Die Autoren wollen Andy Poczobutt und Dr. Jori Leszczynski für ihre wertvolle Hilfe und Bearbeitungen dieses Manuskriptes danken.  Unterstützt durch Zuschüsse aus den nationalen Herz-, Lungen- und Blood Institute (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 und RO3 HL095439) und das Department of Veterans Affairs (Verdienst Review).

Alle geltende internationalen, nationalen und/oder institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren (Mäuse) folgten in den Experimenten in dieser Handschrift beschrieben.
Diese Methode verwendet FVBN Erwachsener Mäuse, im Alter von 16-20 Wochen, optimal für die Zwecke dieser Studie zu sein gefunden. Tag1 umfasst die Schritte 1-5 und Tag2 umfasst Schritte 6 und 7 (Abbildung 1).
1. Ausrüstung Vorbereitung
<ol><li>Sichern Sie eine ausreichende Versorgung mit steril, Einweg-Spritzen und Nadeln, wenn Ketamin/Xylazin als die Betäubung verwendet wird (wie empfohlen). Wenn Isofluran als die Betäubung verwendet wird, überprüfen Sie die Sauerstoffflasche und des Flüssigkeitsspiegels Isofluran, stellen Sie sicher, es gibt ausreichende Versorgung für das Experiment vor dem Start. Auch montieren Sie die Atmung Schaltungen Nosecone und bringen Sie sie zum Feld Induktion; Legen Sie neue Holzkohle Kanister auf Atmung Schaltungen. Bereiten Sie die Induktion-Box von der Sauerstoffzufuhr und Feststellung, dass die zweite Stufe ca. 50 Psi liest.</li>
	<li>Schalten Sie das Heizkissen auf 37 ° C.</li>
	<li>Die rektale Temperatur-Sonde für die Operation vorbereiten.</li>
</ol>(2) Maus-Vorbereitung
Dieser Schritt umfasst die Anästhesie, Haarentfernung und Positionierung (FVBN Mäuse-Erwachsenenalter 16-20 Wochen).
<ol><li>Wiegen Sie die Mäuse und nehmen Sie die Gewichte auf.</li>
	<li>Die Mäuse zu betäuben.<ol>
<li>Ketamin und Xylazin IP zu verwalten (80-100 mg/kg und 7,5-16 mg/kg, beziehungsweise). Es wird jedoch empfohlen, mit niedrigeren Dosen von Ketamin und Xylazin beginnen (über 30 mg/kg und 6 mg/kg, beziehungsweise).</li>
		<li>Aufrechterhaltung der Narkose mit etwa 0,1 - 0,25 Mal erste Dosen von Ketamin/Xylazin während der Operation. Ketamin und Xylazin waren die Narkose Bevollmächtigten der Wahl in dieser Studie mehr Reproduzierbarkeit und Überlebensfähigkeit beobachtet wurden. Die Narkose Bevollmächtigten Wahl in anderen Studien finden, um anders zu sein.  Wenn Isofluran verwendet wird, setzen Sie die Maus in eine Induktion Kammer und Isofluran auf 5 % schalten Sie ein, bis die Maus das volle Bewusstsein verliert. Verwenden Sie dann eine nasale Nosecone auf 1,5-2,5 % Isofluran für den Rest des Verfahrens festgelegt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Überwachen Sie die Mäuse Alle 2-3 min durch Zehe Prise zu überprüfen, für die entsprechende Tiefe der Narkose.</li>
	<li>Rasieren Sie die ventralen Halsbereich der Maus.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in Rückenlage auf dem vorgeheizten Pad. Die Pfoten und Füße von der Maus an die chirurgische Oberfläche mit Klebeband zu sichern.</li>
	<li>Platzieren Sie künstliche Träne Salbe auf die Augen Austrocknen während der Operation zu verhindern.</li>
</ol>3. chirurgische Details
<ol><li>Machen Sie einen 1 cm Schnitt am rechten ventralen Hals über der Halsschlagader.</li>
	<li>Wenden Sie ein oder zwei Tropfen von Lidocain (1-2 %) in der Schnitt-Bereich für Schmerztherapie und Vasodilatation zu fördern. Warten Sie 2 Minuten für die Lidocain wirksam werden.</li>
	<li>Aussetzen und den richtigen internen Halsschlagader über stumpfe Dissektion zu isolieren. Binden Sie die Vene aus mit 4: 0 Naht und einfahren Sie sanft rostral Ende des Gefäßes mit einer Gefäßklemme. Schneiden Sie ein Loch, mit feinen Schere, ca. 3 mm unten oder kaudalen, die Krawatte, etwa auf halbem Weg durch den Durchmesser der Vene.</li>
	<li>Markieren Sie einen PV-1 polyvinyl Katheter 1,5 cm vom Ende stecken Sie ihn in die Halsschlagader durch das Loch mit einem Schiff Dilatator und Fädeln Sie den Katheter am kaudalen Ende des Schiffes, ca. 1,5 cm.</li>
	<li>Binden Sie den Katheter sicher innerhalb der kaudalen Teil des Schiffes (unter dem Schnitt), mit 4: 0 Seide. Binden Sie die rostral Teil des Schiffes an der Außenseite des Katheters mit der losen Enden des Nahtmaterials die verwendet wurde, um die rostral Halsschlagader im Schritt 3.3 zu binden.</li>
	<li>Tack die Haut locker zusammen zurück, um den Katheter mit 4: 0 Seide um Auskühlung und Austrocknung des Gewebes zu verhindern.</li>
	<li>Verbinden Sie den Katheter mit eine Spritze mit heparinisierten Kochsalzlösung (10 U/mL) und spülen Sie des Katheters.</li>
</ol>(4) Injektionen
<ol><li>Injizieren Sie die Evans blau-Lösung (50 μL einer 30 mg/mL Lösung in normaler, unheparinized Kochsalzlösung 0,9 % oder ca. 50 mg/kg) in der Halsschlagader Katheter, gefolgt von einem kleinen Volumen von heparinisierten Kochsalzlösung zu spülen Sie die Linie.</li>
	<li>2 min später, Substanz P (100 μl einer Lösung von 0,3 μM in normaler, unheparinized Kochsalzlösung 0,9 % oder 1 Nmol/kg), gefolgt von einem kleinen Volumen von heparinisierten Kochsalzlösung zu spülen Sie die Linie zu injizieren. Substanz P ergänzt die Extravasation der Plasmaproteine durch die endotheliale Schicht; in diesem Protokoll induziert es routinemäßig eine Aufwertung der Plasma Extravasation Werte von ca. 1,5-facher erleichtert Plasma Extravasation Werte zu messen.</li>
	<li>Nach Injektion der Substanz P warten Sie 18 min.. Während dieser Zeit wird der Evans blauen Farbstoff equilibrate und zirkulieren.</li>
	<li>Beenden Sie das Experiment 18 min nach der Injektion von Substanz P (20 min nach der Injektion Evans blau) durch Verzicht auf die Maus mit zervikale Dislokation. Es ist wahrscheinlich, dass die Maus direkt Zervikal ausgerenkt, ohne zuvor eine Überdosis Betäubungsmittel, wie die Maus ist wahrscheinlich noch gut betäubt von der Operation. Jedoch, wenn es notwendig ist, kann eine Überdosis Narkosemittel Ketamin/Xylazin, Isofluran oder Pentobarbital gegeben werden gefolgt von zervikale Dislokation.</li>
</ol>(5) Isolation der Organe
<ol><li>Aufschneiden der Brusthöhle der Maus und Schwerkraft-perfundieren (aus einer Höhe von ca. 51 cm oder 20") das Herz und die Blutgefäße mit 50 mL Natriumcitrat 50 mM, pH 3,5. pH 3,5 bewahrt vermutlich Evans blau Bindung an Albumin.</li>
	<li>Verbrauchsteuern Sie 1-5 zuständigen Organe (Gewebe) mit einem sezierenden Skalpell (z.B. Harnblase, Niere, Magen, Leber, Bauchspeicheldrüse, proximalen oder distalen Colon, Ileum, Zwölffingerdarm, Flanke Haut, Ohren, Rute, Herz und/oder Lunge) und entfernen Sie alle restlichen Inhalte zu, wenn anwesend.</li>
	<li>Spülen Sie die Organe bei Raumtemperatur (RT) Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, 8,0 g NaCl und 0,20 g KCl in 1 L, pH 7.4).</li>
	<li>Tupfen Sie die Organe mit Gewebe, jedes Organ in zwei Hälften schneiden und wiegen jeweils die Hälfte (nass Gewichten in g).</li>
	<li>Trocknen Sie eine Hälfte des Gewebes in einem Trockenschrank bei 150 ° C, auf Folie, für 48 h.</li>
	<li>Legen Sie die andere Hälfte in eine einheitliche Lautstärke (bis zu 200 µL) von Formamid in ein Microfuge Rohr für 48 h (und bis zu 72 h) Gewebe, die Evans blau zu extrahieren.</li>
</ol>6. Messung des Gewebes OD
<ol><li>Entfernen Sie 50 µL Evans blau angereichertes Formamid (nach 48-72 h RT Inkubation) aus Microfuge Rohr und Ort in einem Brunnen einer 96-Well Polystyrol Platte. Achten Sie darauf, dass Sie nicht Gewebe Stücke zusammen mit der Formamid übertragen.</li>
	<li>Platz 50 µL des neuen, reinen Formamid in jeder der zwei leeren Brunnen der 96-Well-Platte für die Rohlinge.</li>
	<li>Messung und Aufzeichnung der OD-620 von jedem Bohrloch 96-Well-Platte auf eine Extinktion Platte Leser. 620 nm ist die Absorption von Evans Blue max.</li>
</ol>7. Berechnung der Plasma Extravasation
<ol><li>Das trockene Gewebe wiegen die Hälfte in den Ofen für 48 h wurde.</li>
	<li>Berechnen Sie die nassen Gewicht/Dry-Gewichts-Verhältnis für die spezifische Orgel aus jeder einzelnen Maus, beginnend mit dem Frischgewicht dieses Gewebes halb (erhaltene in Schritt 5.4), dividiert durch das Trockengewicht dieses gleichen Gewebes halb (erhaltene in Schritt 7.1).</li>
	<li>Berechnen Sie dem Trockengewicht (in g) des Gewebes Hälfte in Formamid dividiert das Frischgewicht des Gewebes Hälfte davor war in Formamid (in Schritt 5.4 erhaltenen) durch Nässe gelegt: Trockengewicht Verhältnis für die spezifische Orgel von Interesse (gerechnet in Schritt 7.2).</li>
	<li>Berechnen Sie die korrigierte OD620 Werte. Beginnend mit der OD-620 Wert aus jeder experimentellen Brunnen von den 96-Well-Platte (mit Evans blau angereichertes Formamid aus jedem Gewebe, erwarb Schritt 6.3), subtrahieren die leeren gut OD620 Wert (der OD620 Mittelwert die zwei Brunnen mit reinen Formamid, zubereitet im Schritt 6.2, OD620 Werte in Schritt 6.3) von jedem experimentellen Wert.</li>
	<li>Berechnen Sie den Plasma Extravasation Wert durch Division der korrigierten OD620 (berechnet in Schritt 7.4) durch das Trockengewicht des Gewebes die Hälfte in Formamid (berechnet in Schritt 7.3). Die Einheiten der Plasma Extravasation werden OD620/g Trockengewicht.</li>
	<li>Daten analysieren und ausdrücklich als Mittelwert ± SEM statistisch vergleichen Gruppen von t-Test oder Einweg Varianzanalyse und Scheffé Multiple-Vergleichstest (lycofs01.lycoming.edu), je nach Bedarf.</li>
</ol>

<ol><li>Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pain%22%5BJournal%5D)">Substance P.</a> Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).</li>
<li>Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+neutral+endopeptidase+attenuates+substance+P-induced+plasma+extravasation+in+the+guinea+pig+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).</li>
<li>Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+and+epithelial+permeability+measurements+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals.</a> Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).</li>
<li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+assay+to+test+blood+vessel+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An in vivo assay to test blood vessel permeability.</a> J Vis Exp. (73), e50062(2013).</li>
<li>Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+Evans+Blue+dye+as+a+marker+of+albumin+clearance+in+murine+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury.</a> Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).</li>
<li>Figini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P+and+bradykinin+stimulate+plasma+extravasation+in+the+mouse+gastrointestinal+tract+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas.</a> Am J Physiol. 272 (4), Pt 1 785-793 (1997).</li>
<li>Awad, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+sphingosine+1-phosphate+1+receptor+activation+reduces+ischemia-reperfusion+injury+in+mouse+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).</li>
<li>Lu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+microvascular+permeability+and+blood+pressure+by+neutral+endopeptidase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase.</a> Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).</li>
<li>Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D'Orleans-Juste, P., Regoli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+urotensin-II+enhances+plasma+extravasation+in+specific+vascular+districts+in+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).</li>
<li>Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+blood-retinal+barrier+breakdown+quantitation+using+Evans+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).</li>
<li>Saria, A., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evans+blue+fluorescence%3A+quantitative+and+morphological+evaluation+of+vascular+permeability+in+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues.</a> J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).</li>
<li>Fricke, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+neurogenesis+-+the+role+of+the+blood+brain+barrier+in+an+experimental+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis - the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson's disease.</a> Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).</li>
<li>Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+and+quantitation+of+vascular+permeability+in+vivo%3A+implications+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery.</a> PLoS One. 7 (3), 33760(2012).</li>
<li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).</li>
<li>Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+vascular+permeability+and+lymphatic+drainage+using+labeled+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin.</a> Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).</li>
<li>Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase+dysbalance+in+pathology%3A+the+neprilysin+%28NEP%29+and+angiotensin-converting+enzyme+%28ACE%29+families%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%29%22%5BJournal%5D)">Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).</li>
<li>Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutral+endopeptidase+modulates+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Neutral endopeptidase modulates septic shock.</a> Ann N Y Acad Sci. 780, Mar 22 156-163 (1996).</li>
<li>Dempsey, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neprilysin+null+mice+develop+exaggerated+pulmonary+vascular+remodeling+in+response+to+chronic+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia.</a> Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).</li>
<li>Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neprilysin+regulates+pulmonary+artery+smooth+muscle+cell+phenotype+through+a+platelet-derived+growth+factor+receptor-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism.</a> Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).</li>
<li>Chu, P., Arber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin-section+detection+of+CD10+in+505+nonhematopoietic+neoplasms.+Frequent+expression+in+renal+cell+carcinoma+and+endometrial+stromal+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma.</a> Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).</li>
<li>Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD10+expression+in+urothelial+bladder+carcinomas%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Urol+Int%22%5BJournal%5D)">CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study.</a> Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).</li>
<li>Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+tumor+marker+for+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Urol%22%5BJournal%5D)">A new tumor marker for bladder cancer.</a> Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).</li>
<li>Wick, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+vascular+leak+in+neprilysin+transgenic+mice+with+complex+overexpression+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern.</a> Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).</li>
<li>Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+hypoxia+and+hyperthermia+on+the+permeability+of+the+blood-brain+barrier+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats.</a> J Appl Physiol. 107 (4), (1985) 1348-1356 (2009).</li>
<li>Scholzen, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutral+endopeptidase+terminates+substance+P-induced+inflammation+in+allergic+contact+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis.</a> J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wie oben besprochen, kann das Studium der Plasma Extravasation letztlich neue Erkenntnisse über die Ursachen des oder führen neue Wege zu hemmen oder Plasma Extravasation zu behandeln. Der erfolgreiche Einsatz des Protokolls Plasma Extravasation (oben), wurde mit Evans blau färben, im aktuellen Manuskript nachgewiesen. Obwohl die gezeigten Daten wieder die Hypothese, dass NEP kann das Gefäßsystem schützen gegen Plasma Paravasation, dies ist ein sekundäres Ziel derzeit mit dem primären Ziel, um ein optimiertes Protokoll vorzulegen, welche leicht im durchschnittlichen Labor kann die Zukunftsstudie von Plasma Extravasation. Das Protokoll berichtet hier konzentriert auf die Anpassungsfähigkeit an zukünftige Studien mit unterschiedlichen Zielen, Tiere, Organe und andere Bedingungen und ist besonders hilfreich, da dieses Protokoll ist einfach zu bedienen, zuverlässig, wirtschaftlich und berücksichtigt die allgemeinen Verfügbarkeit von gängigen Materialien, Reagenzien und kompetentes Personal. Es wird darauf hingewiesen, jedoch, dass dieses Protokoll eine ganze Menge Wiederholungen pro Gruppe von Tieren (8-12 Wiederholungen vorgeschlagen erfordert), statistisch valide Ergebnisse zu erzielen.
Es wurden zahlreiche Studien und Berichte über Versuche, vaskulären Permeabilität und Plasma Extravasation zu messen. Bei weitem die meisten dieser Berichte detailliert Permutationen von Methoden zusammen mit der Evans-blauer Farbstoff-Methode um zu untersuchen, Plasma Extravasation und vaskulären Permeabilität2,3,6,11, 12,13. Es wurden weniger Berichte der vaskulären Permeabilität Methoden die Evans blau in allen3,13,15,24zu integrieren, nicht; Diese anderen Methoden sind im Allgemeinen weniger zugänglich für das durchschnittliche Labor erfordern komplizierte Methoden, spezielle Ausrüstung und Personal, und sind in der Regel teuer.
Die Entwicklung des Protokolls Evans blau beteiligt, die Prüfung von vielen verschiedenen Permutationen und Modifikationen. Frühe Experimente konzentrierten sich auf Versuche, Evans blau durch die Maus Schweif Vene injizieren. Jedoch Rute Vene Injektionen war technisch anspruchsvoll und führte zu inkonsistenten Ergebnissen, erfordern die Einbeziehung der Halsschlagader Injektionen und terminal Operationstechniken, die oben beschriebenen. Viele Vorversuchen wurden auch fertig versucht, entsprechende Konzentrationen von Evans blau und Substanz p. finden Die genaue Höhe der Evans blau nicht erwies sich zwingend notwendig, solange es unter etwa 200 mg/kg (im Vergleich zu 50 mg/kg derzeit verwendet), aber die Menge der Substanz P in diesen Experimenten verwendeten wichtig war. Nach viel experimentieren, 1 Nmole/kg erwies sich die ideale Konzentration von exogen zusätzliche Substanz P, ein 1,5-facher Vergrößerung der Folge (und somit leichter messbare) Plasma Extravasation Werte. Auch festgestellt wurde, dass ausreichend Zeit für die Evans blau zu equilibrate gelassen werden muss (> 10 min). Durchblutung der Blutgefäße entfernen überschüssige Evans blau, nach Opfer der Maus aber vor der Orgel Isolierung erwies sich ein wesentlicher Bestandteil dieses Protokolls, im Gegensatz zu anderen Protokollen, die nicht diesen Perfusion Schritt4enthalten. Die Perfusat (geliefert von einem sanften Schwerkraft Gradienten) ist 50 mL einer pH 3,5-Lösung (die Bindung von Evans blau und Albumin fördert); Paraformaldehyd, weit verbreitet in vielen anderen Evans blau Protokolle6,10,25, entfällt in diesem Protokoll. Ein weiterer Faktor, der in diesem Protokoll aufgelöst wurde ist, dass der Farbstoff in Doxycyclin Chow verwendet die OD620 nm Messung von Evans blau in Geweben aus dem Verdauungstrakt Track stört. So war es notwendig, ungefärbten Doxycyclin Chow in den oben genannten Experimenten zu verwenden. Außerdem ist eine wichtige und nützliche Erkenntnis, dass fast jedes Organ der Maus zufrieden stellend isoliert und über dieses Protokoll untersucht.

Vaskuläre Leck in den Organen bezieht sich auf Paravasation, oder Austritt von Blutplasma durch Lücken in dem Endothel der produziert nach Kapillare Venolen in den Organen. Dieses Plasma Extravasation oder erhöhten vaskulären Permeabilität, die an irgendeiner Art von einer entzündlichen Reaktion entstehen, kann schwerwiegende Folgen haben. So ist es wichtig, dass dieses Phänomen, seine Ursachen, Modulatoren und folgen, sind studiert und verstanden, und ebenso, dass Ermittler gute tools und Protokolle, um sie zu studieren. Die endothelialen Lücken können über eine Reihe von Reizen hergestellt werden, aber in der Regel entstehen durch die Einwirkung von Peptid Neurotransmitter und/oder Tachykinins auf der gefäßendothelien. Die großen natürlich vorkommende Vermittler dieses Prozesses, führt zu erhöhten Plasma Paravasation, gehört die Undecapeptide Tachykinin Neuropeptid, Substanz P1.
Methoden zu untersuchen und vaskulären Permeabilität oder Plasma Paravasation, Messen, die die albuminbindung Eigenschaft von Evans blauen Farbstoff verwenden, sind entwickelt worden, und sind in der Regel bekannt für ihre Genauigkeit, Einfachheit, Wirtschaftlichkeit, Sicherheit und Möglichkeit, dass die Bestimmung des Plasma Extravasation aus mehreren Geweben auf einmal wenn ja gewünscht2,3,4,5,6,7,8,9 . Dieses Evans blau-Protokoll für die Beurteilung der Plasma Extravasation in den Organen von FVBN Mäusen verwendet alle diese, aber fügt einige wichtigen Änderungen, mit denen es in der Regel nützlich und anpassungsfähig für zukünftige Studien, mit durchschnittlichen Labor, das führt oder wird Führen Sie wichtige Studien der Faktoren im Zusammenhang mit Plasma Extravasation oder vaskulären Permeabilität. In diesem Protokoll ist Substanz P, die Mäuse bei 1 Nmol/kg, eingeführt, die die Extravasation des Plasmas durch 1.5-fold ergänzt. Dies erhöht die Empfindlichkeit des Protokolls, woraus leichter beobachtbar und erhältlich resultiert. Andere Faktoren, die Einfluss auf Durchlässigkeit, wie verschiedene andere Peptide, Chemikalien oder einige Formen von toxischen Verletzungen oder verwendet werden können von anderen Labors, wie gewünscht untersucht. Halsschlagader-Injektionen werden in diesem Protokoll systemisch, einzuführen Evans blau und Substanz P verwendet, die terminal Operation erfordert. Halsschlagader Injektionen5,7,10, sind auch nach Berücksichtigung der erforderlichen terminal Operationstechniken jedoch einfacher zu meistern und führen zur Produktion von konsistentere Ergebnisse als andere venöse Injektionen, Schwanz Vene Spritzen4,9. Obwohl es für Evans blau von Retro-Orbital venösen Sinus-Injektionen zu liefernden möglich sind, wurden keine Hinweise in der Literatur gefunden, dass diese Art der Lieferung von Evans blau verwenden. Das hohe Maß an Expertise und Praxis reproduzierbar beherrschen diese Technik stark begrenzt jedoch wie bei Heck-Vene-Injektionen, seine Verwendung für erfolgreiche Evans blau-Injektionen. Im Gegensatz dazu bietet die alternative Halsschlagader Injektionsverfahren wie in unserem Protokoll beschrieben eine technisch erhältlich Lösung. Ein entscheidender Verfahren zur Perfusion der Maus Venen durchgeführt nur, nachdem das Opfer der Evans blau durchblutet Maus, entfernt überschüssige Evans blau färben und hat in diesem Protokoll standardisiert worden. Zuvor beschriebene Methoden der Perfusion wurden sorgfältig geprüft und geändert, um das vorliegende Verfahren zu erhalten. Andere Modifikationen, die hier beschrieben sind alle optimierten, unkompliziert und kostengünstig.
Es gibt einige wichtigeren Einschränkungen der Evans-blauer Farbstoff-Methode. Geringer Empfindlichkeit, manchmal verbunden mit dieser Methode kann beispielsweise einige grobe pathologischen und histologischen Zusatzprüfung von Geweben aus Evans blau injiziert Tiere verhindern. Diese und andere Einschränkungen führten jedoch zur Entwicklung von alternativen Methoden und Modelle, die jedoch nach wie vor Evans blau verwenden. Die Messung von Evans blau durch Fluoreszenz (und nicht von Visual-Palette) Spektroskopie kann erhöhen die Empfindlichkeit der Methode. Darüber hinaus war Fluoreszenzmikroskopie Evans blau gefärbten Gewebe entwickelt, damit für die Beobachtung der vaskulären Leck in deutlicher Standorte11. Auch Ganzkörper-imaging und Scannen von einem lebenden Tier zuvor mit Evans blau12 ermöglicht die Untersuchung von Evans blau Konzentrationen in kontinuierlicher Weise injiziert, anstatt an einer gewählten Zeit Punkt des Experiments. Allerdings ist diese Methode erfordert die Verfügbarkeit von geeigneten bildgebenden Einrichtungen, und kann sehr teuer sein. Änderungen bei Evans blau und in einem in Vitro Modell durchgeführt, haben wie z. B. in einer Zelle Kultur oder Küken chorioallantoic Modell13 (CAM) auch beschrieben worden. Diese Modelle werden durch Fluoreszenz und intravitalen14 Mikroskopie, überwacht und erlauben die Quantifizierung der vaskulären Permeabilität Veränderungen im Laufe der Zeit aber können werfen Fragen nach präzise Modellierung der in Vivo -Bedingungen und möglicherweise auch teuer.
Es wurden andere Methoden entwickelt, um zu bestimmen und zu quantifizieren, vaskuläre Leck oder Durchlässigkeit, die nicht die Verwaltung von Evans blau beinhalten. Diese Methoden können eine geeignete fluoreszierendes Molekül (z. B. Albumin oder Fluorescein) oder ein isotopisch beschriftete oder anderweitig tagged Molekül, Tiere Leben beschäftigen (oder um Zell-Kultur oder chorioallantoic (CAM) Modelle13, gefolgt von nicht-invasive Bildgebung (PET-Scanning, MRI, intravitalen Mikroskopie, ganze Körper-Scan) oder durch invasive Bildgebung (Fluoreszenz-Mikroskopie)3,12,15. Obwohl diese Techniken eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen Evans blau Methoden anbieten können, haben sie auch Nachteile, die ihre erhebliche Komplexität, erforderliche Know-how, Ressourcen und hohen monetären Kosten beinhalten können.
Neprilysin16 (Peptidase Enzyms NEP, auch bekannt als CD10, MME oder Enkephalinase) ist vorgeschlagen worden, zu beteiligen, Hemmung der Plasma Paravasation, mindestens im Teil, durch die enzymatischen Metabolismus und Inaktivierung von endogene Substanz p. In Geweben, in denen die Zelle Oberfläche Peptidase NEP auftritt, kann es also eine Abschwächung der Wirkung der Substanz P, vermutlich durch die Peptidase Aktivität der NEP
Zunächst haben wir für die Substanz P-induzierte Plasma Extravasation Nutzung dieses modifizierte Evans blau-Protokoll mit FVBN Wildtyp (WT) und NEP-Knockout (KO)-Mäusen getestet. NEP Beteiligung an Substanz P-augmented Plasma Extravasation wurde aus diesen anfänglichen Studien vermutet, und wir beschreiben diese und weitere Experimente mit NEP Rolle im Plasma Extravasation. Im Mittelpunkt dieser Handschrift ist nicht NEP oder seiner Rolle im Plasma Paravasation, allerdings eher die Plasma Extravasation Experimente selbst. Die NEP-Ergebnisse sind repräsentativ für die Art der Ergebnisse, die durch Einsatz des modifizierten Protokolls erzielt werden können. Die Evans blau-Methode zur Messung der Plasma Extravasation wurden optimiert und verändert, wie im Detail unten für FVBN Mäuse beschrieben.

<table><tbody><tr><td>isoflurane</td><td>Vet One</td><td>200-070</td><td>inhaled anesthetic</td></tr><tr><td>ketamine</td><td>Vet One</td><td>200-055</td><td>injectable anesthetic</td></tr><tr><td>xylazine</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td><td>injectable anesthetic</td></tr><tr><td>syringes (10,3 &amp;amp; 1 cc)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604, 309657, 309659</td><td></td></tr><tr><td>needles (20G1,23G1 &amp;amp; 26G1/2)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305178, 305193, 305111</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane induction chamber</td><td>VetEquip</td><td>941443</td><td>1 Liter</td></tr><tr><td>nosecone breathing circuits&amp;nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>RC2</td><td>Rodent Circuit Controller 2</td></tr><tr><td>oxygen tank</td><td>Airgas</td><td>UN 1072</td><td>100% medical</td></tr><tr><td>heating pad</td><td>CWE Inc.</td><td>TC-1000</td><td>temperature controller</td></tr><tr><td>rectal temperature probe</td><td>CWE Inc.</td><td>10-09012</td><td>mouse</td></tr><tr><td>balance (for rodents)</td><td>Ohaus</td><td>CS 2000</td><td></td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>15000-00</td><td>Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11151-10</td><td>Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels)</td></tr><tr><td>surgical tools-hemostats</td><td>Fine Science tools</td><td>13009-12</td><td>Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue)</td></tr><tr><td>surgical tools -suture drivers</td><td>Fine Science tools</td><td>12502-12</td><td>Olsen-Hegar suture drivers (suturing)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11627-12</td><td>Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat)</td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14110-15</td><td>Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>18025-10</td><td>suture tying forceps (used for Millar cath)</td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14078-10</td><td>Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11254-20</td><td>Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection)</td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14082-09</td><td>Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11051-10</td><td>10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11251-35</td><td>Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels)</td></tr><tr><td>surgical tools-retractors</td><td>Fine Science tools</td><td>17012-11</td><td>Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11294-00</td><td>Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11297-00</td><td>Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection)</td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14058-11</td><td>tough cut iris scissors (mouse dissection, bones)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11009-13</td><td>serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat)</td></tr><tr><td>surgical tools-hemostats</td><td>Fine Science tools</td><td>13003-10</td><td>Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11006-12</td><td>Adson serrated forceps (tissue grasping)</td></tr><tr><td>clippers</td><td>Oster</td><td>A5</td><td></td></tr><tr><td>tape</td><td>Fisherbrand</td><td>159015G</td><td></td></tr><tr><td>artificial tear ointment</td><td>Akorn Inc</td><td>13985-600-03</td><td></td></tr><tr><td>lidocaine</td><td>Hospira</td><td>0409-4277-01</td><td>2% injectable</td></tr><tr><td>polyvinyl catheters</td><td>Tygon</td><td>PV-1</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Substance P</td><td>Bachem&amp;nbsp;</td><td>H-1890</td><td></td></tr><tr><td>heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25201-400-10</td><td>1000 U/ml</td></tr><tr><td>saline solution</td><td>Hospira</td><td>0409-7138-09</td><td>0.9% sodium chloride</td></tr><tr><td>phenobarbital&amp;nbsp;</td><td>Vortech</td><td>0298-9373-68</td><td></td></tr><tr><td>sodium citrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-50TAB&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes for blotting</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47670</td><td></td></tr><tr><td>microbalance</td><td>Denver Instrument</td><td>APX-60</td><td></td></tr><tr><td>microfuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-534</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene 96 well plate</td><td>Becton Dickenson</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>absorbance plate reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>polyacrylamide gels</td><td>Bio-Rad</td><td>3450014&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>protein molecular weight standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Protran supported nitrocellulose</td><td>Amersham (GE)</td><td>10600015</td><td></td></tr><tr><td>gel box</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-1379</td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>primary NEP polyclonal antibody&amp;nbsp;</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>AF1182</td><td></td></tr><tr><td>doxycycline chow</td><td>Teklad (HARLAN)</td><td>TD.130750&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FVB/NJ wild type mice</td><td>Jackson</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>secondary antibody (goat anti-rabbit)</td><td>ZyMed</td><td>81-6120</td><td></td></tr><tr><td>ECL solution-Western Lightening Plus</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>film</td><td>Pierce</td><td>34091</td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse

Vaskuläre Leck oder Plasma Paravasation, hat eine Reihe von Ursachen, und möglicherweise eine schwerwiegende Folge oder Symptom einer entzündlichen Reaktion. Diese Studie kann letztlich führen zu neue Erkenntnisse über die Ursachen des oder neue Wege zu hemmen oder Plasma Extravasation zu behandeln. Es ist wichtig, dass Forscher die richtigen Werkzeuge, einschließlich der besten Methoden zur Verfügung, für das Studium Plasma Extravasation. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll mit der Evans blauen Farbstoff Methode, für die Beurteilung der Plasma Extravasation in den Organen der FVBN Mäuse. Dieses Protokoll ist absichtlich einfach, so groß wie möglich, aber bietet hohe Datenqualität. Evans blauen Farbstoff wurde gewählt, vor allem weil es einfach für den durchschnittlichen Labor zu verwenden. Wir haben dieses Protokoll verwendet, Hinweise und Unterstützung für die Hypothese, dass das Enzym Neprilysin das Gefäßsystem gegen Plasma Extravasation schützen kann. Jedoch kann dieses Protokoll experimentell eingesetzt und leicht abgestimmt für den Einsatz in anderen Stämme von Mäusen oder in anderen Arten, in vielen verschiedenen Organen oder Geweben, für Studien, die anderen Faktoren verbunden, die wichtig zu verstehen sein können, zu verhindern oder zu behandeln sind Plasma Extravasation. Dieses Protokoll wurde umfassend optimiert und modifiziert von bestehenden Protokolle und vereint Zuverlässigkeit, Benutzerfreundlichkeit, Wirtschaft, und allgemeine Verfügbarkeit von Material und Ausrüstung, machen dieses Protokoll überlegen für die durchschnittliche Labor in verwenden Quantifizierung der Plasma Extravasation von Organen.

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An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

In diesem Artikel ist eine kostengünstige, optimierte und einfache Protokoll beschrieben die verwendet die Evans-blauer Farbstoff-Methode zur Bewertung von Plasma Extravasation in den Organen der FVBN Mäuse, die für den Einsatz in anderen Sorten, Arten, und andere Organe oder Gewebe angepasst werden kann.

Eine optimierte Evans blau Protokoll vaskulären Leck in der Maus bewerten

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

an-optimized-evans-blue-protocol-to-assess-vascular-leak-in-the-mouse

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

26.4K Aufrufe.  University of Colorado Denver. In diesem Artikel ist eine kostengünstige, optimierte und einfache Protokoll beschrieben die verwendet die Evans-blauer Farbstoff-Methode zur Bewertung von Plasma Extravasation in den Organen der FVBN Mäuse, die für den Einsatz in anderen Sorten, Arten, und andere Organe oder Gewebe angepasst werden kann.

Serie: An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Rat Modell der Blut-Hirn-Schranke Störung zu Neurovascular Therapeutics Gezielte zulassen

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Forschung

Medizin

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

Ein<em&gt; In vivo</em&gt; Assay Blood Vessel Durchlässigkeitsprüfung

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. Exposure to an allergen in a sensitized individual can result in clinical symptoms that vary from minor erythema to life threatening anaphylaxis. In the laboratory, various animal models have been developed to understand the mechanisms driving allergic responses. Herein, we describe a detailed method for measuring changes in vascular permeability to quantify localized allergic responses. The local anaphylaxis assay was first reported in the 1920s, and has been adapted from the technique published by Kojima et al. in 20071. In this assay, mice sensitized to OVA are challenged in the left ear with vehicle and in the right ear with OVA. This is followed by an intravenous injection of Evans Blue dye. Ten min after injecting Evans Blue, the animal is euthanized and the dye that has extravasated into the ears is extracted overnight in formamide. The absorbance of the extracted dye is then quantified with a spectrophotometer. This method reliably results in a visual and quantifiable manifestation of a local allergic response.

Allergic responses, characterized by the activation of mast cells and basophils, are driven by the cross-linking of IgE and release of proinflammatory mediators. A quantitative assessment of allergic responses can be achieved by using Evans Blue dye to monitor changes in vascular permeability after allergen challenge.

Mess Lokale Anaphylaxie bei Mäusen

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Immunologie und Infektion

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Verwendung Adeno-assoziierte Virus als Werkzeug Retinal Barrieren in Disease Study

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

This protocol describes the induction of an ischemia-reperfusion (IR) model on mouse ear skin using magnet clamping. Using a custom-built intravital imaging model, we study in vivo inflammatory responses post-reperfusion. The rationale behind the development of this technique is to extend the understanding of how leukocytes respond to skin IR injury.

Induzierende Ischemia-Reperfusionsschaden in der Maus-Ohr-Haut für intravital Multiphotonenionisation Imaging von Immunantworten

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke involves middle cerebral artery occlusion (MCAO). Infarct zone, brain edema and blood-brain barrier (BBB) breakdown are measured as parameters that reflect the extent of brain injury after MCAO. A significant limitation to this method is that these measurements are normally obtained in different rat brain samples, leading to ethical and financial burdens due to the large number of rats that need to be euthanized for an appropriate sample size. Here we present a method to accurately assess brain injury following MCAO by measuring infarct zone, brain edema and BBB permeability in the same set of rat brains. This novel technique provides a more efficient way to evaluate the pathophysiology of stroke.

This protocol describes a novel technique of measuring the three most important parameters of ischemic brain injury on the same set of rodent brain samples. Using only one brain sample is highly advantageous in terms of ethical and economic costs.

Messung des Abbaus von Hirnödem nach dem Schlaganfall, Infarktzone und Blut-Hirn-Barrierenabbau in einem einzigen Satz von Nagetier-Gehirnproben

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

Neurowissenschaften

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

Im lebenden Organismus Gefäßverletzungsanzeigen in der Netzhaut der Maus zur Förderung der Reproduzierbarkeit

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

<meta charset="utf8"></head><body>Ein Fluoreszenzassay zur Beurteilung der Permeabilität einer kardialen mikrovaskulären Endothelbarriere in einem Rattenmodell für Ischämie/Reperfusion

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Ein Fluoreszenzassay zur Beurteilung der Permeabilität einer kardialen mikrovaskulären Endothelbarriere in einem Rattenmodell für Ischämie/Reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby the permeability of the endothelium to blood cells, plasma macromolecules, and water can be adapted according to the physiological need. In certain diseases, cytokines and growth factors are released that target the endothelial barrier to transiently increase vascular permeability; however, their prolonged presence may cause chronic vascular hyperpermeability and thereby tissue-damaging edema. The Miles assay is an in vivo technique that allows researchers to study vascular hyperpermeability through the proxy measurement of vascular leakage. Here, we provide a detailed protocol on how to perform this procedure in the mouse, which is the most widely used model organism to study mammalian physiology and pathology. The procedure involves the intravenous injection of Evans blue dye to label the circulating albumin followed by multiple intradermal injections of permeability-inducing agents and vehicle control solutions into opposing flanks of the mouse. Consequently, Evans blue dye gradually leaks into the dermis, where it accumulates and can be extracted for quantification as leakage induced by the permeability-inducing agent relative to the vehicle. The Miles assay can be performed in wild type or genetically modified mouse models and may be combined with drug administration to study molecular mechanisms that regulate vascular permeability and identify agents/targets capable of inducing or blocking hyperpermeability.

Here, we present a protocol to measure the vascular leakage induced by intradermal administration of permeability promoting agents into the murine skin. This technique can be used to determine the ability of molecules to promote or inhibit vascular leakage or to study the molecular mechanisms that regulate vascular permeability.

Bewertung von vaskulären Hyperpermeability-induzierende Wirkstoffe in der Haut mit dem Meilen-Assay

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

Eine optimierte Evans blau Protokoll vaskulären Leck in der Maus bewerten

Zusammenfassung

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