Unser Protokoll bietet einen effektiven und wiederholbaren Ansatz zur Bewertung und Quantifizierung phagozytischer Ereignisse in Hämozyten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir phagozytische Ereignisse innerhalb einzelner Hämozyten quantifizieren können, was es uns ermöglicht, Variationen in phagozytischen Prozessen zwischen Genotypen in einzelnen Fliegen zu erkennen. Das Durchführen von Sezierungen kann eine Herausforderung sein, daher üben Sie bei der erstmaligen Durchführung dieser Technik so viel wie möglich, bevor Sie den vollständigen Vorgang durchführen.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Glasnadeln für die Injektion. Füllen Sie eine ein Millimeter Spritze mit Mineralöl und befestigen Sie die 30 Gauge hypodermische Nadel, die mit dem Nano-Injektor versehen ist. Setzen Sie die 30-Spur-Nadel in das stumpfe Ende einer gezogenen Kapillarnadel ein und füllen Sie sie mit Mineralöl.
Entfernen Sie langsam die 30-Spur-Nadel, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen gebildet werden. Entfernen Sie die Spannzange und legen Sie den versiegelten O-Ring mit dem Einzug nach oben. Legen Sie den größeren O-Ring auf den Metallkolben, und befestigen Sie die Spannzange dann wieder ohne Anziehen.
Setzen Sie den Metallkolben in das stumpfe Ende der ölgefüllten Glasnadel ein und drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, indem Sie ihn in den größeren O-Ring einsetzen. Dann ziehen Sie die Spannzange fest. Nach dem Füllen der Nadel mit Fluor- oder pH-empfindlichen Partikeln, injizieren Sie die Fliegen in die sternopleturische Platte des Thorax.
Die Injektion ist erfolgreich, wenn der grüne Farbstoff in die Fliege geht. Legen Sie die injizierten Fliegen in eine neue Lebensmittel-Durchstechflasche, die die Zeit angibt, in der die erste und letzte Fliege injiziert wurden. Legen Sie die Durchstechflasche auf ihre Seite, bis sich alle Fliegen erholt haben, um zu verhindern, dass sie in der Nahrung stecken bleiben.
Richten Sie die fliegende ventrale Seite unter einem sezierenden Stereomikroskop nach oben aus. Dann legen Sie einen Insektenstift in den Thorax und eine andere durch das hintere Ende des Bauches in der Nähe der Genitalien. Sobald alle Fliegen angeheftet sind, verwenden Sie eine Transferpipette, um genügend Seziermedien hinzuzufügen, um die Fliegen abzudecken.
Entfernen Sie den Kopf mit der Nagelhautschere, und machen Sie einen horizontalen Schnitt direkt über der hinteren Stecknadel im Bauch, dann einen weiteren am vorderen Ende des Bauches. Machen Sie einen vertikalen Schnitt, der die beiden horizontalen Schnitte verbindet, die die Bauchhöhle öffnen. Verwenden Sie Zangen, um die inneren Organe und Gewebe zu entfernen, stellen Sie sicher, dass das dorsale Gefäß zu vermeiden.
Verwenden Sie bei Bedarf zusätzliche Stifte, um die geschnittenen Enden der Nagelhaut zu sichern. Dann den Thorax mit der Nagelschere entfernen. Entsorgen Sie die Seziermedien und ersetzen Sie sie durch einen Milliliter 4%PFA, um die Sezierungen so weit wie möglich vor Licht zu schützen.
Fixieren Sie die Abschnitte für 15 Minuten bei Raumtemperatur, während Sie bei 20 Umdrehungen pro Minute schaukeln. Entfernen Sie dann das Fixativ und fügen Sie einen Milliliter 1X PBST hinzu. Wenn gewünscht, färben Sie die Abschnitte mit Antikörpern.
Nach der Montage der Nagelhaut auf einem Mikroskopschlitten, verwenden Sie Zangen, um sie ventrale Seite nach oben zu orientieren, und stellen Sie sicher, dass das Dorsalgefäß sichtbar ist. Junge und gealterte Fliegen wurden auf altersspezifische Fähigkeit zur Phagozytose durch fluoreszierende Bildgebung von Hämozyten entlang des Dorsalgefäßes untersucht. Ein Antikörper gegen Perikardin wurde verwendet, um sicherzustellen, dass nur Zellen entlang des Dorsalgefäßes gezählt wurden.
Da fluoreszierend markierte E.coli-Partikel einen Mikrometer lang sind und Hämozyten einen Durchmesser von 10 Mikrometern haben, wurden nur fluoreszierende Ereignisse innerhalb eines Durchmessers von 10 Mikrometern gezählt, die auf einem DAPI-positiven Kern zentriert sind. ImageJ-Software wurde dann verwendet, um die Ereignisse zu quantifizieren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich vorzustellen, dass die Fliege tatsächlich injiziert wurde, und sich daran zu erinnern, dass Timing entscheidend ist.
Das rechtzeitige Abschließen von Injektionen und Sezierungen wird dazu beitragen, experimentelle Fehler und mögliche Schwankungen der phagozytischen Rate zu minimieren. Diese Technik wird es Forschern ermöglichen, eine Vielzahl von Forschungsthemen zu erforschen, einschließlich Fragen über zelluläre Immunität, verschiedene Populationen von Blutzellen oder die Unterscheidung von Phagozytose von der AMP-Produktion während einer erfolgreichen Immunantwort.
