Gli autori desiderano ringraziare Andy Poczobutt e Dr. Jori Leszczynski per il loro prezioso aiuto e le modifiche apportate a questo manoscritto.  Sostenuta da sovvenzioni ricevute dal cuore nazionale, polmone e Blood Institute (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 e HL095439 RO3) e il dipartimento degli affari dei veterani (recensione di merito).

Tutte le linee guida internazionali, nazionali e/o istituzionali applicabili per la cura e l'uso di animali (topi) sono state seguite negli esperimenti descritti in questo manoscritto.
Questo metodo utilizza topi adulti FVBN, età compresa tra 16-20 settimane, trovato per essere ottimale per gli scopi di questo studio. Giorno 1 include i passaggi 1-5 e 2 giorni include i passaggi 6-7 (Figura 1).
1. preparazione del materiale
<ol><li>Garantire un'adeguata disponibilità di siringhe sterili, monouso e aghi, se chetamina/xilazina è usato come anestetico (come consigliato). Se isoflurane è usata come anestetico, controllare la bombola dell'ossigeno e il livello del liquido di isoflurane per assicurarsi che non ci sono rifornimenti sufficienti per l'esperimento prima di iniziare. Inoltre, montare la punta conica circuiti respiratori e allegarli alla casella di induzione; fissare nuovi contenitori del carbone di legna per i circuiti di respirazione. Preparare la casella induzione attivando l'ossigeno e accertare che la seconda fase legge circa 50 psi.</li>
	<li>Accendere il rilievo di riscaldamento a 37 ° C.</li>
	<li>Preparare la sonda di temperatura rettale per la chirurgia.</li>
</ol>2. preparazione di Mouse
Questo passaggio include l'anestesia, depilazione e posizionamento (adulto FVBN topi-età 16-20 settimane).
<ol><li>Pesare i topi e registrare i pesi.</li>
	<li>Anestetizzare i topi.<ol>
<li>Amministrare la ketamina e xilazina IP (80-100 mg/kg e 7,5-16 mg/kg, rispettivamente). Tuttavia, si raccomanda di iniziare con basse dosi di ketamina e xilazina (circa 30 mg/kg e 6 mg/kg, rispettivamente).</li>
		<li>Mantenere l'anestesia con circa 0,1 - 0,25 volte iniziale dosi di chetamina/xilazina durante l'intervento chirurgico. Ketamina e xilazina erano degli agenti anestetici di scelta in questo studio particolare, come maggiore riproducibilità e capacità di sopravvivenza sono stati osservati. Degli agenti anestetici di scelta in altri studi possono essere trovati per essere diversi.  Se viene utilizzato l'isoflurano, mettere il mouse in un'aula di induzione e accendere isoflurano al 5%, fino a quando il mouse perde coscienza completa. Quindi utilizzare un musetto nasale fissato a isoflurane 1.5-2.5% per tutto il resto della procedura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monitorare i topi ogni 2-3 min di pizzico di punta per verificare la profondità appropriata dell'anestesia.</li>
	<li>Radere la zona ventrale del collo del mouse.</li>
	<li>Posizionare il mouse in una posizione supina sul pad preriscaldato. Fissare le zampe e i piedi del mouse alla superficie chirurgico con nastro adesivo.</li>
	<li>Posto lacrime artificiali unguento per gli occhi per evitare l'essiccazione durante la chirurgia.</li>
</ol>3. chirurgici dettagli
<ol><li>Praticare un'incisione di 1 cm nel collo proprio ventrale sopra la vena giugulare.</li>
	<li>Applicare una o due gocce di lidocaina (1-2%) nell'area di incisione per la gestione del dolore e per promuovere la vasodilatazione. Attendere 2 minuti per la lidocaina effettive.</li>
	<li>Esporre e isolare la vena giugulare interna destra tramite dissezione smussa. Legare la vena con sutura 4-0 e retrarre delicatamente alla fine rostrale della nave con una pinza emostatica. Tagliare un buco, utilizzando forbici bene, circa 3 mm inferiore o caudale alla cravatta, circa a metà strada attraverso il diametro della vena.</li>
	<li>Contrassegnare un catetere polivinilico PV-1 1,5 cm dall'estremità e inserirla nella vena giugulare attraverso il foro utilizzando un dilatatore e infilare il catetere verso l'estremità caudale della nave, circa 1,5 cm.</li>
	<li>Legare il catetere in modo sicuro all'interno della parte caudale della nave (sotto il taglio), con seta 4-0. Legare la parte rostrale del vaso verso l'esterno del catetere con le estremità della sutura che è stata usata per legare la vena giugulare rostrale, al punto 3.3.</li>
	<li>Aderenza alla pelle senza bloccare di nuovo insieme intorno al catetere con seta 4-0 per aiutare a prevenire la perdita di calore corporeo ed essiccazione dei tessuti.</li>
	<li>Collegare il catetere ad una siringa contenente soluzione fisiologica eparinata (10 U/mL) e irrorare il catetere.</li>
</ol>4. iniezioni
<ol><li>Iniettare la soluzione di blu di Evans (50 µ l di una soluzione di 30 mg/mL in soluzione salina normale, unheparinized 0,9% o circa 50 mg/kg) il catetere giugulare, seguito da un piccolo volume di soluzione fisiologica eparinizzata per svuotare la linea.</li>
	<li>2 min dopo, iniettare la sostanza P (100 μL di soluzione 0,3 μM in soluzione salina normale, unheparinized 0,9%, o 1 nmol/kg), seguita da un piccolo volume di soluzione fisiologica eparinizzata per svuotare la linea. Sostanza P aumenta lo stravaso di proteine plasmatiche attraverso lo strato endoteliale; in questo protocollo, ordinariamente induce un aumento dei valori di stravaso di plasma di circa 1,5 volte, rendendo al plasma stravaso valori più facile da misurare.</li>
	<li>Attendere 18 min dopo la sostanza P viene iniettato. Durante questo periodo, il colorante blu di Evans sarà equilibrare e circolare.</li>
	<li>Terminare l'esperimento 18 min dopo l'iniezione della sostanza P (20 min dopo l'iniezione di blu di Evans) sacrificando il mouse con dislocazione cervicale. È probabile che il mouse può essere direttamente cervicale slogato, senza prima dare un'overdose di anestetico, come il mouse è probabilmente ancora ben anestetizzati dalla chirurgia. Tuttavia, se è necessario, una dose eccessiva del anestetici chetamina/xilazina, isoflurano o pentobarbital può essere concesse, seguita da dislocazione cervicale.</li>
</ol>5. isolamento degli organi
<ol><li>Tagliati la cavità toracica del mouse e gravità-irrorare (da un'altezza di circa 51 cm o 20") il cuore e vasi sanguigni con 50 mL di citrato di sodio di 50 mM, pH 3.5. pH 3.5 conserva presumibilmente associazione blu di Evans all'albumina.</li>
	<li>Asportare organi pertinenti 1-5 (tessuti) con un bisturi per dissezione (ad es. la vescica urinaria, rene, stomaco, fegato, pancreas, prossimale o distale del colon, ileo, duodeno, fianco pelle, orecchie, coda, cuore e polmoni) e per rimuovere qualsiasi residuo, se presenti.</li>
	<li>Sciacquare gli organi a temperatura ambiente (TA) tampone fosfato salino (PBS; 1,44 g di Na2HPO4, 0,24 g di KH2PO4, 8,0 g di NaCl e 0,20 g di KCl in 1 L, pH 7.4).</li>
	<li>Asciugare gli organi con tessuto, tagliare ogni organo a metà e pesare ogni mezzo (bagnato pesi, in g).</li>
	<li>Asciughi uno metà del tessuto in un forno a 150 ° C, su pellicola, per 48 h.</li>
	<li>Posizionare l'altro tessuto metà in un volume costante (fino a 200 µ l) di formammide in una microfuge tube per 48 h (e fino a 72 h) per estrarre il blu di Evans.</li>
</ol>6. misurazione del tessuto OD
<ol><li>Rimuovere 50 µ l di Evans blue-infuso formammide (dopo incubazione di 48-72 h RT) dal tubo di microfuge e posto in un pozzetto di una piastra 96 pozzetti in polistirolo. Fare attenzione a non trasferire i pezzi di tessuto insieme la formammide.</li>
	<li>Mettere 50 µ l di formamide nuovo, puro in ciascuno dei due pozzetti vuoti della piastra 96 pozzetti per gli spazii in bianco.</li>
	<li>Misurare e registrare il OD620 di ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti su un lettore di piastra di assorbanza. 620 nm è la capacità di assorbimento max di blu di Evans.</li>
</ol>7. calcolo di stravaso di Plasma
<ol><li>Pesare il tessuto asciutto metà che è stata in forno per 48 h.</li>
	<li>Calcolare il rapporto di peso peso umido/a secco per l'organo specifico di interesse da ogni mouse individuali, a partire con il peso bagnato di questo tessuto metà (ottenuti nel punto 5.4), diviso per il peso a secco di questo tessuto stesso mezzo (ottenuti in punto 7.1).</li>
	<li>Calcolare il peso a secco (in g) del tessuto metà in formammide dividendo il peso bagnato del tessuto metà prima di esso è stato disposto in formammide (ottenuta al passaggio 5.4) dall'umido: rapporto di peso a secco per l'organo specifico di interesse (calcolato al punto 7.2).</li>
	<li>Calcolare i valori di620 OD rettificato . A partire con il OD620 valore da ogni pozzetto sperimentale della piastra 96 pozzetti (contenente formammide blu-infuso di Evans da ogni tessuto, ottenuto nel passaggio 6.3), sottrarre il valore vuoto del620 OD ben (il OD620 valore medio di i due pozzi contenente formammide pura, preparata al punto 6.2, OD620 valori ottenuti nel passaggio 6.3) da ogni valore sperimentale.</li>
	<li>Calcolare il valore di stravaso di plasma dividendo il corretto OD620 (calcolato nel passaggio 7.4) per il peso a secco del tessuto metà in formammide (calcolato in punto 7.3). Le unità di stravaso di plasma sarà il peso a secco OD620/g.</li>
	<li>Analizzare i dati ed espressa come media ± SEM. statisticamente confrontare i gruppi di test t o analisi unidirezionale della varianza e test di multiplo-confronto di Scheffe (lycofs01.lycoming.edu), come appropriato.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Come discusso in precedenza, lo studio di stravaso di plasma può infine condurre a nuove conoscenze sulle cause di o nuovi modi per inibire o trattamento dello stravaso di plasma. Il riuscito uso del protocollo di stravaso di plasma (sopra), usando il colorante blu di Evans, è stato dimostrato nel manoscritto attuale. Anche se i dati riportati indietro l'ipotesi che la NEP può proteggere il sistema vascolare contro lo stravaso di plasma, questo è un obiettivo secondario attualmente, con l'obiettivo primario è di pre...

Perdita vascolare negli organi si riferisce allo stravaso, o perdita del plasma sanguigno attraverso le lacune prodotta nell'endotelio di post capillare venule negli organi. Questo stravaso di plasma o aumento della permeabilità vascolare, che può derivare da qualche tipo di risposta infiammatoria, può avere gravi conseguenze. Quindi, è importante che questo fenomeno, le cause, modulatori e conseguenze, sono studiate e capite, e allo stesso modo, che gli investigatori hanno una buona strumenti e protocolli con cui per studiarli. Le lacune endoteliale possono essere prodotto tramite una serie di stimoli, ma solitamente sono prodotte dall'azione di neurotrasmettitori peptidici e/o neurochinine sugli endoteli. Uno dei principali mediatori naturali di questo processo, che si traduce nello stravaso aumentati del plasma, è il neuropeptide tachykinin undecapeptide, la sostanza P1.
Metodi per indagare e misurare la permeabilità vascolare o stravaso di plasma, che utilizzano la proprietà di albumina-associazione di colorante blu di Evans, sono stati sviluppati e di solito sono noti per la loro precisione, semplicità, economia, sicurezza e capacità di consentire la determinazione di stravaso di plasma dai tessuti diversi in una sola volta, se così desidera il2,3,4,5,6,7,8,9 . Questo protocollo di blu di Evans per la valutazione dello stravaso di plasma negli organi dei topi FVBN utilizza tutti questi, ma aggiunge alcune importanti modifiche che lo rendono generalmente utile e adattabile per gli studi futuri, che coinvolge il laboratorio di medio che conduce o sarà condurre studi importanti dei fattori connessi con stravaso di plasma o permeabilità vascolare. In questo protocollo, la sostanza P è stato introdotto per i topi a 1 nmol/kg, che aumenta lo stravaso di plasma di 1,5 volte. Questo aumenta la sensibilità del protocollo, con conseguente risultati più facilmente osservabili e ottenibile. Altri fattori che influenzano la permeabilità, come vari altri peptidi, sostanze chimiche o alcune forme di lesione tossica, possono essere utilizzati o studiati da altri laboratori, come desiderato. Vena giugulare iniezioni sono utilizzate nel presente protocollo per introdurre il blu di Evans e sostanza P sistemica, che richiede un intervento chirurgico terminale. Tuttavia, vena giugulare iniezioni5,7,10, anche dopo un esame delle tecniche chirurgiche terminale necessarie, sono più facili da padroneggiare e portano alla produzione di risultati più coerenti rispetto altri iniezioni di venose, compresa la coda della vena iniezioni4,9. Anche se potrebbe essere possibile per il blu di Evans da consegnare tramite le iniezioni retro-orbitale del seno venoso, riferimenti nella letteratura non sono stati trovati che utilizzano questo metodo di consegna di blu di Evans. Tuttavia, per quanto riguarda le iniezioni di vena della coda, l'elevato grado di competenza e pratica riproducibile padroneggiare questa tecnica notevolmente limita l'impiego per successo iniezioni di blu di Evans. Al contrario, il metodo di iniezione della vena giugulare alternativo come descritto nel nostro protocollo, offre una soluzione tecnicamente ottenibile. Una procedura fondamentale per la perfusione delle vene del mouse, eseguita solo dopo il sacrificio del mouse irrorato di blu di Evans, rimuove l'eccesso di blu di Evans ed è stato standardizzato nel presente protocollo. Metodi precedentemente descritti di aspersione sono stati attentamente esaminati e modificati per ottenere la presente procedura. Altre modifiche descritte qui sono tutti ottimizzati, semplice e poco costoso.
Ci sono alcune importanti limitazioni del metodo del colorante blu di Evans. Ad esempio, bassa sensibilità a volte connessa con questo metodo potrebbe impedire alcuni ulteriore esame lordo di patologico ed istologico dei tessuti da animali iniettati blu di Evans. Tuttavia, queste e altre limitazioni hanno portato allo sviluppo di metodi alternativi e modelli che, comunque, ancora utilizzano il blu di Evans. La misurazione di blu di Evans di fluorescenza (piuttosto che di visual-gamma) spettroscopia può aumentare la sensibilità del metodo. Inoltre, microscopia di fluorescenza dei tessuti tinto di blu di Evans è stata sviluppata per consentire l'osservazione di perdita vascolare in più distinte posizioni11. Inoltre, corpo intero di imaging e la scansione di un animale vivo precedentemente iniettato con Evans blue12 consente di indagine delle concentrazioni di blu di Evans in modo continuo, piuttosto che ad uno specifico scelto tempo punto dell'esperimento. Tuttavia, questo metodo richiede la disponibilità di adeguate strutture di imaging e può essere molto costoso. Modifiche che coinvolgono Evans blu e si è esibito in un tipo in vitro di modello, come in una cella cultura o pulcino chorioallantoic modello13 (CAM) inoltre sono stati descritti. Questi modelli sono monitorati da fluorescenza e microscopia intravital14 e consentono la quantificazione dei cambiamenti di permeabilità vascolare nel corso del tempo, ma possono sollevare questioni per quanto riguarda la modellazione accurata delle condizioni in vivo e possono anche essere costoso.
Ci sono stati altri metodi sviluppati per determinare e quantificare la perdita vascolare o permeabilità, che non comportano la somministrazione di blu di Evans. Questi metodi possono impiegare una molecola fluorescente appropriata (ad esempio l'albumina o fluoresceina), o una molecola con tag isotopicamente etichettata o altrimenti, agli animali vivi (o alla cella cultura o chorioallantoic (CAM) modelli13, seguita da non-invasivo Imaging (scansione PET, MRI, microscopia intravital, scansione di tutto il corpo) o di imaging invasivo (microscopia fluorescente)3,12,15. Anche se queste tecniche possono offrire un numero di vantaggi sopra altri Evans metodi blu, hanno anche gli svantaggi, che possono includere il loro notevole complessità, necessaria esperienza, risorse e costi monetari alti.
Neprilisina16 (peptidasi enzima NEP, noto anche come CD10, MME o Enkephalinase) è stata suggerita per essere coinvolti nell'inibizione dello stravaso di plasma, almeno in parte, attraverso il metabolismo enzimatico e inattivazione di endogeno sostanza p. Così, nei tessuti in cui si verifica la peptidasi di superficie delle cellule NEP, ci può essere un'attenuazione dell'effetto della sostanza P, presumibilmente dall'attività della peptidasi di NEP.
Inizialmente, abbiamo testato per lo stravaso di plasma indotta da sostanza P che utilizzano questo protocollo modificato di blu di Evans, con FVBN wild type (WT) e topi knockout (KO) NEP. Coinvolgimento di NEP nello stravaso di plasma sostanza P-aumentata è stata ritenuta sospetto da questi studi iniziali, e Descriviamo questi ed ulteriori esperimenti ruolo di NEP coinvolgendo nello stravaso di plasma. Tuttavia, il focus di questo manoscritto non è NEP o il suo ruolo nello stravaso di plasma, ma piuttosto lo stravaso di plasma esperimenti stessi. I risultati di NEP sono rappresentativi del tipo di risultati che possono essere ottenuti attraverso l'uso di questo protocollo modificato. Il metodo di blu di Evans per misurare lo stravaso di plasma è stato ottimizzato e modificato, come descritto in dettaglio qui di seguito per i topi FVBN.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:687px;" width="686">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">isoflurane</td>
			<td style="width:167px;">Vet One</td>
			<td style="width:119px;">200-070</td>
			<td style="width:185px;">inhaled anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ketamine</td>
			<td style="width:167px;">Vet One</td>
			<td style="width:119px;">200-055</td>
			<td>injectable anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">xylazine</td>
			<td style="width:167px;">Lloyd Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">139-236</td>
			<td>injectable anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">syringes (10,3 &#38; 1 cc)</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309604, 309657, 309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">needles (20G1,23G1 &#38; 26G1/2)</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">305178, 305193, 305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">isoflurane induction chamber</td>
			<td style="width:167px;">VetEquip</td>
			<td style="width:119px;">941443</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nosecone breathing circuits&#160;</td>
			<td style="width:167px;">VetEquip</td>
			<td style="width:119px;">RC2</td>
			<td>Rodent Circuit Controller 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">oxygen tank</td>
			<td style="width:167px;">Airgas</td>
			<td style="width:119px;">UN 1072</td>
			<td>100% medical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">heating pad</td>
			<td style="width:167px;">CWE Inc.</td>
			<td style="width:119px;">TC-1000</td>
			<td>temperature controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">rectal temperature probe</td>
			<td style="width:167px;">CWE Inc.</td>
			<td>10-09012</td>
			<td>mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">balance (for rodents)</td>
			<td style="width:167px;">Ohaus</td>
			<td style="width:119px;">CS 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">surgical tools-scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:185px;">Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels)&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11151-10</td>
			<td style="width:185px;">Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">surgical tools-hemostats</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>13009-12</td>
			<td style="width:185px;">Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools -suture drivers</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>12502-12</td>
			<td style="width:185px;">Olsen-Hegar suture drivers (suturing)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11627-12</td>
			<td style="width:185px;">Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">surgical tools-scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td style="width:185px;">Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>18025-10</td>
			<td style="width:185px;">suture tying forceps (used for Millar cath)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>14078-10</td>
			<td style="width:185px;">Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td style="width:185px;">Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td style="width:185px;">Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td style="width:185px;">10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td style="width:185px;">Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-retractors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>17012-11</td>
			<td style="width:185px;">Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11294-00</td>
			<td style="width:185px;">Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11297-00</td>
			<td style="width:185px;">Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td style="width:185px;">tough cut iris scissors (mouse dissection, bones)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td style="width:185px;">serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-hemostats</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>13003-10</td>
			<td style="width:185px;">Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td style="width:185px;">Adson serrated forceps (tissue grasping)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">clippers</td>
			<td style="width:167px;">Oster</td>
			<td style="width:119px;">A5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">tape</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">159015G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">artificial tear ointment</td>
			<td style="width:167px;">Akorn Inc</td>
			<td style="width:119px;">13985-600-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">lidocaine</td>
			<td style="width:167px;">Hospira</td>
			<td style="width:119px;">0409-4277-01</td>
			<td>2% injectable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polyvinyl catheters</td>
			<td style="width:167px;">Tygon</td>
			<td style="width:119px;">PV-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Evans blue</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Substance P</td>
			<td style="width:167px;">Bachem&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H-1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">heparin</td>
			<td style="width:167px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">25201-400-10</td>
			<td>1000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">saline solution</td>
			<td style="width:167px;">Hospira</td>
			<td style="width:119px;">0409-7138-09</td>
			<td>0.9% sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">phenobarbital&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Vortech</td>
			<td style="width:119px;">0298-9373-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium citrate</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP327-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4417-50TAB&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kimwipes for blotting</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">formamide</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">47670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microbalance</td>
			<td style="width:167px;">Denver Instrument</td>
			<td style="width:119px;">APX-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microfuge tubes</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polystyrene 96 well plate</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickenson</td>
			<td style="width:119px;">351172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">absorbance plate reader</td>
			<td style="width:167px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polyacrylamide gels</td>
			<td style="width:167px;">Bio-Rad</td>
			<td>3450014&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">protein molecular weight standard</td>
			<td style="width:167px;">Bio-Rad</td>
			<td>1610374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protran supported nitrocellulose</td>
			<td style="width:167px;">Amersham (GE)</td>
			<td style="width:119px;">10600015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gel box</td>
			<td style="width:167px;">Bio-Rad</td>
			<td>1658005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween20</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">primary NEP polyclonal antibody&#160;</td>
			<td style="width:167px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">AF1182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">doxycycline chow</td>
			<td style="width:167px;">Teklad (HARLAN)</td>
			<td>TD.130750&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FVB/NJ wild type mice</td>
			<td style="width:167px;">Jackson</td>
			<td style="width:119px;">001800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">secondary antibody (goat anti-rabbit)</td>
			<td style="width:167px;">ZyMed</td>
			<td style="width:119px;">81-6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ECL solution-Western Lightening Plus</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEL104001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">film</td>
			<td style="width:167px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">34091</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse

Perdita vascolare, o lo stravaso di plasma, ha un certo numero di cause e può essere una conseguenza grave o sintomo di una risposta infiammatoria. Questo studio può infine condurre a nuove conoscenze sulle cause di o nuovi modi per inibire o trattamento dello stravaso di plasma. È importante che i ricercatori hanno gli strumenti adeguati, tra cui i migliori metodi disponibili, per lo studio di stravaso di plasma. In questo articolo, descriviamo un protocollo, utilizzando il metodo di colorante blu di Evans, per la valutazione dello stravaso di plasma negli organi dei topi FVBN. Questo protocollo è volutamente semplice, a come grande un grado possibile, ma fornisce dati di alta qualità. Blu di Evans è stato scelto principalmente perché è facile per il laboratorio di medio da utilizzare. Abbiamo utilizzato questo protocollo per fornire prove e supporto per l'ipotesi che l'enzima neprilisina può proteggere il sistema vascolare contro lo stravaso di plasma. Tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato sperimentalmente e facilmente adattato per l'uso in altri ceppi di topi o in altre specie, in molti diversi organi o tessuti, per gli studi che possono coinvolgere altri fattori che sono importanti per comprendere, prevenire o curare stravaso di plasma. Questo protocollo è stato ampiamente ottimizzato e modificato da protocolli esistenti e combina affidabilità, facilità d'uso, economia e disponibilità generale di materiali e attrezzature, rendendo questo protocollo superiore per il laboratorio di medio da utilizzare in quantificare lo stravaso di plasma da organi.

Nella Figura 1, è indicato uno schema della procedura, che è stato trovato per causare i valori di stravaso di plasma indotta da sostanza P più affidabili e coerenti da organi dei topi FVBN. Questa procedura richiede solitamente due giorni di lavoro, separati da almeno 48 ore di tempo di attesa. È possibile diffondere ancora di più, se questa operazione viene eseguita costantemente per tutti gli esperimenti da confrontare. Ad esempio, dopo che gli organi...

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An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

In questo articolo, un protocollo semplice, economico e ottimizzato è descritto che utilizza il metodo di colorante blu di Evans per la valutazione dello stravaso di plasma negli organi dei topi FVBN che può essere adattato per l'uso in altre varietà, specie e altri organi o tessuti.

Blu di un Evans ottimizzato protocollo per valutare la perdita vascolare nel topo

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

26.1K Views.  University of Colorado Denver. In questo articolo, un protocollo semplice, economico e ottimizzato è descritto che utilizza il metodo di colorante blu di Evans per la valutazione dello stravaso di plasma negli organi dei topi FVBN che può essere adattato per l'uso in altre varietà, specie e altri organi o tessuti.

Video: An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The proximal infrarenal aorta and the distal aorta are dissected for clamp placement and needle puncture, respectively. Special attention is paid to avoid dissection between the aorta and the IVC. After clamping the aorta, a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta into the IVC. The surrounding connective tissue is used for hemostatic compression. Successful creation of the AVF will show pulsatile arterial blood flow in the IVC. Further confirmation of successful AVF can be achieved by post-operative Doppler ultrasound.

The goal is to produce an arteriovenous fistula that is simple and reproducible. This method does not use sutures or glue adhesive. Therefore the samples can be used with the least amount of foreign materials for analysis.

Aspetti tecnici della fistola aorto-cavale mouse

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

Ricerca

Medicina

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive surgical procedures. Although this is an effective method of assessing in vitro diaphragm activity, it involves non-survival surgery. The application of non-invasive ultrasound imaging as an in vivo procedure is beneficial since it not only reduces the number of animals sacrificed, but is also suitable for monitoring disease progression in live mice. Thus, our ultrasound imaging method may likely assist in the development of novel therapies that alleviate muscle injury induced by various respiratory diseases. Particularly, in clinical diagnoses of obstructive lung diseases, ultrasound imaging has the potential to be used in conjunction with other standard tests to detect the early onset of diaphragm muscle fatigue. In the current protocol, we describe how to accurately evaluate diaphragm contractility in a mouse model using a diagnostic ultrasound imaging technique.

Diagnostic ultrasound imaging has proven to be effective in diagnosing various respiratory diseases in human and animal subjects. We demonstrate a comprehensive ultrasound protocol utilized by Dr. Zuo's lab to analyze diaphragm kinetics specifically in mouse models. This is also a non-invasive research technique which can provide quantitative information on mouse respiratory muscle function.

Diagnostic Ultrasound Imaging di funzione mouse Diaframma

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and repair damage in simple tissues in the orthopedic and periodontal fields. However, attempts to regenerate the structures and functions of more complex three-dimensional (3D) organs such as lungs have not been very successful because the biological processes of organ regeneration have not been well explored. It is becoming clear that angiogenesis, the formation of new blood vessels, plays key roles in organ regeneration. Newly formed vasculatures not only deliver oxygen, nutrients and various cell components that are required for organ regeneration but also provide instructive signals to the regenerating local tissues. Therefore, to successfully regenerate lungs in an adult, it is necessary to recapitulate the lung-specific microenvironments in which angiogenesis drives regeneration of local lung tissues. Although conventional in vivo angiogenesis assays, such as subcutaneous implantation of extracellular matrix (ECM)-rich hydrogels (e.g., fibrin or collagen gels or Matrigel - ECM protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells), are extensively utilized to explore the general mechanisms of angiogenesis, lung-specific angiogenesis has not been well characterized because methods for orthotopic implantation of biomaterials in the lung have not been well established. The goal of this protocol is to introduce a unique method to implant fibrin gel on the lung surface of living adult mouse, allowing for the successful recapitulation of host lung-derived angiogenesis inside the gel. This approach enables researchers to explore the mechanisms by which the lung-specific microenvironment controls angiogenesis and alveolar regeneration in both normal and pathological conditions. Since implanted biomaterials release and supply physical and chemical signals to adjacent lung tissues, implantation of these biomaterials on diseased lung can potentially normalize the adjacent diseased tissues, enabling researchers to develop new therapeutic approaches for various types of lung diseases.

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

L&#39;impianto di fibrina gel sul mouse polmone per studiare angiogenesi Lung-specifica

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

Intraluminal Drug Delivery to the Mouse Arteriovenous Fistula Endothelium

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The simple murine AVF model was combined with intraluminal administration of drug solution to the venous endothelium at the same time as fistula creation. Technical aspects of this model are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The infra-renal aorta and IVC are dissected for clamping. After proximal and distal clamping, the puncture site is exposed and a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta and into the IVC. Immediately after the puncture, a reporter gene-expressing viral vector was infused in the IVC via the same needle, followed by 15 min of incubation. The intraluminal administration method enabled more robust viral gene delivery to the venous endothelium compared to administration by the external route. This novel method of delivery will facilitate studies that explore the role of the endothelium in AVF maturation and enable intraluminal drug delivery at the time of surgical operation.

After puncturing the aorta through the inferior vena cava (IVC) to create an aorto-caval fistula in the mouse, solution containing a drug is infused into the IVC via the same needle, followed by incubation. This method enables more robust drug delivery to the venous endothelium compared to the external route.

Intraluminale Drug Delivery per il mouse fistola artero-venosa endotelio

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The ...

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the aorta in mice using the sleeve method was short and easy averaging 20 min, permitting studies of iso/allo grafts. The following article describes the aortic transplantation procedure used in our laboratory. The mice were anesthetized with a mixture of 1.5% volume isoflurane and 100% oxygen through a face mask. At this point, the segment of the aorta between the renal arteries and its bifurcation was separated from the vena cava, freely prepared and clampedat the proximal and distal segments with a single silk suture. Prior to the removal of the aorta, a saline solution containing heparin was injected into the inferior vena cava. Then the aorta was cut between the clamps and a saline heparin solution was used to flush the lumen. The sleeve technique with monofilament sutures was used in order to transplant the abdominal aorta in the orthotopic position.

We present an orthotopic aortic transplantation model using the sleeve technique in mice. It is a very rapid anastomosis method, which can be employed in studies of vascular disease.

Utilizzando la tecnica di manica in un modello murino di trapianto aortico - un Video didattico

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody production pre- and post-vaccination is required to understand vaccine-induced immunity. This article describes a reliable point-by-point protocol to determine influenza-specific antibody titers. The first protocol describes a method to specify the antigen amounts required for hemagglutination, which standardizes the concentrations for subsequent usage in the second protocol (hemagglutination assay, HA assay). The second protocol describes the quantification of influenza-specific antibody titers against different viral strains by using a serial dilution of human serum or cell culture supernatants (hemagglutination inhibition assay, HI assay).
As an applied example, we show the antibody response of a healthy cohort, which received a trivalent inactivated influenza vaccine. Additionally, the cross-reactivity between the different influenza viruses is shown and methods to minimize cross-reactivity by using different types of animal red blood cells (RBCs) are explained. The discussion highlights advantages and disadvantages of the presented assays and how the determination of influenza-specific antibody titers can improve the understanding of vaccine-related immunity.

An Optimized Hemagglutination Inhibition HI Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

The presented protocols describe how to perform a hemagglutination inhibition assay to quantify influenza-specific antibody titers from serum samples of influenza vaccine recipients. The first assay determines optimal viral antigen concentrations by hemagglutination. The second assay quantifies influenza-specific antibody titers by hemagglutination inhibition.

Un'analisi di inibizione (HI) ottimizzato emagglutinazione per quantificare i titoli dell'anticorpo specifico dell'Influenza

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody ...

Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine

Primaquine (PMQ), an important anti-malarial drug, has been recommended by the World Health Organization (WHO) for the treatment of life-threatening infections caused by P. vivax and ovale. However, PMQ has unwanted adverse effects that lead&#160;to acute hemolysis in patients with glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency. There is a need to develop simple and reliable methods for PMQ determination with the purpose of dosage monitoring. In early 2019, we have reported an UV-Vis and naked-eye based approach for PMQ colorimetric quantification. The detection was based on a Griess-like reaction between PMQ and anilines, which can generate colored azo products. The detection limit for direct measurement of PMQ in synthetic urine is in the nanomolar range. Moreover, this method has shown great potential for PMQ quantification from human serum samples at clinically relevant concentrations. In this protocol, we will describe the technical details regarding the syntheses and characterization of colored azo products, the reagent preparation, and the procedures for PMQ determination.

This protocol describes a novel colorimetric method for antimalarial primaquine (PMQ) detection in synthetic urines and human serums.

Reazione Griess ottimizzata per UV-Vis e determinazione a occhio nudo di Primaquine antimalarico

Primaquine (PMQ), an important anti-malarial drug, has been recommended by the World Health Organization (WHO) for the treatment of life-threatening ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive conjugates was compared to uncoated PVC tubes, latex tubes, and a stent for intravascular application that was placed inside the PVC tubes. Evaluation of hemocompatibility was done using an in vitro hemodynamic loop model that is recommended by the ISO standard 10993-4. The tubes were cut into segments of identical length and closed to form loops avoiding any gap at the splice, then filled with human blood and rotated in a water bath at 37 &#176;C for 3 hours. Thereafter, the blood inside the tubes was collected for the analysis of whole blood cell count, hemolysis (free plasma hemoglobin), complement system (sC5b-9), coagulation system (fibrinopeptide A), and leukocyte activation (polymorphonuclear elastase, tumor necrosis factor and interleukin-6). Host cell activation was determined for platelet activation, leukocyte integrin status and monocyte platelet aggregates using flow cytometry. The effect of inaccurate loop closure was examined with x-ray microtomography and scanning electron microscopy, that showed thrombus formation at the splice. Latex tubes showed the strongest activation of both plasma and cellular components of the blood, indicating a poor hemocompatibility, followed by the stent group and uncoated PVC tubes. The coated PVC tubes did not show a significant decrease in platelet activation status, but showed an increased in complement and coagulation cascade compared to uncoated PVC tubes. The loop model itself did not lead to the activation of cells or soluble factors, and the hemolysis level was low. Therefore, the presented in vitro hemodynamic loop model avoids excessive activation of blood components by mechanical forces and serves as a method to investigate in vitro interactions between donor blood and vascular medical devices.

Presented here is a protocol for a standardized in vitro hemodynamic loop model. This model allows to test the hemocompatibility of perfusion tubes or vascular stents to be in accordance with ISO (International Organization for Standardization) standard 10993-4.

Un modello di loop emodinamico in vitro per indagare l'emocitocompatibilità e l'attivazione delle cellule ospiti dei dispositivi medici vascolari

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is a common, noninvasive, repeatable method for assessing blood flow recovery. The technique calculates overall blood flow in the sampled tissue from the Doppler shift in frequency caused when a laser hits moving red blood cells. Measurements are expressed in arbitrary perfusion units, so the contralateral non-intervened upon leg is usually used to help control measurements. Measurement depth is in the range of 0.3-1 mm; for hindlimb ischemia, this means that dermal perfusion is assessed. Dermal perfusion is dependent on several factors&#8212;most importantly skin temperature and anesthetic agent, which must be carefully controlled to result in reliable readings. Furthermore, hair and skin pigmentation can alter the ability of the laser to either reach or penetrate to the dermis. This article demonstrates the technique of LDPI in the mouse hindlimb.

Here, we present a protocol that demonstrates the technique and necessary controls for Laser Doppler perfusion imaging to measure blood flow in the mouse hindlimb.

Imaging perfusione Doppler laser nell'hindlimb del mouse

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is ...

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of vasoconstriction and vasorelaxation. After isolating the IPA and VSMCs, the characteristics of vascular responses in physiological and pathological conditions can be assessed in the absence of extrinsic factors such as nerve signals, hormones, cytokines, etc. Thus, the IPA and VSMCs serve as excellent models for studying vascular physiology/pathophysiology, along with various experimental investigations, such as modulation by pharmacological agents, patch-clamp electrophysiological analysis, calcium imaging, etc. Here, we have used a technique for isolating the IPA to investigate vascular responses in an organ bath setup. IPA segments were mounted on the organ bath chamber via intraluminal wires and stimulated by various pharmacological agents. The changes in IPA vascular tone (i.e., vasoconstriction and vasorelaxation), were recorded using an isometric force transducer and physiological data analysis software program. We implemented several experimental protocols, which can be adapted to investigate the mechanisms of vasorelaxation/vasoconstriction for studying the pharmacological activities of phytochemical or synthetic drugs. The protocols can also be used to evaluate drugs&#39; roles in modulating various diseases, including pulmonary arterial hypertension. The IPA model allows us to investigate the concentration-response curve, which is crucial in assessing drugs&#39; pharmacodynamic parameters.

Vascular responses of arterial pulmonary circulation can be explored using intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs). The present study describes the isolation of IPA in detail and the protocols used for investigating vasorelaxation in response to physiological stimuli.

Blu di un Evans ottimizzato protocollo per valutare la perdita vascolare nel topo

Riepilogo

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