Die Autoren möchten den Tessem und Hancock Labors für Assistenten und wissenschaftliche Diskussion danken. Die Autoren danken für die Bereitstellung der Kakao abgeleiteten Epicatechin Monomer Bruchteil Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech). Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Diabetes Action Research and Education Foundation, JST.

(1) Zellkultur
<ol><li>Kultur INS-1 abgeleitet 832/13 Betazellen RPMI 1640 ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol9,10,11 ,12,13.</li>
	<li>Entfernen Sie 832/13 Zellen aus einem T75 Kolben mit 2 mL von 0,25 % Trypsin, Inkubation bei 37 ° C für 10 min. neutralisieren Trypsin durch Zugabe von 8 mL komplette RPMI 1640 Medien.</li>
	<li>Zählen von Zellen mit einem Hemocytometer und 100 µL das Zellvolumen aus Schritt 1.2 in 900 µL PBS verdünnen.</li>
	<li>Platte 832/13 Zellen bei einer Dichte von 2 x 106 Zellen/mL in einem 6 Gericht gut.</li>
	<li>Zellkulturen für 48 h in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 vor Beginn der Atmung Experimente.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Zellen hochauflösender Respirometrie
<ol><li>
Behandlung von 832/13 Zellen mit Kakao abgeleiteten Epicatechin Monomer.
	<ol>
<li>Kulturzellen Sie 832/13 für 24 h nach der Beschichtung in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
		<li>Ändern Sie Medien 24 h nach Beschichtung und behandeln Sie 832/13 Zellen mit Fahrzeugkontrolle (3 Brunnen) oder 100 nM Kakao Monomer (3 Brunnen), gefolgt von Kultur für weitere 24 h (48 h insgesamt) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2zu.</li>
		<li>Waschen Sie 832/13 Zellen in 1 x niedrige Glukose Sekretion Testpuffer (SAB) für 5 min. Aspirat Puffer zu, und inkubieren Sie 832/13 Zellen in 1 x niedrige Glukose SAB für 3 h, 1 x niedrige Glukose SAB stündlich ändern.<ol>
<li>Stellen 10 X SAB mit 33,32 g NaCl, KCl, 0,82 g KH2PO4, 0,7 g MgSO4 1,73 g und H2O zu einem Endvolumen von 500 mL hinzufügen. Sterilfilter die endgültige Lösung.</li>
			<li>1 x niedrige Glukose SAB mit 10 mL 10 x SAB, 100 µL von 45 % Glucose, 2 mL 1 M HEPES, 1 mL von 0,25 M CaCl2, 0,57 mL 35 % BSA Lösung, 0,21 g Nahco33 machen und H2O zu einem Endvolumen von 100 mL hinzufügen. Sterilfilter die endgültige Lösung.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Behandlung von 832/13 Zellen mit Curcumin.
	<ol>
<li>Kulturzellen Sie 832/13 für 48 h nach der Beschichtung in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
		<li>Waschen Sie 832/13 Zellen in 1 x niedrige Glukose SAB für 5 min. Aspirat Puffer zu, und inkubieren Sie 832/13 Zellen in 1 x niedrige Glukose SAB für 3 h, 1 x niedrige Glukose SAB stündlich ändern.</li>
		<li>Aspirieren Sie nach 2,5 h 3 h Inkubation in 1 x niedrige Glukose SAB Puffer und inkubieren Sie Zellen in 1 x Low Glukose SAB mit Fahrzeugkontrolle oder 40 µM Curcumin für 30 min. Nach Inkubation Aspirieren des Puffers.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zellen mit Trypsin für hochauflösender Respirometrie Ernte
	<ol>
<li>Entfernen Sie nach 3 h Inkubation in 1 x niedrige Glukose SAB die Zellen aus der Platte mit 250 µL 0.25 % Trypsin pro Bohrloch.</li>
		<li>Kombinieren Sie die Zellen in Trypsin aus 3 Brunnen mit Fahrzeugkontrolle oder Verbindung von Interesse mit 4 mL SAB in einem 15 mL konische Röhrchen behandelt.</li>
		<li>Zählen von Zellen mit einem Hemocytometer und 100 µL das Zellvolumen aus Schritt 2.3.2 in 900 µL PBS verdünnen.</li>
		<li>Verdünnen Sie die entsprechende Anzahl von Zellen in 1 x niedrige Glukose SAB 3 mL bei der entsprechenden Konzentration für jede Kammer zu machen. Die Daten zeigen, dass eine Konzentration von 1 x 106 Zellen/mL am effektivsten ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zellen mit mechanischen Dissoziation für hochauflösender Respirometrie Ernte
	<ol>
<li>Nach 3 h Inkubation in 1 X niedrige Glukose SAB, fügen Sie 1 mL 1 X niedrige Glukose SAB zu jedem gut und sanft Zellen aus der Platte mit mechanischen Dissoziation durch Schlag mit einem 1000 µL Pipettenspitze pipettieren.</li>
		<li>Kombinieren Sie die Zellen aus 3 Brunnen mit Fahrzeugkontrolle oder zusammengesetzte Interesse an insgesamt 3 mL SAB in einem 15 mL konische Röhrchen für die Atmung behandelt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) hochauflösender Respirometrie
<ol><li>Erstellung von hochauflösenden Respirometer.
	<ol>
<li>Die hochauflösende Respirometer und eine Verbindung zum Desktop durch die Einführung der Respirometer-Analyse-Programm.</li>
		<li>70 % Ethanol aus beiden Kammern anzusaugen. Diese Kammern in 70 % igem Ethanol mindestens 45 Minuten lang einweichen.</li>
		<li>Waschen Sie die Kammern zweimal mit 70 % Ethanol, nach jedem Schritt absaugen.</li>
		<li>Waschen Sie die Kammern dreimal mit DdH2O, nach jedem Schritt absaugen.</li>
		<li>Spülen Sie die Kammer Kolben in DdH2O. Dies reinigt die restlichen Ethanol aus der Kolben und die Titan-Port.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibrierung der polarographischen Lambda-Sonden.
	<ol>
<li>Jede Oxygraph Kammer, unter ständigem Rühren den Puffer ständig mit magnetischen rühren Bars in der Kammer bei 750 u/min und 37 ° C mit einer Daten-Aufzeichnungsintervall bei 2,0 2,4 mL 1 x Low Glukose SAB Puffer hinzufügen s durch Drücken der F7-Taste und öffnen die Registerkarte mit der Bezeichnung "Systeme". Drücken Sie Kolben ganz hinein, und dann auf den Schraubenschlüssel Belüftung Einstellung zurücknehmen. Lassen Sie die Maschine equilibrate für ein Minimum von 1 Stunde bis stabile Sauerstoff Fluss erreicht ist.</li>
		<li>Stellen Sie die Maschine bei 37 ° C für die Dauer des Experiments. Stellen Sie Polarisation Spannung bis 800 mV, mit einem Gewinn von 2 durch Drücken der F7-Taste und öffnen die Registerkarte "Sauerstoff, O2". Equilibrate die Sauerstoffkonzentration des Puffers SAB für mindestens 30 min, während die Änderung der Sauerstoffkonzentration stabil ist (weniger als 2 pmol/(s*mL)).</li>
		<li>Wählen Sie nach Sauerstoff-Konzentration-Stabilisierung eine Region, wo die Änderung der Sauerstoffkonzentration stabile Hintergrundmessung des Wandels Sauerstoffkonzentration zu etablieren.<ol>
<li>Wählen Sie eine Region durch Drücken der Shift-Taste, Links-Klick auf die Maus und ziehen mit der Maus über den ausgewählten Bereich. Klicken Sie auf den Buchstaben der ausgewählten Region und Änderung "R1" für jede Spur, mit jedem der beiden Kammern entsprechend zugeordnet.</li>
			<li>Klicken Sie doppelt auf das "O2 Kalibrierung" Feld in der unteren linken und rechten Sie Ecken des Bildschirms, klicken Sie auf die "wählen Sie" für die "Luft-Kalibrierung" als R1 und wählen Sie dann "kalibrieren" und in die Zwischenablage kopieren"für beide Kammern.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Beurteilung der Atmung von 832/13 Beta-Zellen in den Schritten 2.1.5 oder 2.2.5 vorbereitet.
	<ol>
<li>Laden Sie 2,4 mL der Probe in jeder Kammer (eine Kammer mit Fahrzeug behandelt Kontrollzellen, eine Kammer mit zusammengesetzten behandelten Zellen) 1 X niedrige Glukose SAB Behalten Sie 0,5 mL der Zellprobe für Protein Quantifizierung von BCA (Bicinchoninic Säure) Assay, wenn den mechanische Dissoziation Ansatz (Einfrieren bei-20 ° C für die Messung später) zu verwenden.<ol>
<li>Kolben ganz einschieben und das Restvolumen Aspirieren. Rühren Sie die Zellen kontinuierlich während des Experiments bei 750 u/min und 37 ° C für alle weiteren Schritte. Machen Sie eine Markierung, indem Sie auf F4 und Kennzeichnung als "Zellen", wenn Proben geladen werden.</li>
			<li>Proben für 30 min zu messen. Wählen Sie nach Signal-Stabilisierung eine Region des Wandels im Sauerstoff-Konzentration, die niedrige Glukose-Bedingungen (2,5 mM Glukose) entspricht, wie in 3.2.3 beschrieben.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nachdem Signal Stabilisierung erreicht ist, fügen Sie 12,5 µL einer 45 % sterile Glucoselösung (16,7 mM Endkonzentration) in jeder Kammer durch das Titan Verladehafen mit einer Spritze. Machen Sie eine Markierung gemessen "Glukose" als in 3.3.1 beschrieben, wenn Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie Signal zu stabilisieren und Zellatmung aufzuzeichnen, bis ein stabile Sauerstoff-Fluss erreicht wird. Wählen Sie diese Region des Wandels in Sauerstoff-Konzentration, wie 3.2.3 beschrieben. Dies ist die 16,7 mM Glukose Lesung und stimulierende Bedingungen7entspricht.</li>
		<li>Nach dem Signal Stabilisierung erreicht ist fügen Sie 1 µL 5mM Oligomycin eine (2,5 µM Endkonzentration) in jeder Kammer durch die Ladeöffnung hinzu. Machen Sie eine Markierung gemessen "OligoA" als in 3.3.1 beschrieben, wenn Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie Signal zu stabilisieren und Zellatmung aufzuzeichnen, bis ein stabile Sauerstoff-Fluss erreicht wird. Wählen Sie diesen Bereich der Kurve wie in 3.2.3 beschrieben. Oligomycin A hemmt die ATP-Synthase und ist somit die einzige Sauerstoff Flussmittel auftretenden über Leck von Elektronen und nicht Oxidative Phosphorylierung7.</li>
		<li>Nach Signal Stabilisierung erreichen hinzufügen 1 mM FCCP in Schritten von 1 µL bis eine maximale Atemfrequenz hergestellt wird. Dies entspricht maximal abgekoppelt Atmung. Zwischen 3-4 µL ist FCCP ausreichend (1,5-2,0 µM Endkonzentration) maximale abgekoppelt Atmung INS-1 832/13 Zellen induzieren. Machen Sie eine Markierung mit der Bezeichnung "FCCP" wie unter 3.3.1 beschrieben, wenn Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie Signal zu stabilisieren und Zellatmung aufzuzeichnen, bis ein stabile Sauerstoff-Fluss erreicht wird. Wählen Sie diesen Bereich der Kurve wie in 3.2.3 beschrieben. FCCP ist ein abkoppeln Agent. So lassen sich abgekoppelt Atmung7messen.</li>
		<li>Nach Signal Stabilisierung erreichen fügen Sie 1 µL 5 mM Antimycin A (2,5 µM Endkonzentration hinzu) in jeder Kammer durch die Ladeöffnung. Machen Sie eine Markierung mit der Bezeichnung "AntiA" wie unter 3.3.1 beschrieben, wenn Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie Signal zu stabilisieren und Zellatmung aufzuzeichnen, bis ein stabile Sauerstoff-Fluss erreicht wird. Wählen Sie diesen Bereich der Kurve wie in 3.2.3 beschrieben. Hinweis: Antimycin A bindet Cytochrom C-Reduktase, Ubichinon Oxidation hemmt und blockiert alle Atmung. Dies ermöglicht es uns, Atmung7vollständig zu stoppen.</li>
	</ol></li>
	<li>Messzellen 832/13 Beta für Protein-Konzentration und Atmung-Normalisierung.
	<ol>
<li>Mit Hilfe der 0,5 mL der Probe beim Laden, Maßnahme Protein Probe mit der BCA Methode13beibehalten.</li>
		<li>Führen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung, ohne Verdünnung, nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 Beta-Zelle Atmung Berechnungen aus trypsiniert Zellen.<ol>
<li>Geben Sie die Anzahl der Zellen pro mL Einsatz im Test durch Drücken der F3-Taste der Respirometer-Analyse-Programm. Ändern Sie die Einheiten in Zellen/mL, geben Sie die zelluläre Konzentration ein und ändern Sie Medium, SAB</li>
		<li>Wählen Sie Hintergrund Lesungen, die Daten zu normieren, indem auswählen und eingeben in der O2 Kalibrierung Form wie in 3.2.3 beschrieben.</li>
		<li>Treffen Sie die Auswahl der Lesungen von 2,5 mM Glukose, 16,7 mM Glukose, Oligomycin A, FCCP und Antimycin A wie unter 3.3.1 beschrieben.</li>
		<li>Innerhalb der Respirometer-Analyse-Programm exportieren Sie die Messwerte für jede Kammer nach Eingabe Proteinkonzentration und wählen die entsprechenden Mittelwerte für jede Behandlung während der Atmung-Messung. Dies geschieht, indem Sie auf F2 und dann drücken die "Copy to Clipboard-Funktion". Die Daten für den Einsatz in andere Programme exportiert. Verwenden Sie die "O2 Hang neg." Werte für Berechnungen.</li>
		<li>Kompilieren Sie Daten für 3 bis 5 unabhängigen Läufe des Fahrzeugs Kontrollen behandelt und natürlichen behandelten Zellen Verbindungen, um den Effekt auf intakte Zellatmung von INS-1 832/13 Beta-Zellen zu bestimmen.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 Beta-Zelle Atmung Berechnungen von mechanisch getrennt Zellen.<ol>
<li>Geben Sie die Protein-Berechnungen von der BCA-Test durch Drücken der F3-Taste der Respirometer-Analyse-Programm. Ändern Sie die Einheiten in mg, geben Sie die BCA-Konzentration und verändern Medium, SAB</li>
		<li>Wählen Sie Hintergrund Lesungen, die Daten zu normieren, indem auswählen und eingeben in der O2 Kalibrierung Form wie in 3.2.3 beschrieben.</li>
		<li>Treffen Sie die Auswahl der Lesungen von 2,5 mM Glukose, 16,7 mM Glukose, Oligomycin A, FCCP und Antimycin A wie unter 3.3.1 beschrieben.</li>
		<li>Innerhalb der Respirometer-Analyse-Programm exportieren Sie die Messwerte für jede Kammer nach Eingabe Proteinkonzentration und wählen die entsprechenden Mittelwerte für jede Behandlung während der Atmung-Messung. Dies geschieht, indem Sie auf F2 und dann drücken die "Copy to Clipboard-Funktion". Die Daten für den Einsatz in andere Programme exportiert. Verwenden Sie die "O2 Hang neg." Werte für Berechnungen.</li>
		<li>Kompilieren Sie Daten für 3 bis 5 unabhängigen Läufe des Fahrzeugs Kontrollen behandelt und natürlichen behandelten Zellen Verbindungen, um den Effekt auf intakte Zellatmung von INS-1 832/13 Beta-Zellen zu bestimmen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Ziel dieses Protokolls ist mit hochauflösender Respirometrie Atemfrequenz in intakten pankreatischen Betazellen messen. Diese Methode ermöglicht die Messung der Reaktion der Beta-Zellen auf erhöhte Blutzuckerwerte. Das Protokoll ermöglicht auch die Vorbehandlung mit verschiedenen Verbindungen, wie in diesem Protokoll mit den natürlich vorkommenden Monomere Epicatechin oder Curcumin4,5gezeigt. Behandlung mit verschiedenen ...

Der primäre Zweck des Pankreas Beta-Zellen ist System Normoglycemia durch Glukose-stimulierten Insulinsekretion zu pflegen. Die Beta-Zellen spüren physiologische Veränderungen im zirkulierenden Glukose vor allem auf die geringe Affinität, hohe Kapazität Glukosetransporters GLUT2 (Glucose Transporter 2, Km 16,7 mM)1. Kreislauf Blutzuckerspiegel steigen, erleichtert diese Hochleistungs-Low-Affinität Transporter eine proportionale Zunahme der intrazellulären Glukose innerhalb der Beta-Zellen. Glukose wird durch Glykolyse, TCA-Zyklus (Tricarboxylic Säure Zyklus) und der mitochondrialen Atmung, was zu erhöhten zellulären ATP (Adenosin Triphosphat) metabolisiert. Die erhöhten ATP-Konzentration blockiert die ATP empfindliche K+ Kanäle, Membran-Depolarisation führt. Membran-Depolarisation bewirkt, dass die Öffnung der Spannung gated Ca2 + -Kanäle und anschließende Freisetzung Vesikel gebunden Insulin Granulat2. Beta-Zellen Dysfunktion ist ein Markenzeichen von Typ-2-Diabetes (T2D) und führt zu verringerte und schlecht kontrollierten Insulinsekretion und letztlich Beta-Zellen Tod3. Mechanismen, die Erhaltung oder Verbesserung der Beta-Zellfunktion konnte als Behandlung für T2D verwendet werden.
Studien belegen die positiven Auswirkungen des natürlich vorkommenden pflanzlichen Verbindungen auf die Bauchspeicheldrüse Beta-Zellen4. Diese Verbindungen haben ihre Wirkung durch steigende Beta-Zell-Proliferation, überleben oder Glukose-stimulierten Insulinsekretion. Als Beispiel haben jüngste Studien gezeigt, dass Monomere Epicatechin Glukose-stimulierten Insulinsekretion erhöht durch Erhöhung der mitochondrialen Atmung und Erhöhung der zellulären ATP5Ebenen. Daher zu verstehen, wie diese Verbindungen funktionelle Beta-Zellen steigern können Masse ist wichtig, diese Verbindungen als potenzielle Therapeutika nutzen können.
Zellatmung kann durch eine Reihe von Werkzeugen gemessen werden. Verwendung von hochauflösenden Respirometer kann für die Titration der chemische Modulatoren, eine permeabilized oder intakte Zelle Bevölkerung6. Dieses Tool ermöglicht die Zugabe von verschiedenen Verbindungen in verschiedenen Konzentrationen, wodurch eine Vielzahl von Informationen.
Da die innige Verbindung zwischen Glukose-Stoffwechsel und Beta-Zell-Funktion, sind Messungen der Zellatmung entscheidend. Messungen der Zellatmung können erfolgen mit permeabilized oder intakte Beta-Zellen, mit jeweils einen eigenen Satz von vor- und Nachteile7,8. Während Permeabilisierung der Betazellen werden verschiedene Aspekte der Elektronentransport-Kette messen kann, geschieht dies ohne Rücksicht auf den Mechanismus zur Induktion der Atmung in die Beta-Zellen, die Glukoseaufnahme und den Stoffwechsel. Daher ist die Verwendung von unpermeabilized Beta Zellatmung eine sehr nützliche Technik, um die Beta-Zellen als Reaktion auf verschiedene Blutzuckerspiegel, mit Sauerstoff-Verbrauch als das Auslesen zu bestimmen.
Diese Technik dient Sauerstoffverbrauch in intakten INS-1 Messen 832/13 Beta-Zellen abgeleitet. Diese Technik ermöglicht es uns, die Antwort von Beta-Zellen für unstimulatory Glukose Bedingungen (2,5 mM Glukose) bestimmen sowie stimulierende Glukose Bedingungen (16,7 mM Glukose). Während die unpermeabilized Zellen nicht erlauben, einzeln testen Komplex I, II oder III des Elektrons Transportkette, die Technik erlaubt Messungen der Umgang mit komplexen IV Hemmung (Oligomycin A) abgekoppelt Atmung (FCCP-Carbonyl Zyanid- 4-(Trifluormethoxy-) Phenylhydrazone), und vollständig gehemmt Atmung (Antimycin A). Diese Studie zeigt die Wirksamkeit zur Messung der Atmung in den intakten unpermeabilized pankreatischen Betazellen, sowie die Wirkung von zwei natürlich vorkommenden Verbindungen, Monomere Epicatechin und Curcumin, auf Beta Zellatmung.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>O2k Core: Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10000-02</td>
			<td>Instrument for high-resolution respirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DatLab 6 Program</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>27141-01</td>
			<td>Computer program for analysing high-reolution respirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INS-1 832/13 cell line</td>
			<td>Duke University Medical Center</td>
			<td>NONE</td>
			<td>Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7727</td>
			<td>Pre-treatment of beta cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocoa epicatechin monomer</td>
			<td>Virginia Polytechnic Institute and State University</td>
			<td>NONE</td>
			<td>Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>832/13 beta cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4458</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3662</td>
			<td>832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>GLL01</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35% BSA Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7979</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459844</td>
			<td>Washing Oxygraph O2k Chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Chemicals for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Chemicals for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anitmycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Chemicals for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>For determining protein concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution respirometry to measure mitochondrial function of intact beta cells in the presence of natural compounds

Hochauflösender Respirometrie ermöglicht die Messung des Sauerstoffverbrauchs von isolierten Mitochondrien, Zellen und Geweben. Beta-Zellen spielen eine wichtige Rolle im Körper durch die Kontrolle des Blutzuckerspiegels durch Insulin-Sekretion als Reaktion auf erhöhten Glukosekonzentration. Insulin-Sekretion wird durch Glukosestoffwechsel und die mitochondriale Atmung gesteuert. Daher unbedingt messen intakt Beta Zellatmung Beta-Zellfunktion zur Behandlung von Diabetes verbessern zu können. Mit intakt 832/13 INS-1 abgeleitet Betazellen messen wir den Effekt der Erhöhung der Glukosekonzentration auf die Zellatmung. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Beta Zellatmung in das Vorhandensein oder Fehlen von verschiedenen Verbindungen, so dass man die Wirkung der bestimmen messen Verbindungen auf intakte Zellatmung gegeben. Hier zeigen wir die Wirkung von zwei natürlich vorkommenden Verbindungen, Monomere Epicatechin und Curcumin, auf Beta Zellatmung unter Anwesenheit von niedrig (2,5 mM) "oder" hohe Glukose (16,7 mM) Bedingungen. Diese Technik kann verwendet werden, um die Wirkung der verschiedenen Verbindungen auf intakte Beta Zellatmung in Anwesenheit von unterschiedlichen Glukosekonzentration zu bestimmen.

INS-1 832/13 Beta-Zellen, die vorbereitet und geerntet wie im Protokoll beschrieben zeigen Modulation in Sauerstoff-Verbrauch anhand der verschiedenen chemischen Interventionen (Abb. 1A). Eine Zunahme der Atmung wird beobachtet werden, wenn die Glukosekonzentration auf 16,7 mM Glukose (Abbildung 1 b) erhöht wird. Atmung sinken, wenn die intakten Zellen mit Oligomycin A. behandelt werden Diese Atmung bekannt als Leck, definiert als die basale, nonphosphorylating...

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High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirkung der Glukose-vermittelte Änderungen an mitochondrialen Atmung im Beisein von Naturstoffe auf intakt 832/13 Beta-Zellen mit Hilfe hochauflösender Respirometrie messen.

Hochauflösender Respirometrie, mitochondriale Funktion intakt Beta-Zellen in Anwesenheit von Naturstoffen zu messen

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.8K Aufrufe.  Brigham Young University. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirkung der Glukose-vermittelte Änderungen an mitochondrialen Atmung im Beisein von Naturstoffe auf intakt 832/13 Beta-Zellen mit Hilfe hochauflösender Respirometrie messen.

Serie: High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in living cells by photo-conversion of matrix targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP) in a subset of mitochondria. The rate at which the photoconverted molecules equilibrate across the entire mitochondrial population is used as a measure of fusion activity. Thus far measurements were performed using a single cell time lapse approach, quantifying the equilibration in one cell over an hour. Here, we scale up and automate a previously published live cell method based on using mtPAGFP and a low concentration of TMRE (15 nm). This method involves photoactivating a small portion of the mitochondrial network, collecting highly resolved stacks of confocal sections every 15 min for 1 hour, and quantifying the change in signal intensity. Depending on several factors such as ease of finding PAGFP expressing cells, and the signal of the photoactivated regions, it is possible to collect around 10 cells within the 15 min intervals. This provides a significant improvement in the time efficiency of this assay while maintaining the highly resolved subcellular quantification as well as the kinetic parameters necessary to capture the detail of mitochondrial behavior in its native cytoarchitectural environment.
Mitochondrial dynamics play a role in many cellular processes including respiration, calcium regulation, and apoptosis1,2,3,13. The structure of the mitochondrial network affects the function of mitochondria, and the way they interact with the rest of the cell. Undergoing constant division and fusion, mitochondrial networks attain various shapes ranging from highly fused networks, to being more fragmented. Interestingly, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Charcot Marie Tooth 2A, and dominant optic atrophy have been correlated with altered mitochondrial morphology, namely fragmented networks4,10,13. Often times, upon fragmentation, mitochondria become depolarized, and upon accumulation this leads to impaired cell function18. Mitochondrial fission has been shown to signal a cell to progress toward apoptosis. It can also provide a mechanism by which to separate depolarized and inactive mitochondria to keep the bulk of the network robust14. Fusion of mitochondria, on the other hand, leads to sharing of matrix proteins, solutes, mtDNA and the electrochemical gradient, and also seems to prevent progression to apoptosis9. How fission and fusion of mitochondria affects cell homeostasis and ultimately the functioning of the organism needs further understanding, and therefore the continuous development and optimization of how to gather information on these phenomena is necessary.
Existing mitochondrial fusion assays have revealed various insights into mitochondrial physiology, each having its own advantages. The hybrid PEG fusion assay7, mixes two populations of differently labeled cells (mtRFP and mtYFP), and analyzes the amount of mixing and colocalization of fluorophores in fused, multinucleated, cells. Although this method has yielded valuable information, not all cell types can fuse, and the conditions under which fusion is stimulated involves the use of toxic drugs that likely affect the normal fusion process. More recently, a cell free technique has been devised, using isolated mitochondria to observe fusion events based on a luciferase assay1,5. Two human cell lines are targeted with either the amino or a carboxy terminal part of Renilla luciferase along with a leucine zipper to ensure dimerization upon mixing. Mitochondria are isolated from each cell line, and fused. The fusion reaction can occur without the cytosol under physiological conditions in the presence of energy, appropriate temperature and inner mitochondrial membrane potential. Interestingly, the cytosol was found to modulate the extent of fusion, demonstrating that cell signaling regulates the fusion process 4,5. This assay will be very useful for high throughput screening to identify components of the fusion machinery and also pharmacological compounds that may affect mitochondrial dynamics. However, more detailed whole cell mitochondrial assays will be needed to complement this in vitro assay to observe these events within a cellular environment.
A technique for monitoring whole-cell mitochondrial dynamics has been in use for some time and is based on a mitochondrially-targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP)6,11. Upon expression of the mtPAGFP, a small portion of the mitochondrial network is photoactivated (10-20%), and the spread of the signal to the rest of the mitochondrial network is recorded every 15 minutes for 1 hour using time lapse confocal imaging. Each fusion event leads to a dilution of signal intensity, enabling quantification of the fusion rate. Although fusion and fission are continuously occurring in cells, this technique only monitors fusion as fission does not lead to a dilution of the PAGFP signal6. Co-labeling with low levels of TMRE (7-15 nM in INS1 cells) allows quantification of the membrane potential of mitochondria. When mitochondria are hyperpolarized they uptake more TMRE, and when they depolarize they lose the TMRE dye. Mitochondria that depolarize no longer have a sufficient membrane potential and tend not to fuse as efficiently if at all. Therefore, active fusing mitochondria can be tracked with these low levels of TMRE9,15. Accumulation of depolarized mitochondria that lack a TMRE signal may be a sign of phototoxicity or cell death. Higher concentrations of TMRE render mitochondria very sensitive to laser light, and therefore great care must be taken to avoid overlabeling with TMRE. If the effect of depolarization of mitochondria is the topic of interest, a technique using slightly higher levels of TMRE and more intense laser light can be used to depolarize mitochondria in a controlled fashion (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). To ensure that toxicity due to TMRE is not an issue, we suggest exposing loaded cells (3-15 nM TMRE) to the imaging parameters that will be used in the assay (perhaps 7 stacks of 6 optical sections in a row), and assessing cell health after 2 hours. If the mitochondria appear too fragmented and cells are dying, other mitochondrial markers, such as dsRED or Mitotracker red could be used instead of TMRE.
The mtPAGFP method has revealed details about mitochondrial network behavior that could not be visualized using other methods. For example, we now know that mitochondrial fusion can be full or transient, where matrix content can mix without changing the overall network morphology. Additionally, we know that the probability of fusion is independent of contact duration and organelle dimension, is influenced by organelle motility, membrane potential and history of previous fusion activity8,15,16,17.
In this manuscript, we describe a methodology for scaling up the previously published protocol using mtPAGFP and 15nM TMRE8 in order to examine multiple cells at a time and improve the time efficiency of data collection without sacrificing the subcellular resolution. This has been made possible by the use of an automated microscope stage, and programmable image acquisition software. Zen software from Zeiss allows the user to mark and track several designated cells expressing mtPAGFP. Each of these cells can be photoactivated in a particular region of interest, and stacks of confocal slices can be monitored for mtPAGFP signal as well as TMRE at specified intervals. Other confocal systems could be used to perform this protocol provided there is an automated stage that is programmable, an incubator with CO2, and a means by which to photoactivate the PAGFP; either a multiphoton laser, or a 405 nm diode laser.

Mitochondrial fusion was measured by tracking the equilibration of photoconverted matrix-targeted GFP across the mitochondrial network over time. Thus far, only one cell could be subjected to an hour long kinetic analysis at a time. We present a method that simultaneously measures multiple cells, thereby speeding up the data collection process.

Der schnellere, Hohe Auflösung, MTPA-GFP-basierte Mitochondriale Fusion Assay Acquiring Kinetische Daten mehrerer Zellen parallel mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

Forschung

Biologie

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Mit hochauflösenden Computertomographie, die dreidimensionale Struktur und Funktion pflanzlicher Gefäßsystem Visualisieren

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Hohe Auflösung Ganze Berge<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung innerhalb Zebrafischembryonen Gene Expression und Funktion zu untersuchen

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many doses, allow sensitive measurement of drug interactions. However, these assays are costly and do not scale well for measuring interaction among many drugs. Several recent studies have reported drug interaction measurements using a diagonal sampling of the traditional checkerboard assay. This alternative methodology greatly decreases the cost of drug interaction experiments and allows interaction measurement for combinations with many drugs. Here, we describe a protocol to measure the three pairwise interactions and one three-way interaction among three antibiotics in duplicate, in five days, using only three 96-well microplates and standard laboratory equipment. We present representative results showing that the three-antibiotic combination of Levofloxacin + Nalidixic Acid + Penicillin G is synergistic. Our protocol scales up to measure interactions among many drugs and in other biological contexts, allowing for efficient screens for multi-drug synergies against pathogens and tumors.

In this protocol, we describe how to make Loewe additivity-based drug interaction measurements for pairwise and three-way drug combinations.

Diagonale Methode zur Maßnahme Synergie zwischen beliebig vieler Medikamente

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Analyse der Beta-Zellfunktion mit einzelligen Auflösung Kalzium Imaging im Zebrafisch Inselchen

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and assessment of respiratory complexes using diversified substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protocols. Here, the usage of two high-resolution respirometry devices is demonstrated, and a basic collection of protocols applicable for the analysis of cultured cells, skeletal and heart muscle fibers, and soft tissues such as the brain and liver are presented. Protocols for cultured cells and tissues are provided for a chamber-based respirometer and cultured cells for a microplate-based respirometer, both encompassing standard respiration protocols. For comparative purposes, CRISPR-engineered HEK293 cells deficient in mitochondrial translation causing multiple respiratory system deficiency are used with both devices to demonstrate cellular defects in respiration. Both respirometers allow for comprehensive measurement of cellular respiration with their respective technical merits and suitability dependent on the research question and model under study.

Assessing oxidative phosphorylation using high-resolution respirometers has become an integral part of the functional analysis of mitochondria and cellular energy metabolism. Here, we present protocols for the analysis of cellular energy metabolism using chamber and microplate-based high-resolution respirometers and discuss the key benefits of each device.