Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung des Sauerstoffverbrauchs von einer kleinen Anzahl von Inselchen von relevanten Arten, wie nicht-menschlichen Primaten und Menschen, was eine Bewertung der mitochondrialen Funktion ermöglicht. Diese Technik kann mit einer kleinen Anzahl von Primärinseln durchgeführt werden, wodurch die technischen Replikationen erhöht werden, die Daser mehrere Bedingungen testen und die Strenge und Reproduzierbarkeit des Tests verbessern. Diese Technik bewertet die mitochondriale Gesundheit, eine wichtige Bestimmung der Islet-Funktion und Insulinsekretion, die oft bei Diabetes beeinträchtigt ist und ein signifikanter Prädiktor für eine erfolgreiche Islet-Transplantation ist.
Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Inselchen nach dem Transfer in der Mitte der Brunnen lokalisiert sind. Geschieht dies nicht, führt dies zu inkonsistenten Sauerstoffverbrauchsmessungen. Die Demonstration dieses Verfahrens wird, Valerie Ricciardi, eine Studentin in meinem Labor arbeiten.
Am Tag vor dem Test 200 Mikroliter Zell- und Gewebeklebstoff zu 2,8 Millilitern 0,1 Molar-Natriumbicarbonat-Lösung hinzufügen und 20 Mikroliter der resultierenden Lösung auf den Boden jedes Brunnens einer 96 well spheroiden Mikroplatte geben. Stellen Sie sicher, dass Luftblasen von der Pipettenspitze entfernt werden. Wenn alle Brunnen beladen sind, legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius nicht-Kohlendioxid-Inkubator.
Nach einer Stunde die Zellklebstofflösung in einer sterilen Umgebung von der Platte absaugen und jeden Brunnen zweimal mit 400 Mikrolitern 37 Grad Celsius sterilem Wasser waschen. Dann lassen Sie die Brunnen für 30 bis 40 Minuten trocknen, bevor Sie die Platte für die Nachtlagerung bei vier Grad Celsius bedecken. Um die Sensorpatrone zu hydratisieren, öffnen Sie in einer sterilen Umgebung das Sensorpatronenpaket und entfernen Sie den Inhalt.
Stellen Sie die Sensorpatrone kopfüber neben die Versorgungsplatte und füllen Sie jeden Brunnen der Nutzplatte mit 200 Mikroliter sterilem Wasser. Wenn alle Brunnen geladen sind, senken Sie die Sensorpatrone in die Versorgungsplatte und legen Sie die montierte Sensorpatrone und Dienutzplatte über Nacht in den 37 Grad Celsius nicht-Kohlendioxid-Inkubator. Entfernen Sie am Tag des Testes den Deckel der Sensorpatrone und dekantiert das Wasser aus den Brunnen der Versorgungsplatte.
Fügen Sie 200 Milliliter vorgewärmten Kalibrant zu jedem Brunnen hinzu und ersetzen Sie den Deckel der Sensorpatrone. Legen Sie die Sensorpatrone dann für etwa eine Stunde wieder in den Inkubator. Um die Inselchen für den Transfer vorzubereiten, pflücken Sie die Inselchen von Hand in eine 60 mal 15 Millimeter große Zellkulturschale, die das zusammengesetzte Medium bis zu einer Reinheit von fast 100 % enthält.
Wenn alle Inselchen gesammelt sind, laden Sie jeden Brunnen der vorbereiteten Sphäroid-Mikroplatte mit 175 Mikrolitern montiertem Medium und verwenden Sie eine P20-Pipette, die auf 15 Mikroliter eingestellt ist, um 15 Inselchen in 15 Mikroliter Medium aus der Zellkulturschale zu aspirieren. Um die Inselchen auf die Sphäroid-Mikroplatte zu säen, senken Sie die Pipettenspitze bis zum Boden des Brunnens, heben Sie kaum die Spitze an und geben Sie langsam etwa fünf Mikroliter Medium aus. Um die Inselchen in die Brunnen zu laden, lassen Sie die Inselchen in der Pipettenspitze absetzen, bevor Sie sie sanft direkt über dem Boden des Brunnenzentrums in einem kleinen Volumen von Medium loslassen.
Bestätigen Sie, dass alle Inselchen die Pipettespitze verlassen haben, und überprüfen Sie gelegentlich die Sphäroid-Mikroplatte unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob die Inselchen an der Unterseite der Platte gesät sind und nicht an den Seiten der Brunnen kleben. Wenn alle Inselchen übertragen wurden, legen Sie die Mikroplatte in den 37 Grad Celsius nicht-Kohlendioxid-Inkubator. Vor Beginn des Assay-Verfahrens Port A der Sensorpatrone mit 20 Mikroliter frisch zubereitetem 45 Mikromolar-Oligomycin, Port B mit 22 Mikrolitern frisch zubereitetem 10 Mikromolaren FCCP und Port C mit 25 Mikroliterfrisch 25 Mikromolar-Rotona AA beladen. Als Nächstes programmieren Sie einen extrazellulären Flussanalysator-Assay für eine 30-minütige Baseline-Atmungsphase, 42 Minuten Oligomycin-Messzeit, 30 Minuten FCCP-Periode und 30 Minuten Rotone AA-Periode.
Führen Sie dann den Test nach den Anweisungen auf dem Bildschirm aus, um den Sensor zu kalibrieren und die Mikroplatte einzulegen. Für die Inselabgabe an die Assayplatte sollten 15 Inselchen in 15 Mikrolitern Medium angesaugt werden, wie dargestellt. Diese Technik führt zu einer konsistenten Platzierung von Inselchen in der unteren Mitte jedes Mikroplattenbrunnens, was genaue Sauerstoffverbrauchsmessungen ermöglicht.
In diesem repräsentativen Experiment, das den Sauerstoffverbrauch einzelner Brunnen zeigte, waren die Brunnen schlecht belastet, was zu einem sehr niedrigen Ausgangswert des Sauerstoffverbrauchs und wenig bis gar keiner Reaktion auf FCCP führte. In diesem Experiment zeigten die meisten Brunnen eine signifikante Grundatmung und Reaktion auf Medikamente. Jedoch, zwei Brunnen zeigten keine Reaktion auf Rotone, was darauf hindeutet, dass das Medikament nicht richtig in den Brunnen freigesetzt wurde.
Diese Brunnen wurden von weiteren Analysen ausgeschlossen. Hier können die Ergebnisse eines erfolgreichen Assays beobachtet werden, bei dem die Brunnen ordnungsgemäß mit Inselchen beladen und richtig mit Medikamenten injiziert wurden. Es ist von Vorteil, die Reagenzien und Platten am Tag vor der Durchführung des Assays vorzubereiten, damit die Inselchen kurz nach ihrer Isolation oder dem Erhalt verwendet werden können.
Nach dem Test können die Inseln für die Protein- oder DNA-Extraktion zurückgewonnen werden, um die Sauerstoffverbrauchsdaten zu normalisieren oder den mitochondrialen DNA-Gehalt zu quantifizieren. Die Fähigkeit, die mitochondriale Funktion in einer kleinen Anzahl von primären Primateninseln zu messen, ermöglicht das Testen mehrerer Medikamente und anderer Manipulationen in einer einzigen biologischen Replikation. Personen, die mit primären Primateninseln arbeiten, sollten sicher sein, in der richtigen und sicheren Handhabung mit diesen Geweben geschult zu werden.
Insbesondere die Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und die ordnungsgemäße Entsorgung dieser Proben.
