ol></li> <li>Erzeugen Kymographs.
	<ol><li>Öffnen Sie die ursprüngliche Filmdateien mit Fidschi-Software erneut und wiederholen Sie die Schritte 5.6.2 und 5.6.3 die Helligkeit und den Kontrast anpassen.</li>
		<li>Klicken Sie &#34; segmentiert Linie &#34; ( Abbildung 3 B, Pfeil). Mit der Maus eine segmentierte Linie entlang der Zilien oder Axon (gelbe Linie in Abbildung 3 B).</li>
		<li>Gehen zu analysieren &#62; Multi Glomeruli &#62; Multi Kymograph ( Abb. 3 C). Breite Fenster "Linie" wird angezeigt ( Abbildung 3 D). Typ &#34; 3 &#34; in der Linienbreite Fenster und klicken Sie auf "OK" ( Abbildung 3 D).</li>
		<li>Glomeruli Fenster entsteht. Speichern Sie das Bild in TIFF oder JPEG-Format.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+of+cooperating+kinesin-2+motors+orchestrates+cargo+import+and+transport+in+C.+elegans+cilia.">Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia.</a> Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).</li><li>Robison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detyrosinated+microtubules+buckle+and+bear+load+in+contracting+cardiomyocytes.">Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes.</a> Science. 352 (6284), 0659 (2016).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li></ol>

Der Autor hat nichts preisgeben.

Einschränkung in Bezug auf vorhandene Methoden Die hier beschriebene Methode ist optimiert, um schnell Ereignisse wie axonalen Transport und IFT beobachten. Immobilisierung ist somit mehr als längere Inkubationszeit priorisiert. Während wir Menschenhandel Ereignisse für mindestens 20 Minuten ohne bedeutende Störung beobachtet wurden, kann diese Methode nicht immer zu langsam Ereignisse erfordern längere Beobachtungen, wie Axon Dehnung und Zellwanderung beobachten geeignet. Für längere Beobacht...

Live Cell Imaging ist ein wesentliches Instrument für die Analyse von intrazellulären Transport. In neuronale Zellbiologie sind Analysen des axonalen Transports mit live Cell Imaging unerlässlich für das Verständnis der neuronalen Funktion und Morphogenese1. Mängel im axonalen Transport unterliegen verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen2. Kinesin-Superfamilie Proteine und Dynien durchführen bzw. axonalen Transport Anterogradely und Doppelthebel,1,2.
Zilien sind ein weiteres zellulären Fach, in dem die Mikrotubuli Netzwerk und Menschenhandel Maschinen hochentwickelte3sind. Protein Synthese Maschinen ist nicht in Zilien, lokalisiert, d.h. ciliary Proteine zu den Zilien-Tipps aus dem Zytoplasma transportiert werden müssen. Zilien-spezifische Kinesin und Dynien, namens Kinesin-2 und zytoplasmatischen Dynien-2, bzw., transport der Komponenten der Zilien4, in ein Phänomen namens intraflagellar Transport (IFT)5. Beeinträchtigung der IFT verursacht ein Spektrum von Krankheiten genannt Ciliopathies6. Somit ist Analyse der IFT-Mechanismus von live Cell Imaging erforderlich grundlegende Mechanismen der ciliary Entstehung und Pathogenese zu verstehen.
Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist ein gutes Modell, axonalen Transport und IFT7,8,9zu studieren. Um IFT zu beobachten, hat Chlamydomonas als Modell Organismus5,6verbreitet. Wie Chlamydomonas eines einzelligen Organismus ist, wäre das Verhältnis von IFT mit Altern, neuronale Funktion und Verhalten schwer zu analysieren. Darüber hinaus wurden wichtige genetische Techniken wie CRISPR/Cas9 nicht auf Chlamydomonasangewendet. Bei höheren Modellorganismen wie Mäuse und Drosophilaverursacht Störung des axonalen Transports und IFT oft tödliche Phänotypen, weil axonalen Transport und IFT für die Morphogenese und Homöostase der Tiere 10notwendig sind, 11. Bei Mäusen ist Zellkultur und Transfektion in der Regel zu beobachten axonalen Transport und IFT, wonach viele Fähigkeiten und umfangreiche Zeit12,13erforderlich. Darüber hinaus kann viele wichtige physiologische Zusammenhänge in kultivierten Zellen und Zell-Linien verloren gehen. C. Elegans Mutanten in denen axonalen Transport oder IFT werden gestört, weil das Nervensystem nicht essentiell für das Überleben der Würmer ist, sind oft nicht tödliche7,9,14. Axonalen Transport und IFT können direkt in Vivo ohne Dissektion beobachtet werden, weil C. Elegans transparent ist und deshalb einfach zu GFP-Tags Marker zu beobachten.
Es gibt mehrere Protokolle, C. Elegans, z. B. die Verwendung eines mikrofluidischen Gerät15, Agarose-Pads mit Anästhesie16oder Microbeads17zu immobilisieren. Die Einbeziehung der Narkose kann der Menschenhandel Ereignisse in Neuronen15hemmen. Ein klarer Nachteil der Mikrofluidik-Gerät Methode ist, dass die Vorbereitung einer mikrofluidischen Gerät nicht immer einfach ist. Immobilisierung von Agarose-Pads und Microbeads ist stattdessen eine bequeme und einfache Möglichkeit, Time Lapse Bildgebung in C. Elegansdurchzuführen. Ich beschreibe hier dieses grundlegende Protokoll zu immobilisieren C. Elegans und visualisieren axonalen Transport und IFT in Vivo in C. Elegans. Im Vergleich zu anderen Methoden, die hier beschriebene Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung und ist viel billiger und leichter durchzuführen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="837">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Slideglass (76&#160; x 26 mm)</td>
			<td style="width:167px;">Matsunami</td>
			<td style="width:139px;">S1111</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Coverglass (22&#160; x 40 mm)</td>
			<td style="width:167px;">Matsunami</td>
			<td style="width:139px;">C024401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Agarose</td>
			<td style="width:167px;">Wako</td>
			<td style="width:139px;">318-01195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polystylene microbeads 0.1 micron</td>
			<td style="width:167px;">Polysciences</td>
			<td style="width:139px;">#00876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Heat block</td>
			<td style="width:167px;">TAITEC</td>
			<td style="width:139px;">0063288-000</td>
			<td>CTU-mini</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Microscope</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;">IX-71</td>
			<td>widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Spinning disk Scanner</td>
			<td style="width:167px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:139px;">CSU-X1</td>
			<td>spinning disc confocal scanner&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital CCD camera</td>
			<td style="width:167px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:139px;">C10600-10B</td>
			<td>ORCA-R2 degital CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Objective lens (x100, NA1.4)</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;">UPLSAPO 100XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Pasteur pipette (5 inch)</td>
			<td style="width:167px;">IWAKI</td>
			<td style="width:139px;">IK-PAS-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)</td>
			<td style="width:167px;">IWAKI</td>
			<td style="width:139px;">9820TST15-105NP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TV9211: wyIs251</td>
			<td style="width:167px;">Laboratory of Kang Shen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">OTL11: mnIs17</td>
			<td style="width:167px;">Ref. 27, 29</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td>SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:167px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:139px;">435064-9000-000</td>
			<td>STEMI 508&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mirror transillumination unit</td>
			<td style="width:167px;">Carl Zeiss</td>
			<td>435425-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">platinum wire (0.2 mm)</td>
			<td style="width:167px;">Nilaco Corporation</td>
			<td style="width:139px;">m78483501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm plastic dish</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:139px;">#351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fiji</td>
			<td style="width:167px;">N/A</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">nematode growth medium (NGM)&#160;&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons

Axonalen Transport und intraflagellar Transport (IFT) sind wesentlich für Axon und Zilien Morphogenese und Funktion. Kinesin-Superfamilie Proteine und Dynien sind molekulare Motoren, die Anterograde und retrograder Transport bzw. regulieren. Diese Motoren verwenden Mikrotubuli Netzwerke als Schienen. Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist eine leistungsstarke Modellorganismus axonalen Transport und IFT in Vivozu studieren. Ich beschreibe hier ein Protokoll zur axonalen Transport und IFT in lebenden beobachten C. Elegans. Beförderten Güter kann durch die Kennzeichnung Ladung Proteine mit fluoreszierenden Proteinen wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) visualisiert werden. C. Elegans ist transparent und GFP-Tags Ladung Proteine in bestimmten Zellen unter zellspezifische Promotoren ausgedrückt werden können. Lebende Würmer können durch Microbeads auf 10 % Agarose-Gel fixiert werden, ohne zu töten oder betäuben die Würmer. Unter diesen Bedingungen kann Fracht Bewegung direkt in die Axone und Zilien des Lebens beobachtet werden C. Elegans ohne Dissektion. Diese Methode kann angewendet werden, um die Beobachtung Fracht-Moleküls in alle Zellen durch Ändern der Zielproteine und/oder die Zellen, die, denen Sie in ausgedrückt werden. Grundlegendsten wie molekulare Motoren und Adapter-Proteine, die axonalen Transport und IFT beteiligt sind sind in C. Eleganskonserviert. Im Vergleich zu anderen Modellorganismen, werden Mutanten erhalten und leichter in C. Elegansgepflegt. Kombination dieser Methode mit verschiedenen C. Elegans Mutanten kann die molekularen Mechanismen der axonalen Transport und IFT klären.

Axonalen Transport in DA9 neuron Mit der wyIs251 Linie, die Anterograde und retrograde axonale Transport von GFP::RAB-3 kann in den DA9 Motoneuron gleichzeitig aufgezeichnet werden. Die Durchschnittsgeschwindigkeit der Anterograde und retrograde Transport in den proximalen dorsalen Axon des Neurons DA9 ist etwa 1,8 und 2,6 µm/s, jeweils22. Die Anzahl der beweglichen Vesikel geht um 0,03 und 0,018 pro μm Axon pro s. So findet man für ...

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Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist ein gutes Modell, axonalen und intrazellulären Transport zu studieren. Hier beschreibe ich ein Protokoll zur in-Vivo -Erfassung und Analyse der axonalen und intraflagellar Transport in C. Elegans.

Immobilisierung von Caenorhabditis Elegans analysieren intrazellulären Transport in Neuronen

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

The overall goal of this time lapse recording is to observe the intracellular transport events in Caenorhabditis elegans neurons.This method can help answer key questions in the cell biology field such as axonal transport and interflagellar transport.The main advantage of this technique is that one can observe intracellular transport in C.Elegans without dissection.Start this experiment by growing transgenic C.elegans strain of interest at 20

immobilization-caenorhabditis-elegans-to-analyze-intracellular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

7.9K Aufrufe.  Tohoku University. The overall goal of this time lapse recording is to observe the intracellular transport events in Caenorhabditis elegans neurons.This method can help answer key questions in the cell biology field such as axonal transport and interflagellar transport.The main advantage of this technique is that one can observe intracellular transport in C.Elegans without dissection.Start this experiment by growing transgenic C.elegans strain of interest at 20

Serie: Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

Räumliche und zeitliche Analyse von Active ERK in der<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Verwendung von Immunolabeling, stabilen, dynamischen und im Entstehen begriffene Mikrotubuli in Zebrafish Embryos zu analysieren

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

Beurteilung der lysosomalen Alkalisierung in den Darm von Leben Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Studium der oxidativen Stress verursachten Mitis Gruppe Streptokokken in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Isotrope Licht-Sheet-Mikroskopie und automatisierte Zelllineage-Analysen zu Katalog-Caenorhabditis elegans Embryogenese mit subzellulärer Auflösung

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

Messung der Spermienführung und-beweglichkeit innerhalb der Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...