Dieses Protokoll befasst sich mit den Schwierigkeiten und Herausforderungen bei der Mikroinjektion von Larven, indem es eine präzise Methode beschreibt, die die Verwendung der Drosophila melanogaster Larve als Modell für verschiedene Immun- und molekulare Studien ermöglicht. Dies ist eine einfache Injektionstechnik, die eine effiziente, kostengünstige und schnelle Methode darstellt, um eine Vielzahl von Substanzen wiederholt einheitlich zu verabreichen, was konsistente und zuverlässige Ergebnisse ermöglicht. Beginnen Sie mit der Auswahl der Larven im dritten Stadium und waschen Sie sie mit Ringers Lösung in einer kleinen Petrischale.
Legen Sie ein Filterpapier in eine Petrischale und befeuchten Sie es mit 5 ml Ringer-Lösung. Legen Sie dann die Larven auf das Filterpapier. Bereiten Sie Kapillaren mit 3,5-Zoll-Glaskapillarröhrchen in einem Mikropipettenabzieher vor.
Öffnen Sie die Glaskapillare mit Hilfe einer geraden gezackten Mittelpunktpinzette. Füllen Sie die offene Kapillare mit einer Einwegspritze aus Kunststoff mit Mineralöl. Dann schleudern Sie das Öl mit einem Nanoliter-Injektor aus dem Kapillarrohr.
Füllen Sie die Kapillare mit dem gewünschten bakteriellen Präparat für die Injektion. Übertragen Sie die betäubten Larven auf ein Filterpapier, das mit Ringer-Lösung angefeuchtet ist. Üben Sie mit einer Pinzette festen Druck auf die dorsale Seite des hinteren Endes der Larven aus, wo die Trachealspirakel sichtbar sind.
Führen Sie dann die Nadel horizontal in Richtung des hinteren Endes der Larven ein und injizieren Sie die Bakterienvorräte. Entfernen Sie die Pinzette, um das Verschütten von Hämolymphe oder Darm zu vermeiden. Ziehen Sie dann die zuvor in Larven eingeführte Nadel zurück.
Infizieren Sie 20 Larven für jede experimentelle Bedingung. Übertragen Sie die injizierten Larven vorsichtig mit einem Pinsel auf ein separates feuchtes Filterpapier. Fügen Sie die Lösung von Ringer nach Bedarf hinzu, um eine Austrocknung zu verhindern.
Inkubieren Sie die Petrischale in einem Inkubator bei 25 C.Drosophila melanogaster Larven, die mit Photorhabdus asymbiotica infiziert waren, zeigten 24 Stunden nach der Injektion eine Überlebensrate von 57%, während Larven, denen Escherichia coli injiziert wurde, gleichzeitig eine Überlebensrate von 85% aufwiesen. Die Bedeutung dieser Methode besteht darin, dass die Nadel ungefähr parallel zur Larve gehalten wird. Der Druck, der ausgeübt wird, um die Larve zu halten, ist sehr gering, was die Möglichkeit von Hämolymphleckage, tödlichen Verletzungen oder unzureichender Abgabe der gewünschten Substanz verringert.
Diese Technik kann mit Übung perfektioniert werden.
