Los autores desean agradecer a Andy Poczobutt y Dr. Jori Leszczynski por su valiosa ayuda y ediciones a este manuscrito.  Apoyado por subvenciones recibidas desde el corazón nacional, pulmón y Blood Institute (NHLBI to1 HL078929, PPG HL014985 y HL095439 RO3) y el Departamento de Veterans Affairs (de mérito).

Se siguieron todas las directrices internacionales, nacionales o institucionales aplicables para el uso y cuidado de animales (ratones) en los experimentos descritos en este manuscrito.
Este método utiliza ratones adultos FVBN, edad 16-20 semanas, encontrado para ser óptimo para los fines de este estudio. Día 1 incluye pasos 1-5 y el día 2 incluye los pasos 6-7 (figura 1).
1. preparación de equipo
<ol><li>Garantizar un suministro adecuado de jeringas estériles, desechables y agujas, si ketamina/xilacina se utiliza como anestésico (como se recomienda). Si isoflurano se utiliza como anestésico, verifique el tanque de oxígeno y el nivel de líquido de isoflurano para asegurarse de que hay un suministro adecuado para el experimento antes de comenzar. Además, montar la nariz respiración circuitos y fije a la caja de la inducción; Coloque latas de carbón nuevo a los circuitos de respiración. Preparar el cuadro de inducción activando el oxígeno y comprobar que la segunda etapa Lee aproximadamente 50 psi.</li>
	<li>Encienda el cojín de calentamiento a 37 ° C.</li>
	<li>Preparar la sonda de temperatura rectal para la cirugía.</li>
</ol>2. ratón preparación
Este paso incluye anestesia, depilación y posicionamiento (adultos FVBN ratones-edad 16-20 semanas).
<ol><li>Pesan los ratones y registrar los pesos.</li>
	<li>Anestesiar los ratones.<ol>
<li>Administrar ketamina y xilacina IP (80-100 mg/kg y 7.5-16 mg/kg, respectivamente). Sin embargo, se recomienda comenzar con dosis bajas de ketamina y xilacina (alrededor de 30 mg/kg y 6 mg/kg, respectivamente).</li>
		<li>Mantener la anestesia con aproximadamente 0,1 - 0,25 veces inicial de dosis de ketamina/xilacina a lo largo de la cirugía. Ketamina y xilacina eran el agente anestésico de elección en este estudio en particular, como se observaron más reproducibilidad y capacidad de supervivencia. El agente anestésico de elección en otros estudios se puede encontrar a ser diferente.  Si se utiliza isoflurano, ponga el ratón en una cámara de inducción y encienda isoflurano al 5% hasta que el ratón pierde el sentido completo. Luego use una nariz nasal de isoflurane 1.5-2.5% en el resto del procedimiento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Controlar los ratones cada 2-3 min por pellizco del dedo del pie para verificar la adecuada profundidad de la anestesia.</li>
	<li>Afeite la zona ventral del cuello del ratón.</li>
	<li>Coloque el ratón en una posición supina en la almohadilla de precalentado. Asegure las patas y los pies del ratón a la superficie quirúrgica con cinta.</li>
	<li>Coloque el ungüento de lágrima artificial en los ojos para evitar que se sequen durante la cirugía.</li>
</ol>3. quirúrgicos detalles
<ol><li>Realice una incisión de 1 cm en el cuello ventral derecho sobre la vena yugular.</li>
	<li>Aplicar una o dos gotas de lidocaína (1-2%) en el área de incisión para el tratamiento del dolor y promover la vasodilatación. Esperar 2 minutos para lidocaína surta efecto.</li>
	<li>Denunciar y aislar la vena yugular interna derecha por disección Roma. Atar la vena con la sutura 4-0 y retraer con suavidad el extremo rostral de la nave con una pinza hemostática. Orificio, con unas tijeras finas, unos 3 mm inferior o caudal a la corbata, aproximadamente a la mitad el diámetro de la vena.</li>
	<li>Un catéter de polivinilo PV-1 1,5 cm desde el extremo de la marca introduzca en la vena yugular a través del orificio usando un dilatador de vasos y el catéter hacia el extremo caudal de la nave, aproximadamente 1,5 cm del hilo de rosca.</li>
	<li>Atar el catéter firmemente dentro de la parte caudal de la embarcación (por debajo de la cut), con seda 4-0. Ate la parte rostral de la embarcación hacia el exterior de la sonda con los extremos sueltos de la sutura que se utiliza para atar la vena yugular rostral, en el paso 3.3.</li>
	<li>Virada la piel libremente de nuevo juntos alrededor del catéter con seda 4-0 para ayudar a prevenir pérdida de calor corporal y la desecación de los tejidos.</li>
	<li>Conectar el catéter a una jeringa con solución salina heparinizada (10 U/mL) y enjuague el catéter.</li>
</ol>4. inyecciones
<ol><li>Inyecte la solución de azul de Evans (50 μL de una solución de 30 mg/mL en solución salina normal, unheparinized 0.9%, o aproximadamente 50 mg/kg) en el catéter de la vena yugular, seguido de un pequeño volumen de solución salina heparinizada para purgar la línea.</li>
	<li>2 minutos más tarde, inyectar sustancia P (100 μL de una solución 0,3 μM en 0,9% solución salina normal, unheparinized o 1 nmol/kg), seguida de un pequeño volumen de solución salina heparinizada para purgar la línea. Sustancia P aumenta la extravasación de proteínas plasmáticas a través de la capa endotelial; en este protocolo, habitualmente induce un aumento de los valores de extravasación de plasma de aproximadamente 1.5-fold, cual plasma extravasación más fácil de medir.</li>
	<li>Esperar 18 minutos después de inyectar la sustancia P. Durante este tiempo, el tinte de azul de Evans se equilibre y circular.</li>
	<li>Terminar el experimento 18 minutos después de la inyección de sustancia P (20 min después de la inyección de azul de Evans) sacrificando el ratón con la dislocación cervical. Es probable que el ratón puede ser directamente cervical dislocada, sin primero dar una sobredosis de anestésico, como el ratón es probablemente todavía bien anestesiado de la cirugía. Sin embargo, si es necesario, una sobredosis de anestésicos ketamina/xilacina, isoflurano o pentobarbital puede ser dado, seguido por dislocación cervical.</li>
</ol>5. aislamiento de órganos
<ol><li>Abrir la cavidad torácica del ratón y gravedad-perfusión (desde una altura de unos 51 cm o 20") el corazón y los vasos sanguíneos con 50 mL de citrato de sodio 50 mM, pH 3.5. pH 3,5 probablemente conserva a encuadernación azul de Evans a la albúmina.</li>
	<li>Suprimir los órganos relevantes 1-5 (tejidos) con un bisturí de disección (e.g. vejiga urinaria, riñón, estómago, hígado, páncreas, proximal o distal colon, íleon, duodeno, piel del flanco, orejas, cola, corazón y/o los pulmones) y quitar cualquier contenido residual, si presente.</li>
	<li>Enjuague los órganos en temperatura ambiente (RT) con tampón fosfato salino (PBS; 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, 8.0 g de NaCl y 0,20 g de KCl en 1 L, pH 7,4).</li>
	<li>Seque los órganos con tejido, corte cada órgano por la mitad y pesan cada mitad (mojado pesos, en g).</li>
	<li>Seque uno mitad del tejido en un horno de secado a 150 ° C, en florete, durante 48 h.</li>
	<li>Coloque los otros tejidos del tubo la mitad en un volumen constante (200 μL) de formamida en una microcentrífuga durante 48 h (y hasta 72 h) para extraer el azul de Evans.</li>
</ol>6. medición del tejido OD
<ol><li>Saque 50 μl de formamida infundido de azul de Evans (después de la incubación de 48-72 h RT) el tubo de microcentrífuga y el lugar en un pozo de una placa de poliestireno de 96 pocillos. Tenga cuidado de no transferir piezas de tejido junto con la formamida.</li>
	<li>Depositar 50 μl de formamida nueva, pura en cada uno de los dos pozos vacíos de la placa de 96 pocillos para los espacios en blanco.</li>
	<li>Mida y registre la OD620 de cada pocillo de la placa de 96 pocillos en un lector de absorbancia. 620 nm es la absorbancia máxima de azul de Evans.</li>
</ol>7. cálculo de la extravasación de Plasma
<ol><li>Pesa el tejido seco mitad que ha estado en el horno durante 48 h.</li>
	<li>Calcular la proporción de peso seco/peso húmedo para el órgano específico de interés de cada ratón individual, comenzando con el peso húmedo de este tejido medio (obtenido en paso 5.4), dividido por el peso seco de este mismo tejido medio (obtenido en paso 7.1).</li>
	<li>Calcular el peso seco (en gramos) de tejido medio en formamida al dividir el peso mojado del tejido antes de que la mitad se colocó en formamida (obtenido en el paso 5.4) por la humedad: proporción de peso seco para el órgano específico de interés (calculado en el paso 7.2).</li>
	<li>Calcular los valores corregidos de620 OD. A partir de la OD620 valor de cada bien experimental de la placa de 96 pocillos (contiene formamida infundido de azul de Evans de cada tejido, obtenido en el paso 6.3), reste el espacio en blanco bien OD620 valor (la media OD620 de los dos pozos que contienen formamida puro, preparado en el paso 6.2, OD a620 los valores obtenidos en el paso 6.3) de cada valor experimental.</li>
	<li>Calcular el valor de extravasación de plasma por la corregida OD620 (calculado en paso 7.4) dividiendo el peso seco del tejido mitad en formamida (calculado en paso 7.3). Las unidades de la extravasación de plasma será OD620/g peso seco.</li>
	<li>Analizar los datos y expresar como la media ± SEM. estadísticamente comparar grupos por prueba t o análisis unidireccional de varianza y prueba de comparación múltiple de Scheffé (lycofs01.lycoming.edu), según corresponda.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P.">Substance P.</a> Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).</li><li>Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+neutral+endopeptidase+attenuates+substance+P-induced+plasma+extravasation+in+the+guinea+pig+skin.">Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).</li><li>Szabo, A., Menger, M. 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Los autores no tienen nada que revelar.

Como hemos comentado anteriormente, el estudio de la extravasación de plasma en última instancia puede llevar a nuevos conocimientos sobre las causas de o nuevas maneras de inhibir o tratar la extravasación de plasma. El uso acertado del Protocolo de extravasación de plasma (arriba), utilizando medio de contraste azul de Evans, se ha demostrado en el manuscrito actual. Aunque los datos se muestra de nuevo la hipótesis de que la NEP puede proteger la vasculatura contra la extravasación de plasma, este es un objetivo...

Fuga vascular en los órganos se refiere a extravasación o salida de plasma sanguíneo a través de brechas en el endotelio de post vénulas capilares en los órganos. Esta extravasación de plasma o el aumento de la permeabilidad vascular, que puede surgir de algún tipo de respuesta inflamatoria, puede tener graves consecuencias. Por lo tanto, es importante que este fenómeno, sus causas, moduladores y consecuencias, están estudiadas y entendidas, y además, que los investigadores tienen buenas herramientas y protocolos con los que estudiar. Las brechas endoteliales pueden ser producidas a través de una serie de estímulos, pero generalmente se producen por la acción de neurotransmisores péptido o taquicininas en el endothelia. Uno de los principales mediadores naturales de este proceso, que resulta en extravasación de plasma mayor, es el undecapeptide taquiquinina neuropéptido sustancia P1.
Métodos para investigar y medir la permeabilidad vascular o extravasación de plasma, que utilizan la propiedad de unión a albúmina del colorante azul de Evans, se han desarrollado y generalmente son conocidos por su precisión, sencillez, economía, seguridad y capacidad de permitir que el determinación de la extravasación de plasma de varios tejidos a la vez, si es así deseado2,3,4,5,6,7,8,9 . Este protocolo de azul de Evans para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN utiliza todos estos, pero añade algunas modificaciones importantes que lo hacen generalmente útil y adaptable para estudios futuros, el laboratorio promedio lleva a cabo o que llevar a cabo importantes estudios de factores asociados a la extravasación de plasma o en la permeabilidad vascular. En este protocolo, sustancia P es introducida a los ratones a 1 nmol/kg, lo que aumenta la extravasación de plasma por 1.5. Esto aumenta la sensibilidad del Protocolo, dando por resultado más fácilmente observables y obtener resultados. Otros factores que afectan a la permeabilidad, como varios otros péptidos, productos químicos o algunas formas de lesión tóxica, pueden ser utilizados o estudiados por otros laboratorios, como se desee. En este protocolo para introducir el azul de Evans y sustancia P sistémica, que requiere cirugía terminal se utilizan inyecciones de vena yugular. Sin embargo, las inyecciones de vena yugular5,7,10, incluso después de la consideración de las necesarias técnicas quirúrgicas terminal, son fáciles de dominar y conducir a la producción de resultados más consistentes que otra las inyecciones venosas, incluyendo cola vena inyecciones4,9. Aunque es posible de azul de Evans ser entregados por las inyecciones del seno venoso orbital retro, no hay referencias en la literatura han encontrado que utilizar este método de entrega de azul de Evans. Sin embargo, en cuanto a las inyecciones de vena de la cola, el alto grado de conocimientos y práctica reproducible dominar esta técnica muy limita su uso para inyección de azul de Evans exitosa. En contraste, el método de inyección de la vena yugular alternativos como se describe en nuestro protocolo, ofrece una solución técnicamente obtenible. Un procedimiento crucial para la perfusión de las venas del ratón, realizado justo después del sacrificio del ratón de perfusión de azul de Evans, elimina el exceso de tinte de azul de Evans y se ha estandarizado en el presente Protocolo. Métodos anteriormente descritos de perfusión han sido cuidadosamente examinados y modificado para conocer el presente procedimiento. Otras modificaciones que se describen aquí son todo optimizado, simple y de bajo costo.
Existen algunas limitaciones importantes del método de colorante azul de Evans. Por ejemplo, baja sensibilidad a veces asociado con este método puede prevenir algunos adicional examen macroscópico patológico e histológico de los tejidos de los animales de inyección de azul de Evans. Sin embargo, estas y otras limitaciones han llevado al desarrollo de métodos alternativos y modelos que, sin embargo, todavía utilizan el azul de Evans. La medición de azul de Evans por fluorescencia (en lugar de alcance visual) espectroscopia puede aumentar la sensibilidad del método. Además, microscopía de fluorescencia de los tejidos teñidos de azul de Evans fue desarrollado para permitir la observación de fuga vascular en más distintas ubicaciones11. Además, todo el cuerpo la proyección de imagen y escaneo de un animal vivo previamente inyectaron con Evans azul12 permite la investigación de las concentraciones de azul de Evans en una manera continua, en lugar de en uno elegido tiempo punto específico del experimento. Sin embargo, este método requiere la disponibilidad de instalaciones adecuadas de imagen y puede ser muy costoso. Modificaciones que Evans blue y realizada en un tipo de in vitro del modelo, como en una celda de cultura o chick corioalantoideas modelo13 (CAM) también se han descrito. Estos modelos son monitoreados por fluorescencia y microscopia intravital14 y permiten la cuantificación de cambios en la permeabilidad vascular con el tiempo, pero pueden plantear preguntas sobre modelado preciso de condiciones en vivo y también puede caro.
Ha habido otros métodos desarrollados para determinar y cuantificar fuga vascular o permeabilidad, que implica la administración de azul de Evans. Estos métodos pueden emplear una adecuada molécula fluorescente (como la albúmina o fluoresceína) o una molécula etiquetada isotópicamente etiquetada o no, a los animales vivos (o para la célula cultura o corioalantoideas (CAM) modelos13, seguido de no invasivo proyección de imagen (PET-TAC, resonancia magnética, microscopía intravital, escaneo de cuerpo entero) o por proyección de imagen invasivas (microscopia fluorescente)3,12,15. Aunque estas técnicas pueden ofrecer a una serie de ventajas sobre otros Evans métodos azul, también tienen desventajas, que pueden incluir su considerable complejidad, conocimientos necesarios, recursos y altos costos monetarios.
Neprilysin16 (la peptidasa enzima NEP, también conocido como CD10, MME o Enkephalinase) se ha sugerido para ser implicados en la inhibición de extravasación de plasma, al menos en parte, a través del metabolismo enzimático y la inactivación de sustancias endógenas Así, en los tejidos en que ocurre la peptidasa superficie celular NEP, puede haber una atenuación del efecto de la sustancia P, probablemente por la actividad de la peptidasa de NEP.
Al principio, probamos para la extravasación de plasma inducido por la sustancia P utilizando este protocolo modificado de Evans blue, con FVBN tipo salvaje (WT) y ratones knockout (KO) de NEP. Participación de la NEP en extravasación de plasma aumentada de sustancia P fue sospechada de estos estudios iniciales, y describimos a estos y otros experimentos papel de NEP participación en extravasación de plasma. Sin embargo, el foco de este manuscrito no es NEP o su papel en la extravasación de plasma, pero más bien la extravasación de plasma experimentos ellos mismos. Los resultados de la NEP son representante de la clase de resultados que pueden obtenerse mediante el uso de este protocolo modificado. El método de azul de Evans para medir la extravasación de plasma ha sido optimizado y modificado, como se describe en detalle a continuación para los ratones FVBN.

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	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">isoflurane</td>
			<td style="width:167px;">Vet One</td>
			<td style="width:119px;">200-070</td>
			<td style="width:185px;">inhaled anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ketamine</td>
			<td style="width:167px;">Vet One</td>
			<td style="width:119px;">200-055</td>
			<td>injectable anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">xylazine</td>
			<td style="width:167px;">Lloyd Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">139-236</td>
			<td>injectable anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">syringes (10,3 &#38; 1 cc)</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309604, 309657, 309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">needles (20G1,23G1 &#38; 26G1/2)</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">305178, 305193, 305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">isoflurane induction chamber</td>
			<td style="width:167px;">VetEquip</td>
			<td style="width:119px;">941443</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nosecone breathing circuits&#160;</td>
			<td style="width:167px;">VetEquip</td>
			<td style="width:119px;">RC2</td>
			<td>Rodent Circuit Controller 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">oxygen tank</td>
			<td style="width:167px;">Airgas</td>
			<td style="width:119px;">UN 1072</td>
			<td>100% medical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">heating pad</td>
			<td style="width:167px;">CWE Inc.</td>
			<td style="width:119px;">TC-1000</td>
			<td>temperature controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">rectal temperature probe</td>
			<td style="width:167px;">CWE Inc.</td>
			<td>10-09012</td>
			<td>mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">balance (for rodents)</td>
			<td style="width:167px;">Ohaus</td>
			<td style="width:119px;">CS 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">surgical tools-scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:185px;">Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels)&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11151-10</td>
			<td style="width:185px;">Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">surgical tools-hemostats</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>13009-12</td>
			<td style="width:185px;">Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools -suture drivers</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>12502-12</td>
			<td style="width:185px;">Olsen-Hegar suture drivers (suturing)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11627-12</td>
			<td style="width:185px;">Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">surgical tools-scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td style="width:185px;">Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>18025-10</td>
			<td style="width:185px;">suture tying forceps (used for Millar cath)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>14078-10</td>
			<td style="width:185px;">Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td style="width:185px;">Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td style="width:185px;">Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td style="width:185px;">10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td style="width:185px;">Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-retractors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>17012-11</td>
			<td style="width:185px;">Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11294-00</td>
			<td style="width:185px;">Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11297-00</td>
			<td style="width:185px;">Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td style="width:185px;">tough cut iris scissors (mouse dissection, bones)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td style="width:185px;">serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-hemostats</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>13003-10</td>
			<td style="width:185px;">Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td style="width:185px;">Adson serrated forceps (tissue grasping)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">clippers</td>
			<td style="width:167px;">Oster</td>
			<td style="width:119px;">A5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">tape</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">159015G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">artificial tear ointment</td>
			<td style="width:167px;">Akorn Inc</td>
			<td style="width:119px;">13985-600-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">lidocaine</td>
			<td style="width:167px;">Hospira</td>
			<td style="width:119px;">0409-4277-01</td>
			<td>2% injectable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polyvinyl catheters</td>
			<td style="width:167px;">Tygon</td>
			<td style="width:119px;">PV-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Evans blue</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Substance P</td>
			<td style="width:167px;">Bachem&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H-1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">heparin</td>
			<td style="width:167px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">25201-400-10</td>
			<td>1000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">saline solution</td>
			<td style="width:167px;">Hospira</td>
			<td style="width:119px;">0409-7138-09</td>
			<td>0.9% sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">phenobarbital&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Vortech</td>
			<td style="width:119px;">0298-9373-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium citrate</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP327-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4417-50TAB&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kimwipes for blotting</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">formamide</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">47670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microbalance</td>
			<td style="width:167px;">Denver Instrument</td>
			<td style="width:119px;">APX-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microfuge tubes</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polystyrene 96 well plate</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickenson</td>
			<td style="width:119px;">351172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">absorbance plate reader</td>
			<td style="width:167px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polyacrylamide gels</td>
			<td style="width:167px;">Bio-Rad</td>
			<td>3450014&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">protein molecular weight standard</td>
			<td style="width:167px;">Bio-Rad</td>
			<td>1610374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protran supported nitrocellulose</td>
			<td style="width:167px;">Amersham (GE)</td>
			<td style="width:119px;">10600015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gel box</td>
			<td style="width:167px;">Bio-Rad</td>
			<td>1658005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween20</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">primary NEP polyclonal antibody&#160;</td>
			<td style="width:167px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">AF1182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">doxycycline chow</td>
			<td style="width:167px;">Teklad (HARLAN)</td>
			<td>TD.130750&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FVB/NJ wild type mice</td>
			<td style="width:167px;">Jackson</td>
			<td style="width:119px;">001800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">secondary antibody (goat anti-rabbit)</td>
			<td style="width:167px;">ZyMed</td>
			<td style="width:119px;">81-6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ECL solution-Western Lightening Plus</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEL104001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">film</td>
			<td style="width:167px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">34091</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse

Fuga vascular y extravasación de plasma, tiene un número de causas y puede ser una grave consecuencia o síntoma de una respuesta inflamatoria. Este estudio en última instancia puede conducir a nuevos conocimientos sobre las causas de o nuevas maneras de inhibir o tratar la extravasación de plasma. Es importante que los investigadores tienen las herramientas adecuadas, incluyendo los mejores métodos disponibles para el estudio de la extravasación de plasma. En este artículo, se describe un protocolo, utilizando el método de colorante azul de Evans, para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN. Este protocolo es intencionadamente simple, a tan grande un grado de lo posible, pero proporciona datos de alta calidad. Colorante azul de Evans ha sido elegido principalmente porque es fácil para el laboratorio de media utilizar. Hemos utilizado este protocolo para proporcionar evidencia y apoyo a la hipótesis de que la neprilysin de enzima puede proteger la vasculatura contra la extravasación de plasma. Sin embargo, este protocolo puede usar experimentalmente y fácilmente adaptado para el uso en otras cepas de ratones o en otras especies, en muchos diversos órganos o tejidos para estudios que pueden involucrar otros factores que son importantes para entender, prevenir o tratar la extravasación de plasma. Este protocolo ha sido ampliamente optimizado y modificado de los protocolos existentes y combina fiabilidad, facilidad de uso, economía y disponibilidad general de materiales y equipos, hacer superior para el laboratorio de media utilizar en el presente Protocolo cuantificación de la extravasación de plasma de órganos.

En la figura 1, se muestra un esquema del procedimiento, que se ha encontrado en los valores más confiable y consistente de extravasación de plasma inducido por la sustancia P de órganos de los ratones FVBN. Este procedimiento toma generalmente dos días de trabajo, separados por al menos 48 h de tiempo de espera. Es posible extender aún más, si esto se hace sistemáticamente para que todos los experimentos comparar. Por ejemplo, después de que los órg...

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse at JoVE.com

An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

En este artículo, se describe un protocolo simple, económico y optimizado que utiliza el método de colorante azul de Evans para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN que pueden ser adaptados para su uso en otras cepas, especies y otros órganos o tejidos.

Un optimizado Evans azul protocolo para evaluar la fuga Vascular en el ratón

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

an-optimized-evans-blue-protocol-to-assess-vascular-leak-in-the-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

26.1K vistas.  University of Colorado Denver. En este artículo, se describe un protocolo simple, económico y optimizado que utiliza el método de colorante azul de Evans para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN que pueden ser adaptados para su uso en otras cepas, especies y otros órganos o tejidos.

Video: An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The proximal infrarenal aorta and the distal aorta are dissected for clamp placement and needle puncture, respectively. Special attention is paid to avoid dissection between the aorta and the IVC. After clamping the aorta, a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta into the IVC. The surrounding connective tissue is used for hemostatic compression. Successful creation of the AVF will show pulsatile arterial blood flow in the IVC. Further confirmation of successful AVF can be achieved by post-operative Doppler ultrasound.

The goal is to produce an arteriovenous fistula that is simple and reproducible. This method does not use sutures or glue adhesive. Therefore the samples can be used with the least amount of foreign materials for analysis.

Aspectos técnicos de la aortocava Fístula Ratón

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

Investigación

Medicina

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive surgical procedures. Although this is an effective method of assessing in vitro diaphragm activity, it involves non-survival surgery. The application of non-invasive ultrasound imaging as an in vivo procedure is beneficial since it not only reduces the number of animals sacrificed, but is also suitable for monitoring disease progression in live mice. Thus, our ultrasound imaging method may likely assist in the development of novel therapies that alleviate muscle injury induced by various respiratory diseases. Particularly, in clinical diagnoses of obstructive lung diseases, ultrasound imaging has the potential to be used in conjunction with other standard tests to detect the early onset of diaphragm muscle fatigue. In the current protocol, we describe how to accurately evaluate diaphragm contractility in a mouse model using a diagnostic ultrasound imaging technique.

Diagnostic ultrasound imaging has proven to be effective in diagnosing various respiratory diseases in human and animal subjects. We demonstrate a comprehensive ultrasound protocol utilized by Dr. Zuo's lab to analyze diaphragm kinetics specifically in mouse models. This is also a non-invasive research technique which can provide quantitative information on mouse respiratory muscle function.

Ultrasonido Diagnóstico por la Imagen de la función del ratón del diafragma

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and repair damage in simple tissues in the orthopedic and periodontal fields. However, attempts to regenerate the structures and functions of more complex three-dimensional (3D) organs such as lungs have not been very successful because the biological processes of organ regeneration have not been well explored. It is becoming clear that angiogenesis, the formation of new blood vessels, plays key roles in organ regeneration. Newly formed vasculatures not only deliver oxygen, nutrients and various cell components that are required for organ regeneration but also provide instructive signals to the regenerating local tissues. Therefore, to successfully regenerate lungs in an adult, it is necessary to recapitulate the lung-specific microenvironments in which angiogenesis drives regeneration of local lung tissues. Although conventional in vivo angiogenesis assays, such as subcutaneous implantation of extracellular matrix (ECM)-rich hydrogels (e.g., fibrin or collagen gels or Matrigel - ECM protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells), are extensively utilized to explore the general mechanisms of angiogenesis, lung-specific angiogenesis has not been well characterized because methods for orthotopic implantation of biomaterials in the lung have not been well established. The goal of this protocol is to introduce a unique method to implant fibrin gel on the lung surface of living adult mouse, allowing for the successful recapitulation of host lung-derived angiogenesis inside the gel. This approach enables researchers to explore the mechanisms by which the lung-specific microenvironment controls angiogenesis and alveolar regeneration in both normal and pathological conditions. Since implanted biomaterials release and supply physical and chemical signals to adjacent lung tissues, implantation of these biomaterials on diseased lung can potentially normalize the adjacent diseased tissues, enabling researchers to develop new therapeutic approaches for various types of lung diseases.

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

El implante de gel de fibrina en pulmón de ratón para el Estudio de la angiogénesis pulmón específico

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

Intraluminal Drug Delivery to the Mouse Arteriovenous Fistula Endothelium

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The simple murine AVF model was combined with intraluminal administration of drug solution to the venous endothelium at the same time as fistula creation. Technical aspects of this model are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The infra-renal aorta and IVC are dissected for clamping. After proximal and distal clamping, the puncture site is exposed and a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta and into the IVC. Immediately after the puncture, a reporter gene-expressing viral vector was infused in the IVC via the same needle, followed by 15 min of incubation. The intraluminal administration method enabled more robust viral gene delivery to the venous endothelium compared to administration by the external route. This novel method of delivery will facilitate studies that explore the role of the endothelium in AVF maturation and enable intraluminal drug delivery at the time of surgical operation.

After puncturing the aorta through the inferior vena cava (IVC) to create an aorto-caval fistula in the mouse, solution containing a drug is infused into the IVC via the same needle, followed by incubation. This method enables more robust drug delivery to the venous endothelium compared to the external route.

Intraluminal entrega de la droga a la fístula arteriovenosa ratón endotelio

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The ...

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the aorta in mice using the sleeve method was short and easy averaging 20 min, permitting studies of iso/allo grafts. The following article describes the aortic transplantation procedure used in our laboratory. The mice were anesthetized with a mixture of 1.5% volume isoflurane and 100% oxygen through a face mask. At this point, the segment of the aorta between the renal arteries and its bifurcation was separated from the vena cava, freely prepared and clampedat the proximal and distal segments with a single silk suture. Prior to the removal of the aorta, a saline solution containing heparin was injected into the inferior vena cava. Then the aorta was cut between the clamps and a saline heparin solution was used to flush the lumen. The sleeve technique with monofilament sutures was used in order to transplant the abdominal aorta in the orthotopic position.

We present an orthotopic aortic transplantation model using the sleeve technique in mice. It is a very rapid anastomosis method, which can be employed in studies of vascular disease.

Utilizando la técnica de la manga en un modelo murino de trasplante aórtico - un Video instructivo

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody production pre- and post-vaccination is required to understand vaccine-induced immunity. This article describes a reliable point-by-point protocol to determine influenza-specific antibody titers. The first protocol describes a method to specify the antigen amounts required for hemagglutination, which standardizes the concentrations for subsequent usage in the second protocol (hemagglutination assay, HA assay). The second protocol describes the quantification of influenza-specific antibody titers against different viral strains by using a serial dilution of human serum or cell culture supernatants (hemagglutination inhibition assay, HI assay).
As an applied example, we show the antibody response of a healthy cohort, which received a trivalent inactivated influenza vaccine. Additionally, the cross-reactivity between the different influenza viruses is shown and methods to minimize cross-reactivity by using different types of animal red blood cells (RBCs) are explained. The discussion highlights advantages and disadvantages of the presented assays and how the determination of influenza-specific antibody titers can improve the understanding of vaccine-related immunity.

An Optimized Hemagglutination Inhibition HI Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

The presented protocols describe how to perform a hemagglutination inhibition assay to quantify influenza-specific antibody titers from serum samples of influenza vaccine recipients. The first assay determines optimal viral antigen concentrations by hemagglutination. The second assay quantifies influenza-specific antibody titers by hemagglutination inhibition.

Un ensayo de hemaglutinación optimizado inhibición (HI) para cuantificar los títulos de anticuerpos específicos de la gripe

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody ...

Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine

Primaquine (PMQ), an important anti-malarial drug, has been recommended by the World Health Organization (WHO) for the treatment of life-threatening infections caused by P. vivax and ovale. However, PMQ has unwanted adverse effects that lead&#160;to acute hemolysis in patients with glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency. There is a need to develop simple and reliable methods for PMQ determination with the purpose of dosage monitoring. In early 2019, we have reported an UV-Vis and naked-eye based approach for PMQ colorimetric quantification. The detection was based on a Griess-like reaction between PMQ and anilines, which can generate colored azo products. The detection limit for direct measurement of PMQ in synthetic urine is in the nanomolar range. Moreover, this method has shown great potential for PMQ quantification from human serum samples at clinically relevant concentrations. In this protocol, we will describe the technical details regarding the syntheses and characterization of colored azo products, the reagent preparation, and the procedures for PMQ determination.

This protocol describes a novel colorimetric method for antimalarial primaquine (PMQ) detection in synthetic urines and human serums.

Reacción de griess optimizada para UV-Vis y determinación a vista desnuda de primaquina antipalúdica

Primaquine (PMQ), an important anti-malarial drug, has been recommended by the World Health Organization (WHO) for the treatment of life-threatening ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive conjugates was compared to uncoated PVC tubes, latex tubes, and a stent for intravascular application that was placed inside the PVC tubes. Evaluation of hemocompatibility was done using an in vitro hemodynamic loop model that is recommended by the ISO standard 10993-4. The tubes were cut into segments of identical length and closed to form loops avoiding any gap at the splice, then filled with human blood and rotated in a water bath at 37 &#176;C for 3 hours. Thereafter, the blood inside the tubes was collected for the analysis of whole blood cell count, hemolysis (free plasma hemoglobin), complement system (sC5b-9), coagulation system (fibrinopeptide A), and leukocyte activation (polymorphonuclear elastase, tumor necrosis factor and interleukin-6). Host cell activation was determined for platelet activation, leukocyte integrin status and monocyte platelet aggregates using flow cytometry. The effect of inaccurate loop closure was examined with x-ray microtomography and scanning electron microscopy, that showed thrombus formation at the splice. Latex tubes showed the strongest activation of both plasma and cellular components of the blood, indicating a poor hemocompatibility, followed by the stent group and uncoated PVC tubes. The coated PVC tubes did not show a significant decrease in platelet activation status, but showed an increased in complement and coagulation cascade compared to uncoated PVC tubes. The loop model itself did not lead to the activation of cells or soluble factors, and the hemolysis level was low. Therefore, the presented in vitro hemodynamic loop model avoids excessive activation of blood components by mechanical forces and serves as a method to investigate in vitro interactions between donor blood and vascular medical devices.

Presented here is a protocol for a standardized in vitro hemodynamic loop model. This model allows to test the hemocompatibility of perfusion tubes or vascular stents to be in accordance with ISO (International Organization for Standardization) standard 10993-4.

Un modelo de bucle hemodinámico In Vitro para investigar la hemocitocompatibilidad y la activación de células host de dispositivos médicos vasculares

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is a common, noninvasive, repeatable method for assessing blood flow recovery. The technique calculates overall blood flow in the sampled tissue from the Doppler shift in frequency caused when a laser hits moving red blood cells. Measurements are expressed in arbitrary perfusion units, so the contralateral non-intervened upon leg is usually used to help control measurements. Measurement depth is in the range of 0.3-1 mm; for hindlimb ischemia, this means that dermal perfusion is assessed. Dermal perfusion is dependent on several factors&#8212;most importantly skin temperature and anesthetic agent, which must be carefully controlled to result in reliable readings. Furthermore, hair and skin pigmentation can alter the ability of the laser to either reach or penetrate to the dermis. This article demonstrates the technique of LDPI in the mouse hindlimb.

Here, we present a protocol that demonstrates the technique and necessary controls for Laser Doppler perfusion imaging to measure blood flow in the mouse hindlimb.

Imágenes de perfusión doppler láser en el hindlimb del ratón

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is ...

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of vasoconstriction and vasorelaxation. After isolating the IPA and VSMCs, the characteristics of vascular responses in physiological and pathological conditions can be assessed in the absence of extrinsic factors such as nerve signals, hormones, cytokines, etc. Thus, the IPA and VSMCs serve as excellent models for studying vascular physiology/pathophysiology, along with various experimental investigations, such as modulation by pharmacological agents, patch-clamp electrophysiological analysis, calcium imaging, etc. Here, we have used a technique for isolating the IPA to investigate vascular responses in an organ bath setup. IPA segments were mounted on the organ bath chamber via intraluminal wires and stimulated by various pharmacological agents. The changes in IPA vascular tone (i.e., vasoconstriction and vasorelaxation), were recorded using an isometric force transducer and physiological data analysis software program. We implemented several experimental protocols, which can be adapted to investigate the mechanisms of vasorelaxation/vasoconstriction for studying the pharmacological activities of phytochemical or synthetic drugs. The protocols can also be used to evaluate drugs&#39; roles in modulating various diseases, including pulmonary arterial hypertension. The IPA model allows us to investigate the concentration-response curve, which is crucial in assessing drugs&#39; pharmacodynamic parameters.

Vascular responses of arterial pulmonary circulation can be explored using intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs). The present study describes the isolation of IPA in detail and the protocols used for investigating vasorelaxation in response to physiological stimuli.