Gli autori desiderano ringraziare Andy Poczobutt e Dr. Jori Leszczynski per il loro prezioso aiuto e le modifiche apportate a questo manoscritto.  Sostenuta da sovvenzioni ricevute dal cuore nazionale, polmone e Blood Institute (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 e HL095439 RO3) e il dipartimento degli affari dei veterani (recensione di merito).

Tutte le linee guida internazionali, nazionali e/o istituzionali applicabili per la cura e l'uso di animali (topi) sono state seguite negli esperimenti descritti in questo manoscritto.
Questo metodo utilizza topi adulti FVBN, età compresa tra 16-20 settimane, trovato per essere ottimale per gli scopi di questo studio. Giorno 1 include i passaggi 1-5 e 2 giorni include i passaggi 6-7 (Figura 1).
1. preparazione del materiale
<ol><li>Garantire un'adeguata disponibilità di siringhe sterili, monouso e aghi, se chetamina/xilazina è usato come anestetico (come consigliato). Se isoflurane è usata come anestetico, controllare la bombola dell'ossigeno e il livello del liquido di isoflurane per assicurarsi che non ci sono rifornimenti sufficienti per l'esperimento prima di iniziare. Inoltre, montare la punta conica circuiti respiratori e allegarli alla casella di induzione; fissare nuovi contenitori del carbone di legna per i circuiti di respirazione. Preparare la casella induzione attivando l'ossigeno e accertare che la seconda fase legge circa 50 psi.</li>
	<li>Accendere il rilievo di riscaldamento a 37 ° C.</li>
	<li>Preparare la sonda di temperatura rettale per la chirurgia.</li>
</ol>2. preparazione di Mouse
Questo passaggio include l'anestesia, depilazione e posizionamento (adulto FVBN topi-età 16-20 settimane).
<ol><li>Pesare i topi e registrare i pesi.</li>
	<li>Anestetizzare i topi.<ol>
<li>Amministrare la ketamina e xilazina IP (80-100 mg/kg e 7,5-16 mg/kg, rispettivamente). Tuttavia, si raccomanda di iniziare con basse dosi di ketamina e xilazina (circa 30 mg/kg e 6 mg/kg, rispettivamente).</li>
		<li>Mantenere l'anestesia con circa 0,1 - 0,25 volte iniziale dosi di chetamina/xilazina durante l'intervento chirurgico. Ketamina e xilazina erano degli agenti anestetici di scelta in questo studio particolare, come maggiore riproducibilità e capacità di sopravvivenza sono stati osservati. Degli agenti anestetici di scelta in altri studi possono essere trovati per essere diversi.  Se viene utilizzato l'isoflurano, mettere il mouse in un'aula di induzione e accendere isoflurano al 5%, fino a quando il mouse perde coscienza completa. Quindi utilizzare un musetto nasale fissato a isoflurane 1.5-2.5% per tutto il resto della procedura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monitorare i topi ogni 2-3 min di pizzico di punta per verificare la profondità appropriata dell'anestesia.</li>
	<li>Radere la zona ventrale del collo del mouse.</li>
	<li>Posizionare il mouse in una posizione supina sul pad preriscaldato. Fissare le zampe e i piedi del mouse alla superficie chirurgico con nastro adesivo.</li>
	<li>Posto lacrime artificiali unguento per gli occhi per evitare l'essiccazione durante la chirurgia.</li>
</ol>3. chirurgici dettagli
<ol><li>Praticare un'incisione di 1 cm nel collo proprio ventrale sopra la vena giugulare.</li>
	<li>Applicare una o due gocce di lidocaina (1-2%) nell'area di incisione per la gestione del dolore e per promuovere la vasodilatazione. Attendere 2 minuti per la lidocaina effettive.</li>
	<li>Esporre e isolare la vena giugulare interna destra tramite dissezione smussa. Legare la vena con sutura 4-0 e retrarre delicatamente alla fine rostrale della nave con una pinza emostatica. Tagliare un buco, utilizzando forbici bene, circa 3 mm inferiore o caudale alla cravatta, circa a metà strada attraverso il diametro della vena.</li>
	<li>Contrassegnare un catetere polivinilico PV-1 1,5 cm dall'estremità e inserirla nella vena giugulare attraverso il foro utilizzando un dilatatore e infilare il catetere verso l'estremità caudale della nave, circa 1,5 cm.</li>
	<li>Legare il catetere in modo sicuro all'interno della parte caudale della nave (sotto il taglio), con seta 4-0. Legare la parte rostrale del vaso verso l'esterno del catetere con le estremità della sutura che è stata usata per legare la vena giugulare rostrale, al punto 3.3.</li>
	<li>Aderenza alla pelle senza bloccare di nuovo insieme intorno al catetere con seta 4-0 per aiutare a prevenire la perdita di calore corporeo ed essiccazione dei tessuti.</li>
	<li>Collegare il catetere ad una siringa contenente soluzione fisiologica eparinata (10 U/mL) e irrorare il catetere.</li>
</ol>4. iniezioni
<ol><li>Iniettare la soluzione di blu di Evans (50 µ l di una soluzione di 30 mg/mL in soluzione salina normale, unheparinized 0,9% o circa 50 mg/kg) il catetere giugulare, seguito da un piccolo volume di soluzione fisiologica eparinizzata per svuotare la linea.</li>
	<li>2 min dopo, iniettare la sostanza P (100 μL di soluzione 0,3 μM in soluzione salina normale, unheparinized 0,9%, o 1 nmol/kg), seguita da un piccolo volume di soluzione fisiologica eparinizzata per svuotare la linea. Sostanza P aumenta lo stravaso di proteine plasmatiche attraverso lo strato endoteliale; in questo protocollo, ordinariamente induce un aumento dei valori di stravaso di plasma di circa 1,5 volte, rendendo al plasma stravaso valori più facile da misurare.</li>
	<li>Attendere 18 min dopo la sostanza P viene iniettato. Durante questo periodo, il colorante blu di Evans sarà equilibrare e circolare.</li>
	<li>Terminare l'esperimento 18 min dopo l'iniezione della sostanza P (20 min dopo l'iniezione di blu di Evans) sacrificando il mouse con dislocazione cervicale. È probabile che il mouse può essere direttamente cervicale slogato, senza prima dare un'overdose di anestetico, come il mouse è probabilmente ancora ben anestetizzati dalla chirurgia. Tuttavia, se è necessario, una dose eccessiva del anestetici chetamina/xilazina, isoflurano o pentobarbital può essere concesse, seguita da dislocazione cervicale.</li>
</ol>5. isolamento degli organi
<ol><li>Tagliati la cavità toracica del mouse e gravità-irrorare (da un'altezza di circa 51 cm o 20") il cuore e vasi sanguigni con 50 mL di citrato di sodio di 50 mM, pH 3.5. pH 3.5 conserva presumibilmente associazione blu di Evans all'albumina.</li>
	<li>Asportare organi pertinenti 1-5 (tessuti) con un bisturi per dissezione (ad es. la vescica urinaria, rene, stomaco, fegato, pancreas, prossimale o distale del colon, ileo, duodeno, fianco pelle, orecchie, coda, cuore e polmoni) e per rimuovere qualsiasi residuo, se presenti.</li>
	<li>Sciacquare gli organi a temperatura ambiente (TA) tampone fosfato salino (PBS; 1,44 g di Na2HPO4, 0,24 g di KH2PO4, 8,0 g di NaCl e 0,20 g di KCl in 1 L, pH 7.4).</li>
	<li>Asciugare gli organi con tessuto, tagliare ogni organo a metà e pesare ogni mezzo (bagnato pesi, in g).</li>
	<li>Asciughi uno metà del tessuto in un forno a 150 ° C, su pellicola, per 48 h.</li>
	<li>Posizionare l'altro tessuto metà in un volume costante (fino a 200 µ l) di formammide in una microfuge tube per 48 h (e fino a 72 h) per estrarre il blu di Evans.</li>
</ol>6. misurazione del tessuto OD
<ol><li>Rimuovere 50 µ l di Evans blue-infuso formammide (dopo incubazione di 48-72 h RT) dal tubo di microfuge e posto in un pozzetto di una piastra 96 pozzetti in polistirolo. Fare attenzione a non trasferire i pezzi di tessuto insieme la formammide.</li>
	<li>Mettere 50 µ l di formamide nuovo, puro in ciascuno dei due pozzetti vuoti della piastra 96 pozzetti per gli spazii in bianco.</li>
	<li>Misurare e registrare il OD620 di ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti su un lettore di piastra di assorbanza. 620 nm è la capacità di assorbimento max di blu di Evans.</li>
</ol>7. calcolo di stravaso di Plasma
<ol><li>Pesare il tessuto asciutto metà che è stata in forno per 48 h.</li>
	<li>Calcolare il rapporto di peso peso umido/a secco per l'organo specifico di interesse da ogni mouse individuali, a partire con il peso bagnato di questo tessuto metà (ottenuti nel punto 5.4), diviso per il peso a secco di questo tessuto stesso mezzo (ottenuti in punto 7.1).</li>
	<li>Calcolare il peso a secco (in g) del tessuto metà in formammide dividendo il peso bagnato del tessuto metà prima di esso è stato disposto in formammide (ottenuta al passaggio 5.4) dall'umido: rapporto di peso a secco per l'organo specifico di interesse (calcolato al punto 7.2).</li>
	<li>Calcolare i valori di620 OD rettificato . A partire con il OD620 valore da ogni pozzetto sperimentale della piastra 96 pozzetti (contenente formammide blu-infuso di Evans da ogni tessuto, ottenuto nel passaggio 6.3), sottrarre il valore vuoto del620 OD ben (il OD620 valore medio di i due pozzi contenente formammide pura, preparata al punto 6.2, OD620 valori ottenuti nel passaggio 6.3) da ogni valore sperimentale.</li>
	<li>Calcolare il valore di stravaso di plasma dividendo il corretto OD620 (calcolato nel passaggio 7.4) per il peso a secco del tessuto metà in formammide (calcolato in punto 7.3). Le unità di stravaso di plasma sarà il peso a secco OD620/g.</li>
	<li>Analizzare i dati ed espressa come media ± SEM. statisticamente confrontare i gruppi di test t o analisi unidirezionale della varianza e test di multiplo-confronto di Scheffe (lycofs01.lycoming.edu), come appropriato.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P.">Substance P.</a> Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).</li><li>Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+neutral+endopeptidase+attenuates+substance+P-induced+plasma+extravasation+in+the+guinea+pig+skin.">Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).</li><li>Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+and+epithelial+permeability+measurements+in+laboratory+animals.">Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals.</a> Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).</li><li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+assay+to+test+blood+vessel+permeability.">An in vivo assay to test blood vessel permeability.</a> J Vis Exp. (73), e50062 (2013).</li><li>Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+Evans+Blue+dye+as+a+marker+of+albumin+clearance+in+murine+models+of+acute+lung+injury.">Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury.</a> Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).</li><li>Figini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P+and+bradykinin+stimulate+plasma+extravasation+in+the+mouse+gastrointestinal+tract+and+pancreas.">Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas.</a> Am J Physiol. 272 (4), 785-793 (1997).</li><li>Awad, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+sphingosine+1-phosphate+1+receptor+activation+reduces+ischemia-reperfusion+injury+in+mouse+kidney.">Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).</li><li>Lu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+microvascular+permeability+and+blood+pressure+by+neutral+endopeptidase.">The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase.</a> Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).</li><li>Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D'Orleans-Juste, P., Regoli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+urotensin-II+enhances+plasma+extravasation+in+specific+vascular+districts+in+Wistar+rats.">Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).</li><li>Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+blood-retinal+barrier+breakdown+quantitation+using+Evans+blue.">Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).</li><li>Saria, A., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evans+blue+fluorescence:+quantitative+and+morphological+evaluation+of+vascular+permeability+in+animal+tissues.">Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues.</a> J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).</li><li>Fricke, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+neurogenesis+-+the+role+of+the+blood+brain+barrier+in+an+experimental+model+of+Parkinson's+disease.">In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis - the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson's disease.</a> Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).</li><li>Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+and+quantitation+of+vascular+permeability+in+vivo:+implications+for+drug+delivery.">Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery.</a> PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).</li><li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy.">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).</li><li>Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+vascular+permeability+and+lymphatic+drainage+using+labeled+serum+albumin.">Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin.</a> Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).</li><li>Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteinase+dysbalance+in+pathology:+the+neprilysin+(NEP)+and+angiotensin-converting+enzyme+(ACE)+families.">Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).</li><li>Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutral+endopeptidase+modulates+septic+shock.">Neutral endopeptidase modulates septic shock.</a> Ann N Y Acad Sci. 780, 156-163 (1996).</li><li>Dempsey, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neprilysin+null+mice+develop+exaggerated+pulmonary+vascular+remodeling+in+response+to+chronic+hypoxia.">Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia.</a> Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).</li><li>Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neprilysin+regulates+pulmonary+artery+smooth+muscle+cell+phenotype+through+a+platelet-derived+growth+factor+receptor-dependent+mechanism.">Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism.</a> Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).</li><li>Chu, P., Arber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin-section+detection+of+CD10+in+505+nonhematopoietic+neoplasms.+Frequent+expression+in+renal+cell+carcinoma+and+endometrial+stromal+sarcoma.">Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma.</a> Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).</li><li>Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD10+expression+in+urothelial+bladder+carcinomas:+a+pilot+study.">CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study.</a> Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).</li><li>Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+tumor+marker+for+bladder+cancer.">A new tumor marker for bladder cancer.</a> Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).</li><li>Wick, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+vascular+leak+in+neprilysin+transgenic+mice+with+complex+overexpression+pattern.">Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern.</a> Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).</li><li>Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+hypoxia+and+hyperthermia+on+the+permeability+of+the+blood-brain+barrier+in+adult+rats.">Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats.</a> J Appl Physiol. 107 (4), 1348-1356 (2009).</li><li>Scholzen, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutral+endopeptidase+terminates+substance+P-induced+inflammation+in+allergic+contact+dermatitis.">Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis.</a> J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Come discusso in precedenza, lo studio di stravaso di plasma può infine condurre a nuove conoscenze sulle cause di o nuovi modi per inibire o trattamento dello stravaso di plasma. Il riuscito uso del protocollo di stravaso di plasma (sopra), usando il colorante blu di Evans, è stato dimostrato nel manoscritto attuale. Anche se i dati riportati indietro l'ipotesi che la NEP può proteggere il sistema vascolare contro lo stravaso di plasma, questo è un obiettivo secondario attualmente, con l'obiettivo primario è di pre...

Perdita vascolare negli organi si riferisce allo stravaso, o perdita del plasma sanguigno attraverso le lacune prodotta nell'endotelio di post capillare venule negli organi. Questo stravaso di plasma o aumento della permeabilità vascolare, che può derivare da qualche tipo di risposta infiammatoria, può avere gravi conseguenze. Quindi, è importante che questo fenomeno, le cause, modulatori e conseguenze, sono studiate e capite, e allo stesso modo, che gli investigatori hanno una buona strumenti e protocolli con cui per studiarli. Le lacune endoteliale possono essere prodotto tramite una serie di stimoli, ma solitamente sono prodotte dall'azione di neurotrasmettitori peptidici e/o neurochinine sugli endoteli. Uno dei principali mediatori naturali di questo processo, che si traduce nello stravaso aumentati del plasma, è il neuropeptide tachykinin undecapeptide, la sostanza P1.
Metodi per indagare e misurare la permeabilità vascolare o stravaso di plasma, che utilizzano la proprietà di albumina-associazione di colorante blu di Evans, sono stati sviluppati e di solito sono noti per la loro precisione, semplicità, economia, sicurezza e capacità di consentire la determinazione di stravaso di plasma dai tessuti diversi in una sola volta, se così desidera il2,3,4,5,6,7,8,9 . Questo protocollo di blu di Evans per la valutazione dello stravaso di plasma negli organi dei topi FVBN utilizza tutti questi, ma aggiunge alcune importanti modifiche che lo rendono generalmente utile e adattabile per gli studi futuri, che coinvolge il laboratorio di medio che conduce o sarà condurre studi importanti dei fattori connessi con stravaso di plasma o permeabilità vascolare. In questo protocollo, la sostanza P è stato introdotto per i topi a 1 nmol/kg, che aumenta lo stravaso di plasma di 1,5 volte. Questo aumenta la sensibilità del protocollo, con conseguente risultati più facilmente osservabili e ottenibile. Altri fattori che influenzano la permeabilità, come vari altri peptidi, sostanze chimiche o alcune forme di lesione tossica, possono essere utilizzati o studiati da altri laboratori, come desiderato. Vena giugulare iniezioni sono utilizzate nel presente protocollo per introdurre il blu di Evans e sostanza P sistemica, che richiede un intervento chirurgico terminale. Tuttavia, vena giugulare iniezioni5,7,10, anche dopo un esame delle tecniche chirurgiche terminale necessarie, sono più facili da padroneggiare e portano alla produzione di risultati più coerenti rispetto altri iniezioni di venose, compresa la coda della vena iniezioni4,9. Anche se potrebbe essere possibile per il blu di Evans da consegnare tramite le iniezioni retro-orbitale del seno venoso, riferimenti nella letteratura non sono stati trovati che utilizzano questo metodo di consegna di blu di Evans. Tuttavia, per quanto riguarda le iniezioni di vena della coda, l'elevato grado di competenza e pratica riproducibile padroneggiare questa tecnica notevolmente limita l'impiego per successo iniezioni di blu di Evans. Al contrario, il metodo di iniezione della vena giugulare alternativo come descritto nel nostro protocollo, offre una soluzione tecnicamente ottenibile. Una procedura fondamentale per la perfusione delle vene del mouse, eseguita solo dopo il sacrificio del mouse irrorato di blu di Evans, rimuove l'eccesso di blu di Evans ed è stato standardizzato nel presente protocollo. Metodi precedentemente descritti di aspersione sono stati attentamente esaminati e modificati per ottenere la presente procedura. Altre modifiche descritte qui sono tutti ottimizzati, semplice e poco costoso.
Ci sono alcune importanti limitazioni del metodo del colorante blu di Evans. Ad esempio, bassa sensibilità a volte connessa con questo metodo potrebbe impedire alcuni ulteriore esame lordo di patologico ed istologico dei tessuti da animali iniettati blu di Evans. Tuttavia, queste e altre limitazioni hanno portato allo sviluppo di metodi alternativi e modelli che, comunque, ancora utilizzano il blu di Evans. La misurazione di blu di Evans di fluorescenza (piuttosto che di visual-gamma) spettroscopia può aumentare la sensibilità del metodo. Inoltre, microscopia di fluorescenza dei tessuti tinto di blu di Evans è stata sviluppata per consentire l'osservazione di perdita vascolare in più distinte posizioni11. Inoltre, corpo intero di imaging e la scansione di un animale vivo precedentemente iniettato con Evans blue12 consente di indagine delle concentrazioni di blu di Evans in modo continuo, piuttosto che ad uno specifico scelto tempo punto dell'esperimento. Tuttavia, questo metodo richiede la disponibilità di adeguate strutture di imaging e può essere molto costoso. Modifiche che coinvolgono Evans blu e si è esibito in un tipo in vitro di modello, come in una cella cultura o pulcino chorioallantoic modello13 (CAM) inoltre sono stati descritti. Questi modelli sono monitorati da fluorescenza e microscopia intravital14 e consentono la quantificazione dei cambiamenti di permeabilità vascolare nel corso del tempo, ma possono sollevare questioni per quanto riguarda la modellazione accurata delle condizioni in vivo e possono anche essere costoso.
Ci sono stati altri metodi sviluppati per determinare e quantificare la perdita vascolare o permeabilità, che non comportano la somministrazione di blu di Evans. Questi metodi possono impiegare una molecola fluorescente appropriata (ad esempio l'albumina o fluoresceina), o una molecola con tag isotopicamente etichettata o altrimenti, agli animali vivi (o alla cella cultura o chorioallantoic (CAM) modelli13, seguita da non-invasivo Imaging (scansione PET, MRI, microscopia intravital, scansione di tutto il corpo) o di imaging invasivo (microscopia fluorescente)3,12,15. Anche se queste tecniche possono offrire un numero di vantaggi sopra altri Evans metodi blu, hanno anche gli svantaggi, che possono includere il loro notevole complessità, necessaria esperienza, risorse e costi monetari alti.
Neprilisina16 (peptidasi enzima NEP, noto anche come CD10, MME o Enkephalinase) è stata suggerita per essere coinvolti nell'inibizione dello stravaso di plasma, almeno in parte, attraverso il metabolismo enzimatico e inattivazione di endogeno sostanza p. Così, nei tessuti in cui si verifica la peptidasi di superficie delle cellule NEP, ci può essere un'attenuazione dell'effetto della sostanza P, presumibilmente dall'attività della peptidasi di NEP.
Inizialmente, abbiamo testato per lo stravaso di plasma indotta da sostanza P che utilizzano questo protocollo modificato di blu di Evans, con FVBN wild type (WT) e topi knockout (KO) NEP. Coinvolgimento di NEP nello stravaso di plasma sostanza P-aumentata è stata ritenuta sospetto da questi studi iniziali, e Descriviamo questi ed ulteriori esperimenti ruolo di NEP coinvolgendo nello stravaso di plasma. Tuttavia, il focus di questo manoscritto non è NEP o il suo ruolo nello stravaso di plasma, ma piuttosto lo stravaso di plasma esperimenti stessi. I risultati di NEP sono rappresentativi del tipo di risultati che possono essere ottenuti attraverso l'uso di questo protocollo modificato. Il metodo di blu di Evans per misurare lo stravaso di plasma è stato ottimizzato e modificato, come descritto in dettaglio qui di seguito per i topi FVBN.

<table><tbody><tr><td>isoflurane</td><td>Vet One</td><td>200-070</td><td>inhaled anesthetic</td></tr><tr><td>ketamine</td><td>Vet One</td><td>200-055</td><td>injectable anesthetic</td></tr><tr><td>xylazine</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td><td>injectable anesthetic</td></tr><tr><td>syringes (10,3 &amp;amp; 1 cc)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604, 309657, 309659</td><td></td></tr><tr><td>needles (20G1,23G1 &amp;amp; 26G1/2)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305178, 305193, 305111</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane induction chamber</td><td>VetEquip</td><td>941443</td><td>1 Liter</td></tr><tr><td>nosecone breathing circuits&amp;nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>RC2</td><td>Rodent Circuit Controller 2</td></tr><tr><td>oxygen tank</td><td>Airgas</td><td>UN 1072</td><td>100% medical</td></tr><tr><td>heating pad</td><td>CWE Inc.</td><td>TC-1000</td><td>temperature controller</td></tr><tr><td>rectal temperature probe</td><td>CWE Inc.</td><td>10-09012</td><td>mouse</td></tr><tr><td>balance (for rodents)</td><td>Ohaus</td><td>CS 2000</td><td></td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>15000-00</td><td>Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11151-10</td><td>Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels)</td></tr><tr><td>surgical tools-hemostats</td><td>Fine Science tools</td><td>13009-12</td><td>Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue)</td></tr><tr><td>surgical tools -suture drivers</td><td>Fine Science tools</td><td>12502-12</td><td>Olsen-Hegar suture drivers (suturing)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11627-12</td><td>Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat)</td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14110-15</td><td>Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>18025-10</td><td>suture tying forceps (used for Millar cath)</td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14078-10</td><td>Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11254-20</td><td>Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection)</td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14082-09</td><td>Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11051-10</td><td>10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11251-35</td><td>Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels)</td></tr><tr><td>surgical tools-retractors</td><td>Fine Science tools</td><td>17012-11</td><td>Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11294-00</td><td>Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11297-00</td><td>Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection)</td></tr><tr><td>surgical tools-scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14058-11</td><td>tough cut iris scissors (mouse dissection, bones)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11009-13</td><td>serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat)</td></tr><tr><td>surgical tools-hemostats</td><td>Fine Science tools</td><td>13003-10</td><td>Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue)</td></tr><tr><td>surgical tools-forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11006-12</td><td>Adson serrated forceps (tissue grasping)</td></tr><tr><td>clippers</td><td>Oster</td><td>A5</td><td></td></tr><tr><td>tape</td><td>Fisherbrand</td><td>159015G</td><td></td></tr><tr><td>artificial tear ointment</td><td>Akorn Inc</td><td>13985-600-03</td><td></td></tr><tr><td>lidocaine</td><td>Hospira</td><td>0409-4277-01</td><td>2% injectable</td></tr><tr><td>polyvinyl catheters</td><td>Tygon</td><td>PV-1</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Substance P</td><td>Bachem&amp;nbsp;</td><td>H-1890</td><td></td></tr><tr><td>heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25201-400-10</td><td>1000 U/ml</td></tr><tr><td>saline solution</td><td>Hospira</td><td>0409-7138-09</td><td>0.9% sodium chloride</td></tr><tr><td>phenobarbital&amp;nbsp;</td><td>Vortech</td><td>0298-9373-68</td><td></td></tr><tr><td>sodium citrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-50TAB&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes for blotting</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47670</td><td></td></tr><tr><td>microbalance</td><td>Denver Instrument</td><td>APX-60</td><td></td></tr><tr><td>microfuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-534</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene 96 well plate</td><td>Becton Dickenson</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>absorbance plate reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>polyacrylamide gels</td><td>Bio-Rad</td><td>3450014&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>protein molecular weight standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Protran supported nitrocellulose</td><td>Amersham (GE)</td><td>10600015</td><td></td></tr><tr><td>gel box</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-1379</td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>primary NEP polyclonal antibody&amp;nbsp;</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>AF1182</td><td></td></tr><tr><td>doxycycline chow</td><td>Teklad (HARLAN)</td><td>TD.130750&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FVB/NJ wild type mice</td><td>Jackson</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>secondary antibody (goat anti-rabbit)</td><td>ZyMed</td><td>81-6120</td><td></td></tr><tr><td>ECL solution-Western Lightening Plus</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>film</td><td>Pierce</td><td>34091</td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse

Perdita vascolare, o lo stravaso di plasma, ha un certo numero di cause e può essere una conseguenza grave o sintomo di una risposta infiammatoria. Questo studio può infine condurre a nuove conoscenze sulle cause di o nuovi modi per inibire o trattamento dello stravaso di plasma. È importante che i ricercatori hanno gli strumenti adeguati, tra cui i migliori metodi disponibili, per lo studio di stravaso di plasma. In questo articolo, descriviamo un protocollo, utilizzando il metodo di colorante blu di Evans, per la valutazione dello stravaso di plasma negli organi dei topi FVBN. Questo protocollo è volutamente semplice, a come grande un grado possibile, ma fornisce dati di alta qualità. Blu di Evans è stato scelto principalmente perché è facile per il laboratorio di medio da utilizzare. Abbiamo utilizzato questo protocollo per fornire prove e supporto per l'ipotesi che l'enzima neprilisina può proteggere il sistema vascolare contro lo stravaso di plasma. Tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato sperimentalmente e facilmente adattato per l'uso in altri ceppi di topi o in altre specie, in molti diversi organi o tessuti, per gli studi che possono coinvolgere altri fattori che sono importanti per comprendere, prevenire o curare stravaso di plasma. Questo protocollo è stato ampiamente ottimizzato e modificato da protocolli esistenti e combina affidabilità, facilità d'uso, economia e disponibilità generale di materiali e attrezzature, rendendo questo protocollo superiore per il laboratorio di medio da utilizzare in quantificare lo stravaso di plasma da organi.

Nella Figura 1, è indicato uno schema della procedura, che è stato trovato per causare i valori di stravaso di plasma indotta da sostanza P più affidabili e coerenti da organi dei topi FVBN. Questa procedura richiede solitamente due giorni di lavoro, separati da almeno 48 ore di tempo di attesa. È possibile diffondere ancora di più, se questa operazione viene eseguita costantemente per tutti gli esperimenti da confrontare. Ad esempio, dopo che gli organi...

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse at JoVE.com

An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

In questo articolo, un protocollo semplice, economico e ottimizzato è descritto che utilizza il metodo di colorante blu di Evans per la valutazione dello stravaso di plasma negli organi dei topi FVBN che può essere adattato per l'uso in altre varietà, specie e altri organi o tessuti.

Blu di un Evans ottimizzato protocollo per valutare la perdita vascolare nel topo

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

an-optimized-evans-blue-protocol-to-assess-vascular-leak-in-the-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

26.3K Views.  University of Colorado Denver. In questo articolo, un protocollo semplice, economico e ottimizzato è descritto che utilizza il metodo di colorante blu di Evans per la valutazione dello stravaso di plasma negli organi dei topi FVBN che può essere adattato per l'uso in altre varietà, specie e altri organi o tessuti.

Video: An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Modello Rat di emato-encefalica Turbativa Barriera per consentire mirato Therapeutics neurovascolare

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Ricerca

Medicina

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

Un<em&gt; In vivo</em&gt; Test per la verifica della nave Permeabilità Sangue

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. Exposure to an allergen in a sensitized individual can result in clinical symptoms that vary from minor erythema to life threatening anaphylaxis. In the laboratory, various animal models have been developed to understand the mechanisms driving allergic responses. Herein, we describe a detailed method for measuring changes in vascular permeability to quantify localized allergic responses. The local anaphylaxis assay was first reported in the 1920s, and has been adapted from the technique published by Kojima et al. in 20071. In this assay, mice sensitized to OVA are challenged in the left ear with vehicle and in the right ear with OVA. This is followed by an intravenous injection of Evans Blue dye. Ten min after injecting Evans Blue, the animal is euthanized and the dye that has extravasated into the ears is extracted overnight in formamide. The absorbance of the extracted dye is then quantified with a spectrophotometer. This method reliably results in a visual and quantifiable manifestation of a local allergic response.

Allergic responses, characterized by the activation of mast cells and basophils, are driven by the cross-linking of IgE and release of proinflammatory mediators. A quantitative assessment of allergic responses can be achieved by using Evans Blue dye to monitor changes in vascular permeability after allergen challenge.

Misurare Anafilassi locali nei topi

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Immunologia e infezioni

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Utilizzando virus adeno-associati come strumento per studiare le barriere della retina nella malattia

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

This protocol describes the induction of an ischemia-reperfusion (IR) model on mouse ear skin using magnet clamping. Using a custom-built intravital imaging model, we study in vivo inflammatory responses post-reperfusion. The rationale behind the development of this technique is to extend the understanding of how leukocytes respond to skin IR injury.

Inducendo ischemia-riperfusione lesioni in Ear pelle mouse per intravitale Multiphoton Imaging delle risposte immunitarie

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke involves middle cerebral artery occlusion (MCAO). Infarct zone, brain edema and blood-brain barrier (BBB) breakdown are measured as parameters that reflect the extent of brain injury after MCAO. A significant limitation to this method is that these measurements are normally obtained in different rat brain samples, leading to ethical and financial burdens due to the large number of rats that need to be euthanized for an appropriate sample size. Here we present a method to accurately assess brain injury following MCAO by measuring infarct zone, brain edema and BBB permeability in the same set of rat brains. This novel technique provides a more efficient way to evaluate the pathophysiology of stroke.

This protocol describes a novel technique of measuring the three most important parameters of ischemic brain injury on the same set of rodent brain samples. Using only one brain sample is highly advantageous in terms of ethical and economic costs.

Misurazione dell'edema cerebrale post-ictus, della zona infarct e della rottura della barriera ematica-encefalica in un singolo set di campioni cerebrali dei roditori

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

Neuroscienze

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

In vivo Letture di lesioni vascolari nella retina del topo per promuovere la riproducibilità

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

<meta charset="utf8"></head><body>Un test di fluorescenza per valutare la permeabilità di una barriera endoteliale microvascolare cardiaca in un modello di ischemia/riperfusione di ratto

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Un test di fluorescenza per valutare la permeabilità di una barriera endoteliale microvascolare cardiaca in un modello di ischemia/riperfusione di ratto

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby the permeability of the endothelium to blood cells, plasma macromolecules, and water can be adapted according to the physiological need. In certain diseases, cytokines and growth factors are released that target the endothelial barrier to transiently increase vascular permeability; however, their prolonged presence may cause chronic vascular hyperpermeability and thereby tissue-damaging edema. The Miles assay is an in vivo technique that allows researchers to study vascular hyperpermeability through the proxy measurement of vascular leakage. Here, we provide a detailed protocol on how to perform this procedure in the mouse, which is the most widely used model organism to study mammalian physiology and pathology. The procedure involves the intravenous injection of Evans blue dye to label the circulating albumin followed by multiple intradermal injections of permeability-inducing agents and vehicle control solutions into opposing flanks of the mouse. Consequently, Evans blue dye gradually leaks into the dermis, where it accumulates and can be extracted for quantification as leakage induced by the permeability-inducing agent relative to the vehicle. The Miles assay can be performed in wild type or genetically modified mouse models and may be combined with drug administration to study molecular mechanisms that regulate vascular permeability and identify agents/targets capable of inducing or blocking hyperpermeability.

Here, we present a protocol to measure the vascular leakage induced by intradermal administration of permeability promoting agents into the murine skin. This technique can be used to determine the ability of molecules to promote or inhibit vascular leakage or to study the molecular mechanisms that regulate vascular permeability.

Valutazione vascolari agenti d'induzione Hyperpermeability nella pelle con il dosaggio di Miles

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

Blu di un Evans ottimizzato protocollo per valutare la perdita vascolare nel topo

Riepilogo

Esplora Altri Video

Modello Rat di emato-encefalica Turbativa Barriera per consentire mirato Therapeutics neurovascolare

Un

Misurare Anafilassi locali nei topi

Utilizzando virus adeno-associati come strumento per studiare le barriere della retina nella malattia

Inducendo ischemia-riperfusione lesioni in Ear pelle mouse per intravitale Multiphoton Imaging delle risposte immunitarie

Misurazione dell'edema cerebrale post-ictus, della zona infarct e della rottura della barriera ematica-encefalica in un singolo set di campioni cerebrali dei roditori

In vivo Letture di lesioni vascolari nella retina del topo per promuovere la riproducibilità

Un test di fluorescenza per valutare la permeabilità di una barriera endoteliale microvascolare cardiaca in un modello di ischemia/riperfusione di ratto

Un test di fluorescenza per valutare la permeabilità di una barriera endoteliale microvascolare cardiaca in un modello di ischemia/riperfusione di ratto

Valutazione vascolari agenti d'induzione Hyperpermeability nella pelle con il dosaggio di Miles