Karen M. Qiang erhielt die 2016 von George J. Schroepfer Research Award an der Rice University. Fanli Zhou ist der Empfänger eines Stipendiums der Lehre von der Rice University. Die Dienste von Bloomington Drosophila Stock Center, Harvard Reise-Anlage, die Wien Drosophila Resource Center sind dankbar anerkannt.

1. Vorbereitung der Larven
<ol><li>Richten Sie mindestens zwei Tage vor Beginn der Assay Kreuze des gewünschten experimentelle ein und Steuern Sie-Kombinationen (je mindestens 20 Frauen und 10 Männer) in Ei-Lay Gerichte wie beschrieben durch Wieschaus und Nüsslein-Volhard 13 aber mit 50 mL Polypropylen Becher und 6,0 cm Einweg Petrischalen mit Trauben Agar und verschmiert mit Hefe Paste kurz vor Gebrauch. Halten Sie fliegen in Ei-Lay Speisen im Dunkeln bei Raumtemperatur bis benötigt.</li>
	<li>Traube Agar Rezept-Saft kombinieren 100 mL gefroren 100 % Traubensaft Konzentrat, 350 mL Deioinized Wasser, 5 mL Glazial-Essigsäure und 13 g D. Melanogaster -Agar in eine 1 L Becherglas. Mikrowelle in 1-2 min platzt, rühren zwischen platzt, bis alle Agar aufgelöst ist. Kühlen Sie die Lösung für ein paar Minuten ab, dann fügen Sie 10 mL 10 % (w/V) des Nipagen (Methyl-p-Hydroxybenzoat) in 95 % igem Ethanol. Mix, dann Pipette 7 mL pro Platte in Einweg-6,0 cm Petrischalen lassen gel und bei Zimmertemperatur ca. 3-4 h. Store bei 4 0C in Plastiktüten.</li>
	<li>Hefe paste Rezept-7 g getrocknete Hefe, 10 mL entionisiertem Wasser, mit einem Spatel mischen, bis gleichmäßige Konsistenz.</li>
	<li>Zeitgesteuerte Eizellentnahmen generieren experimentelle und Larven zu kontrollieren. Mit neuer, Hefe verschmiert, Traube Platten, sammeln Sie Eiern bei Raumtemperatur für 4 h in der Dunkelheit in den Morgenstunden. Entfernen Sie diese 4 h Sammlung Platten und ersetzen Sie durch frische Platten. Inkubieren Sie die 4 h Sammlung Platten über Nacht bei 25 0C bis zum Nachmittag des nächsten Tages, als die meisten der Larven geschlüpft haben werden. Sammeln Sie diese erste Instar Larven und verwenden sie, um das Experiment einzurichten.</li>
</ol>2. Einrichten der Assay-Platten
<ol><li>Vorbereitung der Assay-Platten. Bereiten Sie für eine einzelne Ausführung des Tests fünf Assay Platten 10 experimentelle Larven und fünf Platten 10 Kontrolle Larven. Verwenden Sie ein 1,5 cm Kork Borer, um einen zentralen Kern des Nährbodens aus jeder Platte ein Loch für das Essen zu entfernen. Setzen Sie Hefe Paste (0,8 - 0,9 g) in das Loch und klopfen Sie vorsichtig mit einem Spatel zu einem Hügel füllen das Loch.</li>
	<li>Agar-Platte-Vorbereitung – 700 mL entionisiertem Wasser mit 16 g D. Melanogaster Agar in eine 2 L Becherglas kombinieren und Mikrowelle für 5 min. Entfernen von Mikrowelle und rühren mit einem Glasstab unaufgelöste Agar in Lösung zu bringen. Fügen Sie 17,5 mL 10 % (w/V) Nipagen in 95 % Ethanol, Mischung, dann weiter Mikrowelle Heizung in 30 s platzt gefolgt von rühren, bis alle Agar vollständig gelöst ist. Cool für ein oder zwei Minuten, dann pipette 15 mL Aliquots in 10 cm Kunststoff Petrischalen. Agar-gel, Abdeckplatten mit Deckel und lassen sie trocknen bei Raumtemperatur für ein paar Stunden oder über Nacht zu ermöglichen. Shop-Platten in versiegelten Plastikbeuteln bei 18 ° C. Anmerkung 1: Um Bildung von Nipagen Kristallen auf der Oberfläche der Platten durch überschüssige Dessiccation zu vermeiden, verwenden Sie Platten innerhalb von ein paar Tagen der Vorbereitung. Bei Bedarf können Kristalle wieder aufgelöst werden, durch wenige Mikroliter von 95 % Alkohol auf sie fallen. Anmerkung 2: Chargen des Nährbodens können unterschiedliche gelbildenden Eigenschaften haben. Die trockene Gel-Platten sollte fest im Griff und ausreichend belastbar, dass ein sauberer und intakter Kreis des Nährbodens entfernt werden, wenn der Korken Borer mit Essen-Loch (siehe oben) erstellen.</li>
	<li>Einrichten von Larven im Assay Platten. Verwenden Sie mechanischen Druck, um Kurve die Spitze der Kunststoff Microspatula und Tauchen Sie die Spitze in Hefe-Paste "Klebstoff" bieten für die Abholung der Larven. Nehmen Sie erste Instar Larven einzeln und legen Sie sie auf der Agarplatte in der Nähe von Essen-Hügel. Bereiten Sie mindestens fünf replizieren Platten aus 10 Larven für beide experimentelle und Kontrolle Genotypen. Abschluss, Kappe und beschriften Sie jeden Teller und legen Sie die Platten (Deckel Seite nach oben) in einem dunklen Raum bei Zimmertemperatur (Dies ist in unserem Labor 22 ° C).</li>
</ol>3. Überwachung der Assay-Platten
<ol><li>Untersuchen Sie Platten täglich unter dem sezierenden Mikroskop und notieren Sie die Anzahl der Larven auf das Essen oder draußen auf der Agar-Oberfläche. Beachten Sie alle sichtbaren Toten oder sterbenden Larven. Beachten Sie, wann und ob Tunnelbau in den Agar Substrat als dritte Instar Larven bezogen angesehen wird. Hinweis Termine auf die Puppen beginnen sich zu bilden und beachten Sie etwaige pupal Anomalien. Tägliche Beobachtungen weiter, bis alle Larven gestorben oder pupated.</li>
	<li>Entfernen Sie Puppen vorsichtig von der Platte mit einem gebogenen Nadel und Übertragung auf eine Traube Platte zu necken. Auf Wunsch weiterhin Puppen um festzustellen, wie viele Eclose als Erwachsene.</li>
</ol>4. Vorbereitung Assay-Platten für die Bildgebung
<ol><li>Sorgfältig entfernen Sie und entsorgen Sie alle Hefe Essen aus dem zentralen Brunnen jeder Platte.</li>
	<li>Sanft überfluten Sie jede Platte mit Leitungswasser zu und verwenden Sie eine weiche Künstler Pinsel vorsichtig reiben Sie Verschmutzungen, die auf die Agar-Oberfläche verfolgt worden. Ersetzen Sie das Wasser mehrmals und weiter sanft Bürsten, bis jede Platte vollständig sauber ist. Geben Platten ein abschließendes Spülen mit entionisiertem Wasser, verschließen sie und lassen bei Raumtemperatur über Nacht zu trocknen. Hinweis: Tunnelbau in den Agar ist am intensivsten um den Erdhügel Essen herum (siehe Abbildung 2). Infolgedessen ist der Rand der Öffnung Essen in der Regel jenseits der ersten 1,5 cm Durchmesser erweitert. Darüber hinaus verursachen die Zerbrechlichkeit des bearbeiteten Agar in dieser Region kleine Stücke von untertunnelten Agar bei der Reinigung von den Umfang des Lochs verloren zu gehen. Erhöhung der Gel-Agar-Konzentration könnte mit diesen Problemen helfen, aber während der Bild J Quantifizierung Schritte (siehe unten) sind Korrekturen möglich.</li>
</ol>(5) Quantifizierung der Tunnelbau
<ol><li>Bild der Platten. Bereiten Sie ein Bild von jeder Platte genommen vor einem schwarzen Hintergrund um die Tunnel im Agar als helle weiße Linien zeigen. Hinweis: Wir verwenden ein System häufig verwendet, um DNA-Gele für diesen Schritt Bild (siehe Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien). Alternative bildgebende Systeme, geeignet zur Erzeugung von TIFF-Dateien, wie digitale Kameras oder Handy-Kameras kann angepasst werden, um geeignete Bilder zu produzieren.</li>
	<li>Verwenden Sie das Public Domain Programm NIH Image J zum quantitate Larven tunneling. Laden Sie das Programm von http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Weitere Informationen zum Programm finden Sie unter http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html. Hinweis: Andere bildgebende Systeme könnte verwendet werden, um quantitate Tunneln. Die folgenden Anweisungen gelten für NIH Image J.</li>
	<li>Nach dem Öffnen einer TIFF-Datei Bild einer tunneling Platte, verwenden Sie Oval Tool, um einen Bereich für Quantifizierung zu definieren, stellt die gesamte Agar-Oberfläche aber ernten, die Kunststoff-Rand der Platte.</li>
	<li>Gelten Sie die automatische Schwelle um ein umgekehrtes Bild der Platte, mit der Tunnel zeigt als schwarze Linien zu produzieren. Verwenden Sie die Farbauswahl und Pinsel Werkzeuge zu weiß, alle schwarzen Bereiche, die Schäden der Agar als Tunnel darstellen.</li>
	<li>Unter die Analyze -Pull-Down-Menü, wählen Sie Set Maßstab | Klicken Sie auf die Waage zu entfernen und überprüfen Sie dann Set Messungen im Fenster "" (auch unter Analyze) Bereich und Limit, Schwelle.</li>
	<li>Drücken Sie Taste Cntrl + M drücken, um den schwarzen Bereich (Tunnel) in Pixel.</li>
	<li>Kopieren und Einfügen ist der Pixelwert für jede Platte in einem Tabellenkalkulationsprogramm (z.B. Excel), die eine Quantitative Analyse ermöglichen.</li>
	<li>Das zentrale Loch wird in der Regel durch intensive Tunnelbau in dieser Region erweitert. Um quantitate den fehlenden Tunnelbau, deaktivieren Sie die Option "Schwellenwert begrenzen" und das Zauberstab-Werkzeug verwenden, um die zentrale Bohrung zu definieren. Drücken Sie die Taste Cntrl + M-Taste um den Pixelwert dieses Gebietes zu erhalten. Subtrahieren von diesem Wert den Pixelwert ein 1,5 cm Loch und den Unterschied zu den Tunnelbau im Schritt 5.6 ermittelten Wert hinzufügen.</li>
	<li>Für einige Platten kann das zentrale Loch ein Stück getunnelte Agar fehlen, die eine Region angrenzend an das Loch untunneled Agar enthält. Wenn das zentrale Loch für den Einsatz dieser Platten Quantifizierung Pinsel die Farbauswahl und die Farbe Werkzeuge zum Hinzufügen eines schwarzen Balken über die fehlende Region definieren die getunnelte Region und Quantifizierung nicht getunnelt Bereich ausschließen. Anmerkung 1: Wenn die experimentellen Larven jede tunneling führen, erlaubt diese Quantifizierung Berechnung des Durchschnitts Tunnelbau für Sätze von Platten und statistischen Vergleich der Kontrolle und experimentellen Werte.</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+responses+to+oxygen+deprivation.">Conserved responses to oxygen deprivation.</a> J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).</li><li>Lavista-Llanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+hypoxic+response+in+D.+melanogaster+by+the+basic+helix-loop-helix+pas+protein+Similar.">Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar.</a> Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).</li><li>Reiling, J. H., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxia-induced+paralogs+Scylla+and+Charybdis+inhibit+growth+by+down-regulating+S6K+activity+upstream+of+Tsc+in+D.+melanogaster.">The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster.</a> Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).</li><li>Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+and+responding+to+hypoxia+via+Hif+in+model+invertebrates.">Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates.</a> J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).</li><li>Romero, N. M., Dekanty, A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+developmental+adaptations+to+hypoxia:+A+D.+melanogaster+perspective.">Cellular and developmental adaptations to hypoxia: A D. melanogaster perspective.</a> Meth. Enzymol. 435, 123-144 (2007).</li><li>Dijkers, P. F., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+hypoxia-induced,+nitric+oxide-mediated+signaling+cascade.">Dissection of a hypoxia-induced, nitric oxide-mediated signaling cascade.</a> Mol. Biol.Cell. 20 (18), 4083-4090 (2009).</li><li>Zhou, F., Qiang, K. M., Beckingham, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+to+burrow+and+tunnel+reveals+roles+for+jim+lovell+in+the+growth+and+endoreplication+of+the+D.+melanogaster+larval+tracheae.">Failure to burrow and tunnel reveals roles for jim lovell in the growth and endoreplication of the D. melanogaster larval tracheae.</a> PLOS ONE. 11, e0160233 (2016).</li><li>Wingrove, J. A., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+contributes+to+behavioral,+cellular,+and+developmental+responses+to+low+oxygen+in+D.+melanogaster.">Nitric oxide contributes to behavioral, cellular, and developmental responses to low oxygen in D. melanogaster.</a> Cell. 98 (1), 105-114 (1999).</li><li>Zhang, L., Ward, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uninflatable+encodes+a+novel+ectodermal+apical+surface+protein+required+for+tracheal+inflation+in+D.+melanogaster.">Uninflatable encodes a novel ectodermal apical surface protein required for tracheal inflation in D. melanogaster.</a> Dev. Biol. 336 (2), 201-212 (2009).</li><li>Langlais, K. K., Stewart, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+characterization+of+two+atypical+soluble+guanylyl+cyclases+in+the+central+and+peripheral+nervous+system+of+D.+melanogaster+melanogaster.">Preliminary characterization of two atypical soluble guanylyl cyclases in the central and peripheral nervous system of D. melanogaster melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 207 (13), 2323-2338 (2004).</li><li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+responses+to+hypoxia+and+hyperoxia+in+D.+melanogaster+larvae.">Behavioral responses to hypoxia and hyperoxia in D. melanogaster larvae.</a> Fly. 5 (2), 119-125 (2011).</li><li>Brand, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Wieschaus, E., Nusslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: a practical approach. , 199-227 (1986).</li><li>Callier, V., Shingleton, A. W., Brent, C. S., Ghosh, S. M., Kim, J., Harrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+reduced+oxygen+in+the+developmental+physiology+of+growth+and+metamorphosis+initiation+in+D.+melanogaster.">The role of reduced oxygen in the developmental physiology of growth and metamorphosis initiation in D. melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 216 (23), 4334-4340 (2013).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hif-+and+non-Hif-regulated+hypoxic+responses+require+the+estrogen-related+receptor+in+D.+melanogaster.">Hif- and non-Hif-regulated hypoxic responses require the estrogen-related receptor in D. melanogaster.</a> PLoS genetics. 9 (1), e1003230 (2013).</li><li>Grifoni, D., Sallazzo, M., Fontana, E., Froldi, F., Pession, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+oxygen+supply+in+Drosophila+malignancies+identify+tracheogenesis+as+a+novel+cancer+hallmark.">Multiple strategies of oxygen supply in Drosophila malignancies identify tracheogenesis as a novel cancer hallmark.</a> Scient. Rep. 5 (9061), (2015).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir haben hier einen einfache Assay entwickelt, um Gewebehypoxie in D. Melanogaster Larven erkennen vorgestellt. Die Diagnose basiert auf verminderte wühlen in Essen Hügel im frühen Larvenstadium Leben und das Fehlen von Substrat Tunnelbau spät im Larvenstadium Leben. Larval Verdrängung kann dazu führen, dass vorzeitige Migration Weg eine Nahrungsquelle und damit einen kritischen Aspekt des Tests ist, dass eine kleine Anzahl von Larven in Anwesenheit einer großen überschüssige Lebensmittel untersucht werden. Aufnahme der Fungizid-Methyl-p-Hydroxyl-Benzoat (Nipagen) in die Agarplatten ist auch wichtig, damit keine Schimmelbildung während des Tests.
Wir finden, dass die Agarplatten eine Quelle der Variabilität in der Probe sein können. Larven des gleichen Genotyps, aus verschiedenen Chargen der Eltern oder aus verschiedenen Sammlungen der Larven, zeigen in der Regel relativ begrenzte Variation in ihrem Verhalten in der Probe. Im Gegensatz dazu Agarplatten an verschiedenen Tagen gemacht oder mit verschiedenen Chargen des Nährbodens Unterschiede im Tunnelbau ergeben können. Eine Bedingung ist daher, dass die Kontrolle und experimentelle Larven sollten alle mit getestet werden Agarplatten von der gleichen Charge-Vorbereitung. Agar von verschiedenen Herstellern oder auch Sendungen des gleichen Herstellers in ihrer gelierende Stärke variieren können, und so es kann erforderlich sein, das Anpassen der Agar-Konzentration nach oben aus dem 2,2 % hier verwendet, um eine optimale Gel zu erreichen. Wir haben festgestellt, dass Wildtyp Larven leicht über 3 % Agar-Gel graben können.
Um den Wert des Assays zu demonstrieren, haben wir es verwendet, um potenzielle Gewebehypoxie in Larven mit unterdrückte Funktion untersuchen uninflatable in die Tracheen. Unsere Ergebnisse liefern starke Unterstützung für die Hypothese, dass Verlust der trachealen Expression dieses Gens Hypoxie produzieren kann: Btl-Gal4 > FH -Uif RNAi Larven bohren sich in Essen und völlige Fehlen von Substrat Tunnelbau bei Nichtbeachtung zeigte die dritte Instar. In unseren früheren Studien von anderen Genotypen, wir beobachtet, dass Hypoxie-induzierten Verlust der Nahrung wühlen nicht so vollständig wie Verlust von Substrat tunneling und Btl-Gal4 > FH -Uif RNAi Larven studierte hier ähnlich verhalten. Die fehlerhafte tunneling Komponente des Assays bietet daher den stärksten Hinweis auf Hypoxie.
Obwohl die Btl-Gal4 > Uif RNAi Larven zeigten Verhaltensmerkmale Diagnose der Hypoxie, die schneiden(Ue)-Gal4 > FH -Uif RNAi nicht diese Anomalien aufweisen. Die Btl und schneiden(Ue) Gal4 Treiber auf verschiedenen Stufen und in verschiedenen Mustern innerhalb der Larven Tracheen zum Ausdruck kommen. Die Btl-Gal4-Treiber wird im gesamten System der trachealen ausgehend von seiner Entwicklung in Embryogenese und Weiterbildung durch Larven Leben ausgedrückt. Im Gegensatz dazu Gal4 Ausdruck aus dem Schnitt(Ue)-Gal4-Treiber nur beginnt am Ende des embryonalen Lebens nach Morphogenese der Tracheen und beschränkt sich auf die extremen hinteren Abschnitte der dorsalen Stämme, die großen längs-Gefäße des die trachealen System. UIF Zuschlag mit dieser Gal4-Linie ist nicht deshalb zu reduzieren, Uif Ausdruck früh genug oder breit genug, um einige Schwellenwert der Hypoxie erforderlich, um die Verhaltensweisen auslösen zu produzieren in dieser Assay gemessen.
Eine frühere Studie ergab, dass Dritte Instar Larven ausgesetzt zu niedrigen Sauerstoffgehalt (10 %) verminderten Wachstum zeigen und verzögert Ausbruch der Pupariation 14. Die Btl-Gal4 > UAS -Uif RNAi Larven studierte hier voran, die dritte Instar, aber die Auswirkungen auf ihre Wachstums- und Verpuppung Preise waren stärker ausgeprägt: sie waren deutlich kleiner als Steuerelemente mit sehr wenig Fettgewebe unter der Epidermis (Abbildung 3) und nur ein kleiner Bruchteil (~ 10 %) versucht Pupariation. Diese Unterschiede deuten darauf hin das Btl-Gal4 > FH -Uif RNAi Larven erlebt einen höheren Grad der Hypoxie, Uif Zuschlag in die Tracheen ganze Larven lebenslang vorhanden war, oder weil es mehr produziert schweren Sauerstoffmangel in Dritte Instar. An dieser Stelle ist es unklar, wie Uif Funktionsverlust der Tracheen Sauerstofftransport verhindern könnte. Die Tracheen der Btl-Gal4 > FH -Uif RNAi Larven waren gut sichtbar durch die Kutikula (Abbildung 3), ein Indiz dafür, dass sie Luft enthalten und nicht, bis zu dem Punkt beschädigt wurden, dass flüssige Eintrag Funktion beeinträchtigt. Es ist daher formell möglich, dass der trachealen Schaden durch Funktionsverlust UIF-Datei erstellt nicht entlocken, Hypoxie, sondern eher einige defekt, der Tunnelbau hemmt. Für die Genotypen, die schon früher damit befasst haben wir festgestellt, dass die Nichtbeachtung der tunnel im späten dritten Instar Larven 15erhöhte Niveaus von LDH mRNA7, die kanonische Indikator für die Glykolyse und Hypoxie zugeordnet ist. So, endgültige Bestätigung der Hypoxie für Btl-Gal4 > FH -Uif RNAi Larven (und in Larven untersucht in Zukunft nutzen dieser Assay) würde bedeuten, RT-PCR um LDH mRNA-Niveaus oder Verwendung einer handelsüblichen Indikator zur Messung zu beurteilen intrazelluläre Sauerstoff-Niveaus (z. B. s. 16).

Die anspruchsvolle Auswahl an molekulare genetische Werkzeuge in D. Melanogaster machen es einen wertvollen Organismus für das Studium der evolutionär konservierte biologische Prozesse. Wichtigsten molekularen Reaktionen auf Sauerstoffverfügbarkeit erwiesen sich in der Evolution konserviert werden und frühere Studien in D. Melanogaster haben Einblicke in die universellen Komponenten dieser Signalisierung Wege 1,2erzeugt, 3,4,5,6.
Im Rahmen einer Studie, die darauf abzielen, sezieren sensorischen Neuron Funktion in D. Melanogaster Larven identifizierten wir zwei Verhaltensreaktionen, die bewiesen durch Gewebehypoxie bei normalen Sauerstoff Niveaus 7aktiviert werden. Eine davon, die Nichtbeachtung bohren sich in Essen, ist die Reaktion auf niedrigen Sauerstoffgehalt von Wingrove und O' Farrell 8berichtet sehr verwandt. Das zweite Verhalten, Nichtbeachtung der tunnel in eine weiche Unterlage während der späten dritten Instar wandernde Phase, war nicht früher als im Zusammenhang mit Hypoxie identifiziert worden. Wir festgestellt, dass hemmt auszusetzen Wildtyp wandernden Larven zu niedrigen Sauerstoffgehalt auch Substrat Tunnelbau 7, damit, dass beide diese Verhaltensweisen Hypoxie entspringen-entweder durch Gewebeschäden oder sauerstoffarmen Aufnahmemengen induzierten zu etablieren. Hier beschreiben wir eine Probe, die wir entwickelt haben, um diese zwei Hypoxie-induzierten Verhaltensweisen, quantitate, die mit Beobachtungen sofort nach dem Larven schlüpfen beginnt.
Hypoxische Antworten in den frühen Larvenstadien wurden bisher nicht untersucht und daher die Durchführung einer Analyse Larven lebenslang ist ein wertvoller Bestandteil unserer Assay. Die meisten der offensichtlichen Manifestationen der Hypoxie – langsame Entwicklung, schlechtes Wachstum und Bewegungsorgane Trägheit – überschneiden sich mit Larven Phänotypen, die durch viele Mutationen produziert. Aber wir haben festgestellt, dass nur dritte Instar Larven mit Hypoxie einen völliger Fehlschlag 7Tunnel zeigen. So haben wir festgestellt, dass sogar Larven mehr in Bezug auf Wachstum und Fortbewegung als unsere hypoxischen Larven noch durchgeführt einigen Tunneln, während hypoxische Larven nie 7getunnelt. Ein weiterer wertvoller Bestandteil dieser Assay ist somit, dass es eine Möglichkeit bietet, wenn Hypoxie die Quelle für einen bestimmten Satz von pleiotrope Phänotypen, im Gegensatz zu einigen anderen Stress oder metabolische Störung ist zu etablieren. Eine Demonstration des Assays, hier beschreiben wir ihre Verwendung bei der Charakterisierung der Antworten der Larven mit reduzierten trachealen Ausdruck der uninflatable, ein Gen, das in die Larven Airways 9Funktionen.
Wir uns vorstellen, dass dieser Test für Forscher engagiert bei der Charakterisierung von Larven Phänotypen, die schlechtes Wachstum und trägen Verhalten von Wert sein wird. Infolgedessen wurden neue Gene, die die Verteilung, Nutzung oder Antworten auf, konnten Sauerstoff durch den Körper identifiziert werden. Darüber hinaus würde Einbeziehung dieser Assay in eine Mutante screening Protokoll bieten einen direkten Weg zur Identifizierung von Mutationen, die Hypoxie zu produzieren. Dieser Test wird auch bei der Analyse der Schaltung, die die Hypoxie-induzierten angeborene Verhaltensweisen, die hier beschriebenen entlockt wertvoll sein. Neuronales Netzwerkanalyse dieser Art ist ein Schwerpunkt der viel aktuelle Forschung und das einfache Nervensystem von D. Melanogaster Larve ist ein wertvolles System für sezieren, automatisierte Verhaltensweisen. Sensorische Neuronen Larven Sauerstoff Wahrnehmung beteiligt wurden bereits identifiziert und bietet einen ersten Schritt zur Definition die komplette Schaltung für eine Hypoxie-induzierten Reaktionen 10,11. Mit unserem Test in Kombination mit selektiven neuronale Zuschlag über die GAL4-UAS-System-12 ist eine klare Route für die Abgrenzung weiterer Komponenten des neuronalen Netzes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dehydrated yeast&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Frozen grape juice concentrate</td>
			<td>Welch&#39;s</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Available at most large supermarkets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila agar</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>66-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-para-hydroxybenzoate</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>20-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml polypropylene beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6.0 cm disposable Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08757100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 cm disposable plastic Petri dishes</td>
			<td>E+K Scientific</td>
			<td>EK-24104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic microspatulas</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bent teasing needle</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>S08848MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any microscope with 10-30X magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae

Sauerstoffmangel bei Tieren führt, von Aussetzung zu den niedrigen atmosphärischen Sauerstoffniveaus oder interne Gewebeschäden, die mit Sauerstoff Verteilung stört. Es ist auch möglich, dass abweichendes Verhalten der Sauerstoff-abfragenneuronen Hypoxie-ähnliches Verhalten in Anwesenheit von normalen Sauerstoff-Niveaus führen könnte. Entwicklung bei niedrigen Sauerstoffgehalt ergibt in D. MelanogasterHemmung des Wachstums und der trägen Verhalten während der larvalen Phasen. Jedoch überschneiden sich diese etablierten Manifestationen der Sauerstoff Defizit erheblich mit der Phänotypen von vielen Mutationen, die Wachstum, Stressreaktionen oder Fortbewegung zu regulieren. Als Ergebnis gibt es derzeit keine Probe zur Verfügung, um (i) zelluläre Hypoxie induziert durch eine Mutation oder (Ii) Hypoxie-ähnliches Verhalten, wenn durch abnorme neuronalen Verhalten zu identifizieren.
Wir haben vor kurzem zwei charakteristische Verhaltensweisen in D. Melanogaster Larven identifiziert, die bei normalem Sauerstoffgehalt als Reaktion auf interne Erkennung von Hypoxie auftreten. Zunächst vermeiden solche Larven in allen Phasen, Wühlen in Essen, oft weit entfernt von einer Nahrungsquelle verirrt. Zweitens ist Tunneln in eine weiche Unterlage, die normalerweise auftritt, während die wandernden dritte Instar Stufe vollständig abgeschafft wenn Larven hypoxischen sind. Der hier beschriebene Test wurde entwickelt, um zu erkennen und diese Verhaltensweisen quantitate und damit eine Möglichkeit, Hypoxie induziert durch innere Schäden eher als geringe Sauerstoffversorgung zu erkennen. Assay-Platten mit einer Agar-Substrat und Zentralstecker Hefe Paste werden verwendet, um Tiere durch Larven Leben zu unterstützen. Die Positionen und den Status der Larven werden täglich verfolgt, wie sie vom ersten bis zum dritten Instar Vorgehen. Das Ausmaß der Tunnelbau in den Agar Substrat wandernde Phase ist nach der Verpuppung NIH ImageJ mit quantitated. Der Assay wird der Wert bei der Bestimmung, wenn Hypoxie ist eine Komponente eines mutierten Phänotyps und damit Einblick in die möglichen Standorte der Aktion des betreffenden Gens.

Als ein Beweis für den Wert des Assays habe wir es untersuchen mögliche Hypoxie in Larven mit eingeschränkter Funktion des Gens uninflatable (Uif) in die Tracheen. UIF-Datei kodiert ein großer transmembranen Protein, das stark auf die apikale Oberfläche der Larven trachealen Zellen exprimiert wird. Mutanten der Uif wurden bereits erwähnt, abweichendes Verhalten aufweisen, das Gewebehypoxie durch trachealen Fehlfunktion 9hinweisen. Wir unterdrückt speziell Uif Ausdruck in der Larven Luftröhre mit dem Gal4-UAS-System. Zwei Gal4-Linien wurden verwendet: i) atemlos (Btl)-Gal4, die stark in die Tracheen von Anfang ihrer Embryonalentwicklung und Ii zum Ausdruck kommt) (Ue) schneiden-Gal4, die Ausdruck in einer kleinen hinteren Region beginnt die dorsale Hauptstamm Tracheen am Ende der Embryogenese und starken Ausdruck in dieser Region das ganze Larven leben 7weiter. Ein FH -Uif RNAi-Linie wurde aus Wien-Drosophila-Forschungszentrum (VDRC ID #1050) gewonnen.
Wie im obigen Protokoll beschrieben, replizieren fünf Platten von frisch geschlüpften erste Instar, die Larven für jede der vier Kreuze wie folgt eingerichtet wurden.
Experiment 1 (1) Steuerung 1 - Schnitt(Ue)-Gal4 x Kanton-S (+) (2) Experimental 1 - Schnitt(Ue)-Gal4 X UAS-Uif RNAi
Experiment 2 (3) Control 2 - Btl-Gal4 x Kanton-S (+) (4) Experimental 2 - Btl-Gal4 X UAS-Uif RNAi
Das Verhalten des geschnitten(Ue)-Gal4 > FH -Uif RNAi Larven von Experiment 1 war vergleichbar mit dem von der Steuerung geschnitten(Ue)-Gal4 > + Tiere im Hinblick auf die Wege des Maulwurfs, Tunnelbau und Überleben zur Verpuppung, (Abbildung 1 und Abbildung 2). Im Gegensatz dazu erzeugt Down-Regulierung Uif Ausdruck im gesamten Trachealkanüle System von früh in der Entwicklung (Experiment 2) deutlich unterschiedliche Antworten. Die Btl-Gal4 > FH -Uif RNAi Larven angezeigt beide Verhalten Manifestationen der Gewebehypoxie – reduziert Essen zu wühlen und eine völlige Abwesenheit von Substrat Tunnelbau später im Larvenstadium Leben (Abbildung 1 und Abbildung 2 ). Die experimentelle Larven waren auch deutlich kleiner, dünner und langsamer als Kontrollen (Abbildung 3) und zeigte eine hohe Todesrate im Laufe des Tests. Wie oben besprochen, sind verringertes Wachstum, Trägheit und organismal Tod Symptome der Larven Hypoxie bekannt. Darüber hinaus instar die meisten der experimentellen Larven zur Verpuppung versuchen gescheitert und blieb als Dritter Larven lange nach Kontrolle Larven pupated hatte. Einige Larven überlebten mehr als 15 Tage vor seinem Tod schließlich ohne Verpuppung (Abbildung 1A). Ein paar der experimentellen Larven verpuppen sich versucht aber in allen Fällen abnorme Puppen wurden gebildet, die nicht lebensfähigen Erwachsene generiert haben.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig1.jpg"> Abbildung 1. Quantifizierung der Nahrung grabende und larvale Entwicklung. (A) Prozentsatz der live Larven außerhalb essen Hügel für die vier Genotypen hier studiert. Durchschnittswerte für die fünf Assay-Platten für jede Genotyp verwendet werden angezeigt. Vom 3. Tag nach dem schlüpfen, ~ 70 % der Btl-Gal4 > FH Uif RNAi Larven wurden außerhalb der Nahrung, während keine Larven außerhalb der Küche oder auf der Agar-Oberfläche für die anderen drei Genotypen erkannt wurden. Die Btl-Gal4 > FH Uif RNAi Larven sterben langsam 15 Tage nach dem Schlupf zwischen 4-20 Tage mit ~ 15 % von ihnen noch am Leben. Der schwarze Pfeil entlang der x-Achse gibt hier und in (B) den Tag, mit dem alle Larven der drei anderen Genotypen pupated hatte. (B) Anteil der Toten Larven sichtbar außerhalb der Nahrung für die vier Genotypen. Durchschnittswerte für die fünf Assay-Platten für jede Genotyp werden angezeigt. Toten Btl-Gal4 > FH Uif RNAi Larven sammeln sich im Laufe der Zeit mit den meisten sterben außerhalb essen. Die anderen Genotypen, die alle überleben zur Verpuppung (C) Prozentsatz Überleben zur Verpuppung für die vier Genotypen untersucht. Durchschnittswerte für die fünf Assay-Platten für jede Genotyp werden angezeigt. Keine normalen Puppen von Btl-Gal4 > FH Uif RNAi Genotyp produziert wurden. Fehlerindikatoren in Abbildung repräsentieren SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig2.jpg"> Abbildung 2. Quantifizierung von Larven tunneling. (A) Beispiele für die Assay-Platten für alle vier Genotypen studierte nach der Vorbereitung für den Tunnelbau Quantifizierung. Beachten Sie die völlige Fehlen von Tunneln für die Btl-Gal4 > FH Uif RNAi Larven. Assay-Platten sind 10 cm Petri Platten. (B) Quantifizierung tunneling abgeleitet von Bild J für die vier Genotypen. Durchschnittliche Pixelwerte für die fünf Assay-Platten für jede Genotyp. Keine Tunnelbau für die Btlbeobachtet wurde-Gal4 > FH Uif RNAi Larven. Fehlerbalken = SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig3.jpg"> Abbildung 3. Vergleich der Btl-Gal4 > FH Uif RNAi und Btl-Gal4 > + Larven Larven des ähnlichen Alters (6. Tag nach dem Schlupf) für die Btl-Gal4 > FH Uif RNAi (A) und Btl-Gal4 > + (B) Genotypen. Rote Pfeile zeigen auf die dorsale Stamm Tracheen. Beide Larven mit der gleichen Vergrößerung abgebildet. Maßstabsleiste = 0,5 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae at JoVE.com

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Das Protokoll beschreibt einen einfache Assay Drosophila Melanogaster Larven zu identifizieren, die Hypoxie unter normalen atmosphärischen Sauerstoffniveaus durchleben. Dieses Protokoll ermöglicht hypoxische Larven zu unterscheiden von anderen Mutanten, die überlappende Phänotypen wie Trägheit oder langsames Wachstum zeigen.

Ein Graben/Tunneling Test zur Erkennung von Hypoxie in Drosophila Melanogaster Larven

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

a-burrowingtunneling-assay-for-detection-hypoxia-drosophila

Research

JoVE Journal

Behavior

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

7.7K Aufrufe.  Rice University. Das Protokoll beschreibt einen einfache Assay Drosophila Melanogaster Larven zu identifizieren, die Hypoxie unter normalen atmosphärischen Sauerstoffniveaus durchleben. Dieses Protokoll ermöglicht hypoxische Larven zu unterscheiden von anderen Mutanten, die überlappende Phänotypen wie Trägheit oder langsames Wachstum zeigen.

Serie: A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Procedure to Study the Effect of Prolonged Food Restriction on Heroin Seeking in Abstinent Rats

In human drug addicts, exposure to drug-associated cues or environments that were previously associated with drug taking can trigger relapse during abstinence. Moreover, various environmental challenges can exacerbate this effect, as well as increase ongoing drug intake.
The procedure we describe here highlights the impact of a common environmental challenge, food restriction, on drug craving that is expressed as an augmentation of drug seeking in abstinent rats.
Rats are implanted with chronic intravenous i.v. catheters, and then trained to press a lever for i.v. heroin over a period of 10-12 days. Following the heroin self-administration phase the rats are removed from the operant conditioning chambers and housed in the animal care facility for a period of at least 14 days. While one group is maintained under unrestricted access to food (sated group), a second group (FDR group) is exposed to a mild food restriction regimen that results in their body weights maintained at 90% of their nonrestricted body weight. On day 14 of food restriction the rats are transferred back to the drug-training environment, and a drug-seeking test is run under extinction conditions (i.e.&#160;lever presses do not result in heroin delivery).
The procedure presented here results in a highly robust augmentation of heroin seeking on test day in the food restricted rats. In addition, compared to the acute food deprivation manipulations we have used before, the current procedure is a more clinically relevant model for the impact of caloric restriction on drug seeking. Moreover, it might be closer to the human condition as the rats are not required to go through an extinction-training phase before the drug-seeking test, which is an integral component of the popular reinstatement procedure.

A procedure that allows a demonstration of robust augmentation of drug seeking in food-restricted rats is described. Following heroin self-administration training, rats go through an abstinence period, in a drug-free environment, during which they are mildly food restricted. Drug seeking is then tested in the drug-associated environment.

Eine Vorgehensweise, um die Wirkung von Längerer Essen Beschränkung Heroin suche in abstinent Ratten untersucht

In human drug addicts, exposure to drug-associated cues or environments that were previously associated with drug taking can trigger relapse during ...

Forschung

Verhalten

A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate drug-seeking behavior and prompt relapse in abstinent drug users. We have developed a procedure to study the behavioral and neural processes that mediate the impact of context on alcohol-seeking behavior in rats. Following acclimation to the taste and pharmacological effects of 15% ethanol in the home cage, male Long-Evans rats receive Pavlovian discrimination training (PDT) in conditioning chambers. In each daily (Mon-Fri) PDT session, 16 trials each of two different 10 sec auditory conditioned stimuli occur. During one stimulus, the CS+, 0.2 ml of 15% ethanol is delivered into a fluid port for oral consumption. The second stimulus, the CS-, is not paired with ethanol. Across sessions, entries into the fluid port during the CS+ increase, whereas entries during the CS- stabilize at a lower level, indicating that a predictive association between the CS+ and ethanol is acquired. During PDT each chamber is equipped with a specific configuration of visual, olfactory and tactile contextual stimuli. Following PDT, extinction training is conducted in the same chamber that is now equipped with a different configuration of contextual stimuli. The CS+ and CS- are presented as before, but ethanol is withheld, which causes a gradual decline in port entries during the CS+. At test, rats are placed back into the PDT context and presented with the CS+ and CS- as before, but without ethanol. This manipulation triggers a robust and selective increase in the number of port entries made during the alcohol predictive CS+, with no change in responding during the CS-. This effect, referred to as context-induced renewal, illustrates the powerful capacity of contexts associated with alcohol consumption to stimulate alcohol-seeking behavior in response to Pavlovian alcohol cues.

A procedure to study the capacity of an alcohol associated environmental context to trigger the renewal of alcohol-seeking behavior in rats is described.

Eine Vorgehensweise, um Context-induzierte Erneuerung der Pawlowschen Anlage Alkoholsucht bei Ratten Verhalten beobachten

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate ...

The Social Dimension of Stress: Experimental Manipulations of Social Support and Social Identity in the Trier Social Stress Test

In many situations humans are influenced by the behavior of other people and their relationships with them. For example, in stressful situations supportive behavior of other people as well as positive social relationships can act as powerful resources to cope with stress. In order to study the interplay between these variables, this protocol describes two effective experimental manipulations of social relationships and supportive behavior in the laboratory. In the present article, these two manipulations are implemented in the Trier Social Stress Test (TSST)&#8212;a standard stress induction paradigm in which participants are subjected to a simulated job interview. More precisely, we propose (a) a manipulation of the relationship between different protagonists in the TSST by making a shared social identity salient and (b) a manipulation of the behavior of the TSST-selection committee, which acts either supportively or unsupportively. These two experimental manipulations are designed in a modular fashion and can be applied independently of each other but can also be combined. Moreover, these two manipulations can also be integrated into other stress protocols and into other standardized social interactions such as trust games, negotiation tasks, or other group tasks.

Previous research on the social dimension of stress has focused on two important variables: social identity and social support. This protocol introduces an effective experimental manipulation of these two social variables and describes their implementation in a standard stress induction paradigm (Trier Social Stress Test).

Die soziale Dimension der Stress: experimentelle Manipulationen an sozialer Unterstützung und Sozial Identität in der Trier Social Belastungsprobe

In many situations humans are influenced by the behavior of other people and their relationships with them. For example, in stressful situations ...

Automatic Detection of Highly Organized Theta Oscillations in the Murine EEG

Theta activity is generated in the septohippocampal system and can be recorded using deep intrahippocampal electrodes and implantable electroencephalography (EEG) radiotelemetry or tether system approaches. Pharmacologically, hippocampal theta is heterogeneous (see dualistic theory) and can be differentiated into type I and type II theta. These individual EEG subtypes are related to specific cognitive and behavioral states, such as arousal, exploration, learning and memory, higher integrative functions, etc. In neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s, structural and functional alterations of the septohippocampal system can result in impaired theta activity/oscillations. A standard quantitative analysis of the hippocampal EEG includes a Fast-Fourier-Transformation (FFT)-based frequency analysis. However, this procedure does not provide details about theta activity in general and highly-organized theta oscillations in particular. In order to obtain detailed information on highly-organized theta oscillations in the hippocampus, we have developed a new analytical approach. This approach allows for time- and cost-effective quantification of the duration of highly-organized theta oscillations and their frequency characteristics.

Theta activity in the hippocampus is related to specific cognitive and behavioral stages. Here, we describe an analytical method to detect highly-organized theta oscillations within the hippocampus using a time-frequency (i.e., wavelet analysis)-based approach.

Automatische Erkennung von hochorganisierten Theta Oszillationen im Murine EEG

Theta activity is generated in the septohippocampal system and can be recorded using deep intrahippocampal electrodes and implantable ...

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors remains poorly understood. In Drosophila melanogaster, environmental cues, such as food availability, affect mating activity offering a tractable system to investigate the mechanisms modulating sexual behavior. In D. melanogaster, environmental cues are often sensed via the chemosensory gustatory and olfactory systems. Here, we present a method to test the effect of environmental chemical cues on mating behavior. The assay consists of a small mating arena containing food medium and a mating couple. The mating frequency for each couple is continuously monitored for 24 h. Here we present the applicability of this assay to test environmental compounds from an external source through a pressurized air system as well as manipulation of the environmental components directly in the mating arena. The use of a pressurized air system is especially useful to test the effect of very volatile compounds, while manipulating components directly in the mating arena can be of value to ascertain a compound's presence. This assay can be adapted to answer questions about the influence of genetic and environmental cues on mating behavior and fecundity as well as other male and female reproductive behaviors.

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

We demonstrate an assay to analyze the environmental and genetic cues that influence mating behavior in the fruit fly Drosophila melanogaster.

Eine Methode, um die Wirkung von Umwelteinflüssen auf das Paarungsverhalten zu untersuchen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors ...

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. To understand the mechanism of these cellular events, and their causal relationships with each other, Drosophila melanogaster, with its sophisticated genetic tools and diverse behavioral features, are used as disease models for assessing neurodegenerative phenotypes. Here we describe a high-throughput method to analyze Drosophila adult negative geotaxis behavior, as an indication for possible motor defects associated with neurodegeneration. An automated machine is designed and developed to drive fly synchronization using an initial electric impulse, later allowing the recording of negative geotaxis behavior over a course of secs to mins. Images from the digitally recorded video are then processed with the self-designed RflyDetection software for statistical data manipulation. Different from the manually controlled negative geotaxis assay based on single fly, this precise, fast, and high-throughput protocol allows data acquisition from more than hundreds of flies simultaneously, providing an efficient approach to advance our understanding in the underlying mechanism of locomotor deficits associated with neurodegeneration.

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

This step-by-step protocol analyzes Drosophila negative geotaxis behavior using an automated multi-cylinder system that hosts hundreds of flies and synchronizes their action by an electric motor. Upon synchronization, fly negative geotaxis behavior is assayed, digitally recorded, and analyzed using the self-designed RflyDetection software.

Eine automatisierte rasche Iterative Negative Geotaxis Assay für die Analyse von Erwachsenen Klettern Verhalten in einem Drosophila -Modell der Neurodegeneration

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. ...

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human populations, the Drosophila model allows strict control over genetic background, and virtually unlimited numbers of individuals of the same genotype can be reared rapidly under well-controlled environmental conditions without regulatory restrictions and at relatively low cost. Flies exposed to ethanol undergo physiological and behavioral changes that resemble human alcohol intoxication, including loss of postural control, sedation, and development of tolerance. Here, we describe a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The assay is based on video recording of single flies introduced without anesthesia in 24-well cell culture plates in a set-up that enables synchronous initiation of alcohol exposure. The system enables a single person to collect individual ethanol sedation data on as many as 2,000 flies within an 8 h work period. The assay can, in principle, be extended to assess the effects of exposure to any volatile substance and applied to measure effects of acute toxicity of volatiles on other insects, including other fly species.

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Current methods to measure alcohol sensitivity in Drosophila are designed to test groups of flies. We present a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The method does not require specialized tools and can be performed in any laboratory using common materials.

Hochdurchsatzmethode zur Messung der Alkoholsedationszeit einzelner Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila larvae, customized metal nickel-titanium alloy (nitinol) filaments. These mechanical probes are similar to the von Frey filaments used in vertebrates to measure mechanical nociception. Here, we demonstrate how to make and calibrate these mechanical probes and how to generate a full behavioral dose-response from subthreshold (innocuous or non-noxious range) to suprathreshold (low to high noxious range) stimuli. To demonstrate the utility of the probes, we investigated tissue damage-induced hypersensitivity in Drosophila larvae. Mechanical allodynia (hypersensitivity to a normally innocuous mechanical stimulus) and hyperalgesia (exaggerated responsiveness to a noxious mechanical stimulus) have not yet been established in Drosophila larvae. Using mechanical probes that are normally innocuous or probes that typically elicit an aversive behavior, we found that Drosophila larvae develop mechanical hypersensitization (both allodynia and hyperalgesia) after tissue damage. Thus, the mechanical probes and assay that we illustrate here will likely be important tools to dissect the fundamental molecular/genetic mechanisms of mechanical hypersensitivity.

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

The goal of this protocol is to show how to perform an improved assay for mechanical nociception in Drosophila larvae. We use the assay here to demonstrate that mechanical hypersensitivity (allodynia and hyperalgesia) exists in Drosophila larvae.

Ein verbesserter Assay und Werkzeuge zur Messung der mechanischen Nociception in Drosophila Larven

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental factors, and the toxicological and pharmacological effects of numerous substances. Few methods currently implemented are amenable to high throughput measurement. The Microplate Feeder Assay (MFA) was developed for quantifying the consumption of liquid food for individual flies using absorbance. In this assay, flies consume liquid food medium from select wells of a 1536-well microplate. By incorporating a dilute tracer dye into the liquid food medium and loading a known volume into each well, absorbance measurements of the well acquired before and after consumption reflect the resulting change in volume (i.e., volume consumed). To enable high throughput analysis with this method, a 3D-printed coupler was designed that allows flies to be sorted individually into 96-well microplates. This device precisely orients 96- and 1536-well microplates to give each fly access to up to 4 wells for consumption, thus enabling food preference quantification in addition to regular consumption. Furthermore, the device has barrier strips that toggle between open and closed positions to allow for controlled containment and release of a column of samples at a time. This method enables high throughput measurements of consumption of aqueous solutions by many flies simultaneously. It also has the potential to be adapted to other insects and to screen consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals.

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

The microplate feeder assay offers an economical, high throughput method for quantifying liquid food consumption in Drosophila. A 3D-printed device connects a 96-well microplate in which flies are housed to a 1536-well microplate from which flies consume a feeding solution with a tracer dye. The solution volume decline is measured spectrophotometrically.

Ein Hochdurchsatz-Mikroplatten-Feeder-Assay zur Quantifizierung des Verbrauchs in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

A Procedure to Study Stress-Induced Relapse of Heroin Seeking after Punishment-Imposed Abstinence

The punishment-imposed abstinence procedure models the self-imposed abstinence that humans initiate due to the adverse consequences associated with drug-taking. This model has been implemented in experiments using different types of substances of abuse such as methamphetamine, cocaine, and alcohol. However, punishment-induced abstinence in heroin-trained animals has not been demonstrated. Furthermore, acute stress is a key trigger for relapse in humans and animal models. It was previously demonstrated that acute food deprivation robustly induced reinstatement of extinguished cocaine and heroin seeking. The procedure described here can be used to assess the effects of acute stress exposure on heroin seeking after punishment-imposed abstinence. A total of 8 rats were implanted with chronic intravenous (i.v.) catheters and trained to self-administer heroin (0.1 mg/kg/infusion) for 18 days under a seek-take chained schedule. Completing the seek link gave access to the take lever, which was paired with a heroin infusion. The seek lever was programmed with a variable interval 60 schedule of reinforcement (VI60), and the take lever was programmed with a fixed-ratio 1 reinforcement schedule (FR1). Following self-administration training, a mild foot shock was delivered on 30% of the completed seek links instead of the extension of the take lever. Footshock intensity was increased by 0.1 mA per daily session from 0.2 mA to 1.0 mA. Heroin-seeking tests were performed after 24 h of food deprivation (FD) or sated conditions. Rats under acute food deprivation condition robustly increased heroin seeking after punishment-imposed abstinence.

A procedure that demonstrates a robust acute food deprivation-induced relapse to heroin seeking after punishment-imposed abstinence is described. A punishment-imposed abstinence model was successfully implemented using the seek and take chain schedule for heroin self-administration. Heroin-seeking tests are then performed following 24 h of food-deprivation stress.

Ein Verfahren zur Untersuchung des stressinduzierten Rückfalls der Heroinsuche nach strafbedingter Abstinenz

The punishment-imposed abstinence procedure models the self-imposed abstinence that humans initiate due to the adverse consequences associated with ...