Name: high-resolution respirometry to measure mitochondrial function of intact beta cells in the presence of natural compounds
Uploaded: 2018-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
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Die Autoren möchten den Tessem und Hancock Labors für Assistenten und wissenschaftliche Diskussion danken. Die Autoren danken für die Bereitstellung der Kakao abgeleiteten Epicatechin Monomer Bruchteil Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech). Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Diabetes Action Research and Education Foundation, JST.

(1) Zellkultur
<ol><li>Kultur INS-1 abgeleitet 832/13 Betazellen RPMI 1640 ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol9,10,11 ,12,13.</li>
	<li>Entfernen Sie 832/13 Zellen aus einem T75 Kolben mit 2 mL von 0,25 % Trypsin, Inkubation bei 37 ° C für 10 min. neutralisieren Trypsin durch Zugabe von 8 mL komplette RPMI 1640 Medien.</li>
	<li>Zählen von Zellen mit einem Hemocytometer und 100 µL das Zellvolumen aus Schritt 1.2 in 900 µL PBS verdünnen.</li>
	<li>Platte 832/13 Zellen bei einer Dichte von 2 x 106 Zellen/mL in einem 6 Gericht gut.</li>
	<li>Zellkulturen für 48 h in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 vor Beginn der Atmung Experimente.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Zellen hochauflösender Respirometrie
<ol><li>
Behandlung von 832/13 Zellen mit Kakao abgeleiteten Epicatechin Monomer.
	<ol>
<li>Kulturzellen Sie 832/13 für 24 h nach der Beschichtung in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
		<li>Ändern Sie Medien 24 h nach Beschichtung und behandeln Sie 832/13 Zellen mit Fahrzeugkontrolle (3 Brunnen) oder 100 nM Kakao Monomer (3 Brunnen), gefolgt von Kultur für weitere 24 h (48 h insgesamt) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2zu.</li>
		<li>Waschen Sie 832/13 Zellen in 1 x niedrige Glukose Sekretion Testpuffer (SAB) für 5 min. Aspirat Puffer zu, und inkubieren Sie 832/13 Zellen in 1 x niedrige Glukose SAB für 3 h, 1 x niedrige Glukose SAB stündlich ändern.<ol>
<li>Stellen 10 X SAB mit 33,32 g NaCl, KCl, 0,82 g KH2PO4, 0,7 g MgSO4 1,73 g und H2O zu einem Endvolumen von 500 mL hinzufügen. Sterilfilter die endgültige Lösung.</li>
			<li>1 x niedrige Glukose SAB mit 10 mL 10 x SAB, 100 µL von 45 % Glucose, 2 mL 1 M HEPES, 1 mL von 0,25 M CaCl2, 0,57 mL 35 % BSA Lösung, 0,21 g Nahco33 machen und H2O zu einem Endvolumen von 100 mL hinzufügen. Sterilfilter die endgültige Lösung.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Behandlung von 832/13 Zellen mit Curcumin.
	<ol>
<li>Kulturzellen Sie 832/13 für 48 h nach der Beschichtung in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
		<li>Waschen Sie 832/13 Zellen in 1 x niedrige Glukose SAB für 5 min. Aspirat Puffer zu, und inkubieren Sie 832/13 Zellen in 1 x niedrige Glukose SAB für 3 h, 1 x niedrige Glukose SAB stündlich ändern.</li>
		<li>Aspirieren Sie nach 2,5 h 3 h Inkubation in 1 x niedrige Glukose SAB Puffer und inkubieren Sie Zellen in 1 x Low Glukose SAB mit Fahrzeugkontrolle oder 40 µM Curcumin für 30 min. Nach Inkubation Aspirieren des Puffers.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zellen mit Trypsin für hochauflösender Respirometrie Ernte
	<ol>
<li>Entfernen Sie nach 3 h Inkubation in 1 x niedrige Glukose SAB die Zellen aus der Platte mit 250 µL 0.25 % Trypsin pro Bohrloch.</li>
		<li>Kombinieren Sie die Zellen in Trypsin aus 3 Brunnen mit Fahrzeugkontrolle oder Verbindung von Interesse mit 4 mL SAB in einem 15 mL konische Röhrchen behandelt.</li>
		<li>Zählen von Zellen mit einem Hemocytometer und 100 µL das Zellvolumen aus Schritt 2.3.2 in 900 µL PBS verdünnen.</li>
		<li>Verdünnen Sie die entsprechende Anzahl von Zellen in 1 x niedrige Glukose SAB 3 mL bei der entsprechenden Konzentration für jede Kammer zu machen. Die Daten zeigen, dass eine Konzentration von 1 x 106 Zellen/mL am effektivsten ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zellen mit mechanischen Dissoziation für hochauflösender Respirometrie Ernte
	<ol>
<li>Nach 3 h Inkubation in 1 X niedrige Glukose SAB, fügen Sie 1 mL 1 X niedrige Glukose SAB zu jedem gut und sanft Zellen aus der Platte mit mechanischen Dissoziation durch Schlag mit einem 1000 µL Pipettenspitze pipettieren.</li>
		<li>Kombinieren Sie die Zellen aus 3 Brunnen mit Fahrzeugkontrolle oder zusammengesetzte Interesse an insgesamt 3 mL SAB in einem 15 mL konische Röhrchen für die Atmung behandelt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) hochauflösender Respirometrie
<ol><li>Erstellung von hochauflösenden Respirometer.
	<ol>
<li>Die hochauflösende Respirometer und eine Verbindung zum Desktop durch die Einführung der Respirometer-Analyse-Programm.</li>
		<li>70 % Ethanol aus beiden Kammern anzusaugen. Diese Kammern in 70 % igem Ethanol mindestens 45 Minuten lang einweichen.</li>
		<li>Waschen Sie die Kammern zweimal mit 70 % Ethanol, nach jedem Schritt absaugen.</li>
		<li>Waschen Sie die Kammern dreimal mit DdH2O, nach jedem Schritt absaugen.</li>
		<li>Spülen Sie die Kammer Kolben in DdH2O. Dies reinigt die restlichen Ethanol aus der Kolben und die Titan-Port.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibrierung der polarographischen Lambda-Sonden.
	<ol>
<li>Jede Oxygraph Kammer, unter ständigem Rühren den Puffer ständig mit magnetischen rühren Bars in der Kammer bei 750 u/min und 37 ° C mit einer Daten-Aufzeichnungsintervall bei 2,0 2,4 mL 1 x Low Glukose SAB Puffer hinzufügen s durch Drücken der F7-Taste und öffnen die Registerkarte mit der Bezeichnung "Systeme". Drücken Sie Kolben ganz hinein, und dann auf den Schraubenschlüssel Belüftung Einstellung zurücknehmen. Lassen Sie die Maschine equilibrate für ein Minimum von 1 Stunde bis stabile Sauerstoff Fluss erreicht ist.</li>
		<li>Stellen Sie die Maschine bei 37 ° C für die Dauer des Experiments. Stellen Sie Polarisation Spannung bis 800 mV, mit einem Gewinn von 2 durch Drücken der F7-Taste und öffnen die Registerkarte "Sauerstoff, O2". Equilibrate die Sauerstoffkonzentration des Puffers SAB für mindestens 30 min, während die Änderung der Sauerstoffkonzentration stabil ist (weniger als 2 pmol/(s*mL)).</li>
		<li>Wählen Sie nach Sauerstoff-Konzentration-Stabilisierung eine Region, wo die Änderung der Sauerstoffkonzentration stabile Hintergrundmessung des Wandels Sauerstoffkonzentration zu etablieren.<ol>
<li>Wählen Sie eine Region durch Drücken der Shift-Taste, Links-Klick auf die Maus und ziehen mit der Maus über den ausgewählten Bereich. Klicken Sie auf den Buchstaben der ausgewählten Region und Änderung "R1" für jede Spur, mit jedem der beiden Kammern entsprechend zugeordnet.</li>
			<li>Klicken Sie doppelt auf das "O2 Kalibrierung" Feld in der unteren linken und rechten Sie Ecken des Bildschirms, klicken Sie auf die "wählen Sie" für die "Luft-Kalibrierung" als R1 und wählen Sie dann "kalibrieren" und in die Zwischenablage kopieren"für beide Kammern.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Beurteilung der Atmung von 832/13 Beta-Zellen in den Schritten 2.1.5 oder 2.2.5 vorbereitet.
	<ol>
<li>Laden Sie 2,4 mL der Probe in jeder Kammer (eine Kammer mit Fahrzeug behandelt Kontrollzellen, eine Kammer mit zusammengesetzten behandelten Zellen) 1 X niedrige Glukose SAB Behalten Sie 0,5 mL der Zellprobe für Protein Quantifizierung von BCA (Bicinchoninic Säure) Assay, wenn den mechanische Dissoziation Ansatz (Einfrieren bei-20 ° C für die Messung später) zu verwenden.<ol>
<li>Kolben ganz einschieben und das Restvolumen Aspirieren. Rühren Sie die Zellen kontinuierlich während des Experiments bei 750 u/min und 37 ° C für alle weiteren Schritte. Machen Sie eine Markierung, indem Sie auf F4 und Kennzeichnung als "Zellen", wenn Proben geladen werden.</li>
			<li>Proben für 30 min zu messen. Wählen Sie nach Signal-Stabilisierung eine Region des Wandels im Sauerstoff-Konzentration, die niedrige Glukose-Bedingungen (2,5 mM Glukose) entspricht, wie in 3.2.3 beschrieben.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nachdem Signal Stabilisierung erreicht ist, fügen Sie 12,5 µL einer 45 % sterile Glucoselösung (16,7 mM Endkonzentration) in jeder Kammer durch das Titan Verladehafen mit einer Spritze. Machen Sie eine Markierung gemessen "Glukose" als in 3.3.1 beschrieben, wenn Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie Signal zu stabilisieren und Zellatmung aufzuzeichnen, bis ein stabile Sauerstoff-Fluss erreicht wird. Wählen Sie diese Region des Wandels in Sauerstoff-Konzentration, wie 3.2.3 beschrieben. Dies ist die 16,7 mM Glukose Lesung und stimulierende Bedingungen7entspricht.</li>
		<li>Nach dem Signal Stabilisierung erreicht ist fügen Sie 1 µL 5mM Oligomycin eine (2,5 µM Endkonzentration) in jeder Kammer durch die Ladeöffnung hinzu. Machen Sie eine Markierung gemessen "OligoA" als in 3.3.1 beschrieben, wenn Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie Signal zu stabilisieren und Zellatmung aufzuzeichnen, bis ein stabile Sauerstoff-Fluss erreicht wird. Wählen Sie diesen Bereich der Kurve wie in 3.2.3 beschrieben. Oligomycin A hemmt die ATP-Synthase und ist somit die einzige Sauerstoff Flussmittel auftretenden über Leck von Elektronen und nicht Oxidative Phosphorylierung7.</li>
		<li>Nach Signal Stabilisierung erreichen hinzufügen 1 mM FCCP in Schritten von 1 µL bis eine maximale Atemfrequenz hergestellt wird. Dies entspricht maximal abgekoppelt Atmung. Zwischen 3-4 µL ist FCCP ausreichend (1,5-2,0 µM Endkonzentration) maximale abgekoppelt Atmung INS-1 832/13 Zellen induzieren. Machen Sie eine Markierung mit der Bezeichnung "FCCP" wie unter 3.3.1 beschrieben, wenn Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie Signal zu stabilisieren und Zellatmung aufzuzeichnen, bis ein stabile Sauerstoff-Fluss erreicht wird. Wählen Sie diesen Bereich der Kurve wie in 3.2.3 beschrieben. FCCP ist ein abkoppeln Agent. So lassen sich abgekoppelt Atmung7messen.</li>
		<li>Nach Signal Stabilisierung erreichen fügen Sie 1 µL 5 mM Antimycin A (2,5 µM Endkonzentration hinzu) in jeder Kammer durch die Ladeöffnung. Machen Sie eine Markierung mit der Bezeichnung "AntiA" wie unter 3.3.1 beschrieben, wenn Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie Signal zu stabilisieren und Zellatmung aufzuzeichnen, bis ein stabile Sauerstoff-Fluss erreicht wird. Wählen Sie diesen Bereich der Kurve wie in 3.2.3 beschrieben. Hinweis: Antimycin A bindet Cytochrom C-Reduktase, Ubichinon Oxidation hemmt und blockiert alle Atmung. Dies ermöglicht es uns, Atmung7vollständig zu stoppen.</li>
	</ol></li>
	<li>Messzellen 832/13 Beta für Protein-Konzentration und Atmung-Normalisierung.
	<ol>
<li>Mit Hilfe der 0,5 mL der Probe beim Laden, Maßnahme Protein Probe mit der BCA Methode13beibehalten.</li>
		<li>Führen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung, ohne Verdünnung, nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 Beta-Zelle Atmung Berechnungen aus trypsiniert Zellen.<ol>
<li>Geben Sie die Anzahl der Zellen pro mL Einsatz im Test durch Drücken der F3-Taste der Respirometer-Analyse-Programm. Ändern Sie die Einheiten in Zellen/mL, geben Sie die zelluläre Konzentration ein und ändern Sie Medium, SAB</li>
		<li>Wählen Sie Hintergrund Lesungen, die Daten zu normieren, indem auswählen und eingeben in der O2 Kalibrierung Form wie in 3.2.3 beschrieben.</li>
		<li>Treffen Sie die Auswahl der Lesungen von 2,5 mM Glukose, 16,7 mM Glukose, Oligomycin A, FCCP und Antimycin A wie unter 3.3.1 beschrieben.</li>
		<li>Innerhalb der Respirometer-Analyse-Programm exportieren Sie die Messwerte für jede Kammer nach Eingabe Proteinkonzentration und wählen die entsprechenden Mittelwerte für jede Behandlung während der Atmung-Messung. Dies geschieht, indem Sie auf F2 und dann drücken die "Copy to Clipboard-Funktion". Die Daten für den Einsatz in andere Programme exportiert. Verwenden Sie die "O2 Hang neg." Werte für Berechnungen.</li>
		<li>Kompilieren Sie Daten für 3 bis 5 unabhängigen Läufe des Fahrzeugs Kontrollen behandelt und natürlichen behandelten Zellen Verbindungen, um den Effekt auf intakte Zellatmung von INS-1 832/13 Beta-Zellen zu bestimmen.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 Beta-Zelle Atmung Berechnungen von mechanisch getrennt Zellen.<ol>
<li>Geben Sie die Protein-Berechnungen von der BCA-Test durch Drücken der F3-Taste der Respirometer-Analyse-Programm. Ändern Sie die Einheiten in mg, geben Sie die BCA-Konzentration und verändern Medium, SAB</li>
		<li>Wählen Sie Hintergrund Lesungen, die Daten zu normieren, indem auswählen und eingeben in der O2 Kalibrierung Form wie in 3.2.3 beschrieben.</li>
		<li>Treffen Sie die Auswahl der Lesungen von 2,5 mM Glukose, 16,7 mM Glukose, Oligomycin A, FCCP und Antimycin A wie unter 3.3.1 beschrieben.</li>
		<li>Innerhalb der Respirometer-Analyse-Programm exportieren Sie die Messwerte für jede Kammer nach Eingabe Proteinkonzentration und wählen die entsprechenden Mittelwerte für jede Behandlung während der Atmung-Messung. Dies geschieht, indem Sie auf F2 und dann drücken die "Copy to Clipboard-Funktion". Die Daten für den Einsatz in andere Programme exportiert. Verwenden Sie die "O2 Hang neg." Werte für Berechnungen.</li>
		<li>Kompilieren Sie Daten für 3 bis 5 unabhängigen Läufe des Fahrzeugs Kontrollen behandelt und natürlichen behandelten Zellen Verbindungen, um den Effekt auf intakte Zellatmung von INS-1 832/13 Beta-Zellen zu bestimmen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Ziel dieses Protokolls ist mit hochauflösender Respirometrie Atemfrequenz in intakten pankreatischen Betazellen messen. Diese Methode ermöglicht die Messung der Reaktion der Beta-Zellen auf erhöhte Blutzuckerwerte. Das Protokoll ermöglicht auch die Vorbehandlung mit verschiedenen Verbindungen, wie in diesem Protokoll mit den natürlich vorkommenden Monomere Epicatechin oder Curcumin4,5gezeigt. Behandlung mit verschiedenen ...

Der primäre Zweck des Pankreas Beta-Zellen ist System Normoglycemia durch Glukose-stimulierten Insulinsekretion zu pflegen. Die Beta-Zellen spüren physiologische Veränderungen im zirkulierenden Glukose vor allem auf die geringe Affinität, hohe Kapazität Glukosetransporters GLUT2 (Glucose Transporter 2, Km 16,7 mM)1. Kreislauf Blutzuckerspiegel steigen, erleichtert diese Hochleistungs-Low-Affinität Transporter eine proportionale Zunahme der intrazellulären Glukose innerhalb der Beta-Zellen. Glukose wird durch Glykolyse, TCA-Zyklus (Tricarboxylic Säure Zyklus) und der mitochondrialen Atmung, was zu erhöhten zellulären ATP (Adenosin Triphosphat) metabolisiert. Die erhöhten ATP-Konzentration blockiert die ATP empfindliche K+ Kanäle, Membran-Depolarisation führt. Membran-Depolarisation bewirkt, dass die Öffnung der Spannung gated Ca2 + -Kanäle und anschließende Freisetzung Vesikel gebunden Insulin Granulat2. Beta-Zellen Dysfunktion ist ein Markenzeichen von Typ-2-Diabetes (T2D) und führt zu verringerte und schlecht kontrollierten Insulinsekretion und letztlich Beta-Zellen Tod3. Mechanismen, die Erhaltung oder Verbesserung der Beta-Zellfunktion konnte als Behandlung für T2D verwendet werden.
Studien belegen die positiven Auswirkungen des natürlich vorkommenden pflanzlichen Verbindungen auf die Bauchspeicheldrüse Beta-Zellen4. Diese Verbindungen haben ihre Wirkung durch steigende Beta-Zell-Proliferation, überleben oder Glukose-stimulierten Insulinsekretion. Als Beispiel haben jüngste Studien gezeigt, dass Monomere Epicatechin Glukose-stimulierten Insulinsekretion erhöht durch Erhöhung der mitochondrialen Atmung und Erhöhung der zellulären ATP5Ebenen. Daher zu verstehen, wie diese Verbindungen funktionelle Beta-Zellen steigern können Masse ist wichtig, diese Verbindungen als potenzielle Therapeutika nutzen können.
Zellatmung kann durch eine Reihe von Werkzeugen gemessen werden. Verwendung von hochauflösenden Respirometer kann für die Titration der chemische Modulatoren, eine permeabilized oder intakte Zelle Bevölkerung6. Dieses Tool ermöglicht die Zugabe von verschiedenen Verbindungen in verschiedenen Konzentrationen, wodurch eine Vielzahl von Informationen.
Da die innige Verbindung zwischen Glukose-Stoffwechsel und Beta-Zell-Funktion, sind Messungen der Zellatmung entscheidend. Messungen der Zellatmung können erfolgen mit permeabilized oder intakte Beta-Zellen, mit jeweils einen eigenen Satz von vor- und Nachteile7,8. Während Permeabilisierung der Betazellen werden verschiedene Aspekte der Elektronentransport-Kette messen kann, geschieht dies ohne Rücksicht auf den Mechanismus zur Induktion der Atmung in die Beta-Zellen, die Glukoseaufnahme und den Stoffwechsel. Daher ist die Verwendung von unpermeabilized Beta Zellatmung eine sehr nützliche Technik, um die Beta-Zellen als Reaktion auf verschiedene Blutzuckerspiegel, mit Sauerstoff-Verbrauch als das Auslesen zu bestimmen.
Diese Technik dient Sauerstoffverbrauch in intakten INS-1 Messen 832/13 Beta-Zellen abgeleitet. Diese Technik ermöglicht es uns, die Antwort von Beta-Zellen für unstimulatory Glukose Bedingungen (2,5 mM Glukose) bestimmen sowie stimulierende Glukose Bedingungen (16,7 mM Glukose). Während die unpermeabilized Zellen nicht erlauben, einzeln testen Komplex I, II oder III des Elektrons Transportkette, die Technik erlaubt Messungen der Umgang mit komplexen IV Hemmung (Oligomycin A) abgekoppelt Atmung (FCCP-Carbonyl Zyanid- 4-(Trifluormethoxy-) Phenylhydrazone), und vollständig gehemmt Atmung (Antimycin A). Diese Studie zeigt die Wirksamkeit zur Messung der Atmung in den intakten unpermeabilized pankreatischen Betazellen, sowie die Wirkung von zwei natürlich vorkommenden Verbindungen, Monomere Epicatechin und Curcumin, auf Beta Zellatmung.

<table><tbody><tr><td>O2k Core: Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Instrument for high-resolution respirometry</td></tr><tr><td>DatLab 6 Program</td><td>Oroboros Instruments</td><td>27141-01</td><td>Computer program for analysing high-reolution respirometry</td></tr><tr><td>INS-1 832/13 cell line</td><td>Duke University Medical Center</td><td>NONE</td><td>Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard</td></tr><tr><td>Curcumin</td><td>Sigma</td><td>C7727</td><td>Pre-treatment of beta cells</td></tr><tr><td>Cocoa epicatechin monomer</td><td>Virginia Polytechnic Institute and State University</td><td>NONE</td><td>Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>832/13 beta cell media</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>832/13 beta cell media component</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td>832/13 beta cell media component</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3662</td><td>832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Caisson</td><td>GLL01</td><td>832/13 beta cell media component</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td>832/13 beta cell media component</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>832/13 beta cell media component</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td>Component of 10x SAB buffer</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Component of 10x SAB buffer</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Component of 10x SAB buffer</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>Component of 10x SAB buffer</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose Solution</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Component of 1x SAB buffer</td></tr><tr><td>35% BSA Solution</td><td>Sigma</td><td>A7979</td><td>Component of 1x SAB buffer</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Component of 1x SAB buffer</td></tr><tr><td>200 proof ethanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td>Washing Oxygraph O2k Chambers</td></tr><tr><td>Oligomycin A</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>Chemicals for respiration assay</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>Chemicals for respiration assay</td></tr><tr><td>Anitmycin A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td>Chemicals for respiration assay</td></tr><tr><td>BCA Protein Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>23225</td><td>For determining protein concentration</td></tr></tbody></table>

high-resolution respirometry to measure mitochondrial function of intact beta cells in the presence of natural compounds

Hochauflösender Respirometrie ermöglicht die Messung des Sauerstoffverbrauchs von isolierten Mitochondrien, Zellen und Geweben. Beta-Zellen spielen eine wichtige Rolle im Körper durch die Kontrolle des Blutzuckerspiegels durch Insulin-Sekretion als Reaktion auf erhöhten Glukosekonzentration. Insulin-Sekretion wird durch Glukosestoffwechsel und die mitochondriale Atmung gesteuert. Daher unbedingt messen intakt Beta Zellatmung Beta-Zellfunktion zur Behandlung von Diabetes verbessern zu können. Mit intakt 832/13 INS-1 abgeleitet Betazellen messen wir den Effekt der Erhöhung der Glukosekonzentration auf die Zellatmung. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Beta Zellatmung in das Vorhandensein oder Fehlen von verschiedenen Verbindungen, so dass man die Wirkung der bestimmen messen Verbindungen auf intakte Zellatmung gegeben. Hier zeigen wir die Wirkung von zwei natürlich vorkommenden Verbindungen, Monomere Epicatechin und Curcumin, auf Beta Zellatmung unter Anwesenheit von niedrig (2,5 mM) "oder" hohe Glukose (16,7 mM) Bedingungen. Diese Technik kann verwendet werden, um die Wirkung der verschiedenen Verbindungen auf intakte Beta Zellatmung in Anwesenheit von unterschiedlichen Glukosekonzentration zu bestimmen.

INS-1 832/13 Beta-Zellen, die vorbereitet und geerntet wie im Protokoll beschrieben zeigen Modulation in Sauerstoff-Verbrauch anhand der verschiedenen chemischen Interventionen (Abb. 1A). Eine Zunahme der Atmung wird beobachtet werden, wenn die Glukosekonzentration auf 16,7 mM Glukose (Abbildung 1 b) erhöht wird. Atmung sinken, wenn die intakten Zellen mit Oligomycin A. behandelt werden Diese Atmung bekannt als Leck, definiert als die basale, nonphosphorylating...

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High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirkung der Glukose-vermittelte Änderungen an mitochondrialen Atmung im Beisein von Naturstoffe auf intakt 832/13 Beta-Zellen mit Hilfe hochauflösender Respirometrie messen.

Hochauflösender Respirometrie, mitochondriale Funktion intakt Beta-Zellen in Anwesenheit von Naturstoffen zu messen

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

high-resolution-respirometry-to-measure-mitochondrial-function-intact

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Aufrufe.  Brigham Young University. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirkung der Glukose-vermittelte Änderungen an mitochondrialen Atmung im Beisein von Naturstoffe auf intakt 832/13 Beta-Zellen mit Hilfe hochauflösender Respirometrie messen.

Serie: High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate the measurement of islet oxygen consumption using a 96-well microplate designed for the measurement of oxygen consumption in spheroids. In this assay, spheroid microplates are coated with a cell and tissue adhesive on the day prior to the assay. We utilize a small volume of adhesive solution to encourage islet adherence to only the bottom of the well. On the day of the assay, 15 islets are loaded directly into the base of each well using a technique that ensures optimal positioning of islets and accurate measurement of oxygen consumption. Various aspects of mitochondrial respiration are probed pharmacologically in non-human primate islets, including ATP-dependent respiration, maximal respiration, and proton leak. This method allows for consistent, reproducible results using only a small number of islets per well. It can theoretically be applied to any cultured spheroids of similar size.

This protocol demonstrates the accurate and reproducible measurement of oxygen consumption in non-human primate pancreatic islets. The islet loading techniques and coating of the microplate provide a framework for efficient measurement of respiration in other types of cultured spheroids.

Analyse des Sauerstoffverbrauchs der nichtmenschlichen Primaten-Pankreas-Islet

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate ...

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple causes, including autoimmune diseases, diabetes, infections, inherited disorders, and tumors. Assessing mitochondrial function in mouse peripheral nerves can be challenging due to the small sample size, a limited number of mitochondria present in the tissue, and the presence of a myelin sheath. The technique described in this work minimizes these challenges by using a unique permeabilization protocol adapted from one used for muscle fibers, to assess sciatic nerve mitochondrial function instead of isolating the mitochondria from the tissue. By measuring fluorimetric reactive species production with Amplex Red/Peroxidase and comparing different mitochondrial substrates and inhibitors in saponin-permeabilized nerves, it was possible to detect mitochondrial respiratory states, reactive oxygen species (ROS), and the activity of mitochondrial complexes simultaneously. Therefore, the method presented here offers advantages compared to the assessment of mitochondrial function by other techniques.

High-resolution respirometry coupled to fluorescence sensors determines mitochondrial oxygen consumption and reactive oxygen species (ROS) generation. The present protocol describes a technique to assess mitochondrial respiratory rates and ROS production in the permeabilized sciatic nerve.

Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

Biochemie

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Medizin

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Biologie

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Bestimmung der Atmung in menschlichen Spermien durch hochauflösende Respirometrie

High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa

Semen quality is often studied by routine semen analysis, which is descriptive and often inconclusive. Male infertility is associated with altered sperm mitochondrial activity, so the measurement of sperm mitochondrial function is an indicator of sperm quality. High-resolution respirometry is a method of measuring the oxygen consumption of cells or tissues in a closed-chamber system. This technique can be implemented to measure respiration in human sperm and provides information about the quality and integrity of the sperm mitochondria. High-resolution respirometry allows the cells to move freely, which is an a priori advantage in the case of sperm. This technique can be applied with intact or permeabilized spermatozoa and allows for the study of intact sperm mitochondrial function and the activity of individual respiratory chain complexes. The high-resolution oxygraph instrument uses sensors to measure the oxygen concentration coupled with sensitive software to calculate the oxygen consumption. The data are used to calculate respiratory indices based on the oxygen consumption ratios. Consequently, the indices are the proportions of two oxygen consumption rates and are internally normalized to the cell number or protein mass. The respiratory indices are an indicator of sperm mitochondrial function and dysfunction.

Autor im Rampenlicht: Förderung der Forschung zur männlichen Unfruchtbarkeit durch Entschlüsselung des Spermienstoffwechsels und der mitochondrialen Funktion 

The analysis of sperm mitochondrial function by high-resolution respirometry permits the measurement of the oxygen consumption of freely moving spermatozoa in a closed-chamber system. The technique can be applied to measure respiration in human spermatozoa, which provides information on sperm mitochondrial characteristics and integrity.

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Mitochondrienfunktion in menschlichen Spermien

Semen quality is often studied by routine semen analysis, which is descriptive and often inconclusive. Male infertility is associated with altered sperm ...

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and assessment of respiratory complexes using diversified substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protocols. Here, the usage of two high-resolution respirometry devices is demonstrated, and a basic collection of protocols applicable for the analysis of cultured cells, skeletal and heart muscle fibers, and soft tissues such as the brain and liver are presented. Protocols for cultured cells and tissues are provided for a chamber-based respirometer and cultured cells for a microplate-based respirometer, both encompassing standard respiration protocols. For comparative purposes, CRISPR-engineered HEK293 cells deficient in mitochondrial translation causing multiple respiratory system deficiency are used with both devices to demonstrate cellular defects in respiration. Both respirometers allow for comprehensive measurement of cellular respiration with their respective technical merits and suitability dependent on the research question and model under study.

Assessing oxidative phosphorylation using high-resolution respirometers has become an integral part of the functional analysis of mitochondria and cellular energy metabolism. Here, we present protocols for the analysis of cellular energy metabolism using chamber and microplate-based high-resolution respirometers and discuss the key benefits of each device.

Hochauflösender Respirometrie, mitochondriale Funktion intakt Beta-Zellen in Anwesenheit von Naturstoffen zu messen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Analyse des Sauerstoffverbrauchs der nichtmenschlichen Primaten-Pankreas-Islet

Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Mitochondrienfunktion in menschlichen Spermien

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Mitochondrienfunktion in menschlichen Spermien

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Mitochondrienfunktion in menschlichen Spermien

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Bioenergetik in Zellen und Geweben mittels kammer- und plattenbasierter Respirometer