Name: a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae
Uploaded: 2018-03-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae at JoVE.com

Karen M. Qiang George J. Schroepfer Araştırma Ödülü Rice Üniversitesi 2016 alıcı oldu. Fanli Zhou Rice Üniversitesi'nden öğretim bursu alıcı olduğunu. Bloomington Drosophila stok Merkezi, Harvard gezi tesisi hizmetleri Viyana Drosophila Kaynak Merkezi minnetle kabul vardır.

1. larvalar hazırlanması
<ol><li>Tahlil, başlamadan önce iki veya daha fazla gün kadar istenen haçlar deneysel ayarla ve kombinasyonları (en az 20 kadın ve 10 erkek her) yumurta-lay yemeklerinde 13 Wieschaus ve Nusslein-Volhard ama 50 mL polipropilen kullanarak tarafından tanımlandığı gibi kontrol Şişeler ve 6,0 cm tek kullanımlık Petri üzüm agar içeren ve Maya ile bulaşmış yemekleri sadece kullanmadan önce yapıştırın. Sinekler yumurta-lay yemekleri karanlıkta Oda gerekinceye kadar sıcaklıkta tutmak.</li>
	<li>Üzüm agar tarifi – birleştirmek 100 mL donmuş %100 üzüm suyu konsantresi, 350 mL deioinized su, 5 mL buzul asetik ve 13 g D. melanogaster agar bir 1 L cam ölçek. Kadar agar tüm çözülür patlamaları arasında karıştırarak 1-2 dk öbek halinde mikrodalga. Çözüm için bir kaç dakika serin sonra yüzde 10'u (w/v) Nipagen (metil-p-hydroxybenzoate) 10 mL % 95 etanol ekleyin. Mix, sonra pipet 7 mL tek kullanımlık 6,0 cm Petri yemekler, plaka başına izin jel ve 3-4 h. mağaza için oda sıcaklığında 4'te kuru 0C plastik torbalarda.</li>
	<li>Maya hamur tarifi-7 gr kuru maya, 10 mL deiyonize su, tek tip tutarlılık kadar bir spatula ile karıştırın.</li>
	<li>Deneysel oluşturmak ve larva denetlemek için yumurta koleksiyonları zaman aşımına uğradı. Yeni, Maya bulaşmış, üzüm plakaları kullanarak, yumurta oda sıcaklığında 4 h için sabah saatlerinde karanlıkta toplamak. Bu 4 h koleksiyon tabakları kaldırın ve taze plakaları ile değiştirin. Kuluçkaya 4 h koleksiyon tabakları gecede de 25 0C kadar otelde larvalar çoğunu yumurtadan ertesi gün öğleden sonra. Bu ilk biçim larvaların toplamak ve deneme oluşturmak için kullanmak.</li>
</ol>2. tahlil plakaları kurma
<ol><li>Tahlil plakaları hazırlanması. Tahlil tek çalıştırma için beş tahlil plakaları her 10 deneysel larva ve 10 kontrol larvaları beş tabak hazırlamak. 1,5 cm mantar matkap agar merkez bir çekirdek yemek için bir delik oluşturmak her plaka kaldırmak için kullanın. Maya ezmesi (0,8 - 0.9 g) deliğe koy ve yavaşça deliğe doldurma bir Höyük yapmak spatula ile pat.</li>
	<li>Agar plaka hazırlık-16 g D. melanogaster agar bir 2 L cam ölçek ile 700 mL deiyonize su birleştirin ve mikrodalga üzerinden Kaldır 5 dakika süreyle mikrodalga ve undissolved agar çözümü haline getirmek için bir cam çubuk ile karıştırın. % 10 (w/v) Nipagen % 95 etanol, mix, 17.5 mL ekleyin sonra mikrodalga Isıtma 30 s öbek halinde tüm agar tamamen eriyene kadar karıştırarak tarafından takip devam edin. Bir dakika ya da iki için serin, o zaman 15 mL aliquots 10 cm plastik Petri yemekler pipet. Agar jel, kapakları ile kuruyucu ve oda sıcaklığında birkaç saatliğine kuru veya bir gece izin izin. Tabak mühürlü plastik torbalar 18 ° C'de depolayın 1 Not: Nipagen kristalleri yüzeyi fazla dessiccation nedeniyle plakaların oluşumunu önlemek için hazırlık bir kaç gün içinde tabak kullanın. Gerekirse, kristaller birkaç microliters % 95 alkol onları üzerine bırakarak yeniden çözülmüş. Not 2: agar toplu halde farklı jelleşme özelliklere sahip olabilir. Kuru jel levha dokunmak firma ve agar temiz, sağlam çemberi cork matkap gıda delik (yukarı bakın) oluşturmak için kullanılırken kaldırılabilir yeterince esnek olmalıdır.</li>
	<li>Larva tahlil tabak içinde kurma. Plastik microspatula ucu eğri ve "yapışkan" larva çekmek için sağlamak için Maya Yapıştır ipucunda daldırma için mekanik basınç uygulayın. İlk biçim larva kadar ayrı ayrı almak ve agar plaka gıda Höyük yakın koyun. Deneysel her ikisi için 10 larva ve denetim genotip en az beş Çoğalt tabak hazırlamak. Bir kez tam, kap ve her plaka etiket ve oda sıcaklığında karanlık bir alanda tabak (kapak tarafı yukarı) ayarla (bizim laboratuarımızda bu 22 ° C olduğunu).</li>
</ol>3. izleme tahlil plakaları
<ol><li>Tabak günlük diseksiyon mikroskop altında incelemek ve larvaları yemek üzerine veya dışarı agar yüzeyinde kaydedin. Görünür herhangi bir ölü ya da ölmekte olan larvalar unutmayın. Ne zaman ve larva üçüncü INSTAR ilerlerken agar terkedilemeyen tünel görüldüğünde, unutmayın. Pupa oluşmaya başlar ve pupa anormallikleri Not Not tarihleri. Bütün larva öldü veya pupated kadar günlük gözlemler devam edin.</li>
	<li>Pupa plaka iğne ve üzüm bir tabak transfer alay bir bent ile dikkatli bir şekilde çıkarın. İstenirse, Pupa kaç eclose yetişkin olarak belirlemek için izleme devam.</li>
</ol>4. hazırlama tahlil görüntüleme için tabaklar
<ol><li>Dikkatle kaldırmak ve tüm Maya gıda her plaka Merkezi kuyudan.</li>
	<li>Yavaşça her plaka musluk suyu ile sel ve dikkatle izlenen agar yüzeye enkaz kapalı ovmak için yumuşak bir sanatçının boya fırçası kullanın. Su birkaç kez değiştirmek ve her plaka tamamen temiz olana yumuşak fırça devam edin. Tabak deiyonize su ile son durulama vermek, onları kap ve oda sıcaklığında kuru gecede bırakın. Not: Agar tünel gıda höyüğün en yoğun (bkz. Şekil 2). Sonuç olarak, gıda deliğin kenarında genellikle ilk 1.5 cm çapında genişletilir. Buna ek olarak, bu bölgedeki amele agar kırılganlık küçük parçalar halinde temizlik sırasında delik çevresi kayıp olmak tünel agar neden olabilir. Jel agar konsantrasyonu artan bu sorunları ile yardımcı olabilir ama düzeltmeleri görüntü J Nefelometri adımları (aşağıya bakın) sırasında mümkündür.</li>
</ol>5. Nefelometri tünel
<ol><li>Tabakları görüntü. Siyah bir arka plan karşı tüneller içinde agar parlak beyaz satırlar halinde göster için alınan her plaka görüntüsünü hazırlamak. Not: Biz DNA jelleri bu adım için görüntü için yaygın olarak kullanılan bir sistem kullanın (bkz. tablo malzemeleri ve Kimyasalları). Görüntüleme sistemleri gibi digital fotoğraf makinesi ya da cep telefonu kamera TIFF dosyalarını üretme yeteneğine sahip alternatif uygun görüntüler üretmek için ayarlanmış olabilir.</li>
	<li>Larva tünel quantitate için kamu malı programı NIH görüntü J kullanın. Http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html programı indirin. Program hakkında daha fazla bilgi için http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html gidin. Not: Diğer görüntüleme sistemleri tünel quantitate için kullanılabilir. NIH görüntü J. için aşağıdaki talimatları uygulayın</li>
	<li>Tünel bir tabak bir TIFF dosyası görüntü açtıktan sonra tüm agar yüzeyini temsil eden, ancak plastik plaka kenarına bitkileri Nefelometri için bir alan tanımlamak için Oval aracını kullanın.</li>
	<li>Siyah çizgiler olarak gösterilen tünelleri ile plaka, ters bir görüntü üretmek için Otomatik eşik uygulanır. Agar yerine tünelleri hasar temsil herhangi bir siyah alanlar beyaza Boya Fırçası araçları ve Renk Seçici'yi kullanın.</li>
	<li>Analiz aşağı açılır menüsünün altında küme ölçek seçin | Ölçek kaldırmak için tıklatın ve alan ve Eşik sınırı( analiz) altında da ölçüleri ayarlayın camda kontrol edin.</li>
	<li>CTRL tuşu + siyah alanı (tünel) piksel cinsinden göster için M tuşuna basın.</li>
	<li>Kopyala ve Yapıştır piksel değeri her plaka için kantitatif analiz izin vereceği bir elektronik tablo programına (Excel gibi) bu.</li>
	<li>Merkez delik genellikle yoğun bu bölgede tünel nedeniyle genişletilir. Eksik tünel quantitate için "eşik için Limit" işaretini kaldırın ve orta delik tanımlamak için Değnek aracını kullanın. CTRL tuşu + bu alan piksel değerini elde etmek için M tuşuna basın. Bu değer 1.5 cm delik piksel değerini çıkarın ve fark 5.6. adımda elde tünel değerine ekleyin.</li>
	<li>Bir kaç tabak için orta delik untunneled agar deliğe bitişik bölge içerir tünel agar bir parçası eksik olabilir. Ne zaman bu tabaklar kullanmak için orta delik quantitating tünel bölgesi tanımlamak veya sigara tünel alan Nefelometri çıkartmak için eksik bölge boyunca siyah bir çubuk eklemek için Araçlar fırça renk seçici ve boya. 1 Not: Deneysel larva herhangi bir tünel gerçekleştirirseniz, bu Nefelometri ortalama değerleri setleri ve denetim istatistiksel karşılaştırılması ve deneysel değerleri tünel hesaplanması izin verir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+responses+to+oxygen+deprivation.">Conserved responses to oxygen deprivation.</a> J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).</li><li>Lavista-Llanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+hypoxic+response+in+D.+melanogaster+by+the+basic+helix-loop-helix+pas+protein+Similar.">Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar.</a> Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).</li><li>Reiling, J. H., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxia-induced+paralogs+Scylla+and+Charybdis+inhibit+growth+by+down-regulating+S6K+activity+upstream+of+Tsc+in+D.+melanogaster.">The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster.</a> Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).</li><li>Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+and+responding+to+hypoxia+via+Hif+in+model+invertebrates.">Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates.</a> J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).</li><li>Romero, N. M., Dekanty, A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+developmental+adaptations+to+hypoxia:+A+D.+melanogaster+perspective.">Cellular and developmental adaptations to hypoxia: A D. melanogaster perspective.</a> Meth. Enzymol. 435, 123-144 (2007).</li><li>Dijkers, P. F., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+hypoxia-induced,+nitric+oxide-mediated+signaling+cascade.">Dissection of a hypoxia-induced, nitric oxide-mediated signaling cascade.</a> Mol. Biol.Cell. 20 (18), 4083-4090 (2009).</li><li>Zhou, F., Qiang, K. M., Beckingham, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+to+burrow+and+tunnel+reveals+roles+for+jim+lovell+in+the+growth+and+endoreplication+of+the+D.+melanogaster+larval+tracheae.">Failure to burrow and tunnel reveals roles for jim lovell in the growth and endoreplication of the D. melanogaster larval tracheae.</a> PLOS ONE. 11, e0160233 (2016).</li><li>Wingrove, J. A., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+contributes+to+behavioral,+cellular,+and+developmental+responses+to+low+oxygen+in+D.+melanogaster.">Nitric oxide contributes to behavioral, cellular, and developmental responses to low oxygen in D. melanogaster.</a> Cell. 98 (1), 105-114 (1999).</li><li>Zhang, L., Ward, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uninflatable+encodes+a+novel+ectodermal+apical+surface+protein+required+for+tracheal+inflation+in+D.+melanogaster.">Uninflatable encodes a novel ectodermal apical surface protein required for tracheal inflation in D. melanogaster.</a> Dev. Biol. 336 (2), 201-212 (2009).</li><li>Langlais, K. K., Stewart, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+characterization+of+two+atypical+soluble+guanylyl+cyclases+in+the+central+and+peripheral+nervous+system+of+D.+melanogaster+melanogaster.">Preliminary characterization of two atypical soluble guanylyl cyclases in the central and peripheral nervous system of D. melanogaster melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 207 (13), 2323-2338 (2004).</li><li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+responses+to+hypoxia+and+hyperoxia+in+D.+melanogaster+larvae.">Behavioral responses to hypoxia and hyperoxia in D. melanogaster larvae.</a> Fly. 5 (2), 119-125 (2011).</li><li>Brand, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Wieschaus, E., Nusslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: a practical approach. , 199-227 (1986).</li><li>Callier, V., Shingleton, A. W., Brent, C. S., Ghosh, S. M., Kim, J., Harrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+reduced+oxygen+in+the+developmental+physiology+of+growth+and+metamorphosis+initiation+in+D.+melanogaster.">The role of reduced oxygen in the developmental physiology of growth and metamorphosis initiation in D. melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 216 (23), 4334-4340 (2013).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hif-+and+non-Hif-regulated+hypoxic+responses+require+the+estrogen-related+receptor+in+D.+melanogaster.">Hif- and non-Hif-regulated hypoxic responses require the estrogen-related receptor in D. melanogaster.</a> PLoS genetics. 9 (1), e1003230 (2013).</li><li>Grifoni, D., Sallazzo, M., Fontana, E., Froldi, F., Pession, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+oxygen+supply+in+Drosophila+malignancies+identify+tracheogenesis+as+a+novel+cancer+hallmark.">Multiple strategies of oxygen supply in Drosophila malignancies identify tracheogenesis as a novel cancer hallmark.</a> Scient. Rep. 5 (9061), (2015).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Biz burada doku hipoksi D. melanogaster larva algılamak için tasarlanmış basit bir tahlil sundu. Tanı azalma gıda höyükler larva Gençliği ve geç larva hayatta tünel terkedilemeyen yokluğu içine burrowing üzerinde temel alır. Larva kalabalık bir besin kaynağı uzak erken geçiş neden olabilir ve bu nedenle önemli bir özelliği, tahlil larva az sayıda varlığında büyük bir aşırı gıda denetlesinler. Ağar kaplamalar içine mantar ilacı metil-p hidroksil benzoat (Nipagen) dahil de küf gelişimi sırasında tahlil önlemek için önemlidir.
Ağar kaplamalar tahlil değişkenlik bir kaynağı olabilir bulmak. Genellikle, aynı genotip, ebeveynlerin farklı toplu işlemleri veya larva, farklı koleksiyon larvaları davranışlarını tahlil nispeten sınırlı değişim gösterir. Buna ek olarak, Ağar kaplamalar veya farklı günlerde yapılan agar farklı toplu işlemleri ile tünel farklılıklar yol açabilir. Bir hükmü bu nedenle bu denetimi ve deneysel larva tüm Ağar kaplamalar aynı toplu iş hazırlık üzerinden kullanarak test edilmelidir. Agar farklı üreticilerin veya aynı üretim üzerinden bile sevk irsaliyelerini jelleşme güçlerini değişebilir ve bu yüzden yukarı doğru %2.2 burada en iyi bir jel elde etmek için kullanılan ayarla agar konsantrasyon gerekli olabilir. Biz vahşi türü larva kolayca % 3 agar jelleri yuva bulduk.
Bu tahlil değerini göstermek için biz larva bastırılmış fonksiyonu ile potansiyel doku hipoksi araştırmak için kullanılmış uninflatable tracheae. içinde Cihazla ilgili izlenimlerimizi trakeal ifade bu gen kaybı hipoksi üretebilir hipotez için güçlü destek sağlamak: btl-Gal4 > UAS -UIF RNAi larvalar yiyecek ve terkedilemeyen sırasında tünel olmaması içine yuva için hata gösterdi Üçüncü biçim. Diğer genotip bizim önceki çalışmalarda, biz gıda burrowing hipoksi indüklenen kayb terkedilemeyen tünel kaybı ve btltam değil gözlenen-Gal4 > UAS -UIF RNAi larvaları okudum burada benzer şekilde davrandım. Bu testin başarısız tünel bileşeni bu nedenle hipoksi en güçlü bilgi vermez.
Her ne kadar btl-Gal4 > UIf RNAi larva davranış özellikleri hipoksi, kesmek(ue) tanı gösterdi-Gal4 > UAS -UIF RNAi değil bu anormallikler sergi. Btl ve kesme(ue) sürücüleri farklı aşamalarında ve larva tracheae içinde farklı desenler ifade Gal4. Btl-Gal4 sürücü embriyo gelişimi başlayarak ve larva hayatı boyunca devam eden trakeal sistem boyunca ifade edilir. Buna karşılık, Gal4 ifade kesmek(ue)-Gal4 sürücü sadece embriyonik hayatın sonunda tracheae morfogenetik sonra başlar ve dorsal gövdeleri, büyük boyuna gemilerin aşırı arka bölümlerine sınırlı olmalıdır trakeal sistemi. Bu Gal4 hattı ile UIF nakavt değil bu nedenle azaltmak UIF ifade yeterince erken ya da genel olarak yeterli hipoksi davranışları tetiklemek için gerekli bazı eşik düzeyini üretmek için ölçülen bu tahlil.
Bir önceki çalışma üçüncü INSTAR larva düşük (% 10) oksijen düzeylerine maruz azalmış büyüme göstermek buldum ve pupariation 14başlangıcı gecikmiş. Btl-Gal4 > RNAi burada okudu UAS - larvaUIF üçüncü INSTAR ilerledi ama onların büyüme ve pupation oranları üzerindeki etkileri daha belirgin olduğunu: denetimleri altında çok az yağ dokusu ile önemli ölçüde daha küçük olduklarını epidermis (şekil 3) ve yalnızca küçük bir kısmını (~ %10) pupariation çalıştı. Bu farklılıklar btlöneririz-Gal4 > UAS -UIF RNAi larva deneyimli hipoksi, daha büyük bir ölçüde UIF nakavt tracheae içinde bütün larva yaşamları mevcut olduğu için veya daha fazla üretilen çünkü şiddetli oksijen yoksunluğu üçüncü biçim içinde. Nasıl tracheae bir UIF işlev kaybı oksijen taşıma engel olabilir bu noktada belirsizdir. Btltracheae-Gal4 > UAS -UIF RNAi larva kütikül (şekil 3), bir gösterge yer alan hava ve sıvı giriş işlevi uzlaşma noktası zarar görmüş değil aracılığıyla kolayca görünür. Bu nedenle UIF fonksiyon kaybı tarafından oluşturulan trakeal hasarın hipoksi ama tünel engeller oldukça bazı diğer kusur temin etmez resmen mümkündür. Daha önce okudu genotip için başarısızlık tünel için geç üçüncü INSTAR larva 15' te karaciğer mRNA7düzeyleri, kurallı göstergesi Glikoliz ve hipoksi ile ilişkili olduğunu belirledi. Böylece, teyidi için btlhipoksi-Gal4 > UAS -UIF RNAi larva (ve gelecekte muayene larva Bu testin kullanın) karaciğer mRNA düzeyleri veya ölçmek için piyasada bulunan bir göstergesi kullanımı değerlendirmek için RT-PCR yer alacağı Hücre içi oksijen düzeyleri (örneğin bkz: 16).

Moleküler genetik araçlar D. melanogaster içinde kullanılabilir Gelişmiş dizi örümceklerle korunmuş biyolojik süreçlerin çalışma için değerli bir organizma olun. Oksijen durumu anahtar moleküler yanıt evrim arasında korunmuş kanıtlanmıştır ve D. melanogaster önceki çalışmalarda bu yolları 1,2sinyal evrensel bileşenleri anlayışlar üretilip, 3,4,5,6.
D. melanogaster larva işlevinde duyusal nöron anatomi amaçlı bir çalışmanın bir parçası olarak, biz doku hipoksi normal oksijen düzeyleri 7tarafından etkinleştirilmesi ortaya çıktı iki davranışsal yanıt tespit. Bunlardan biri, maması, yuva hatası son derece düşük oksijen düzeyleri Wingrove ve O'Farrell 8tarafından bildirilen yanıt ilgilidir. İkinci davranış yumuşak bir terkedilemeyen faz, göçebe geç üçüncü biçim sırasında tünel için hata daha önce olarak hipoksi ile ilgili tespit edilmedi değil. Vahşi türü göçebe larva düşük oksijen düzeylerine maruz kalmaları da 7, tünel terkedilemeyen engeller böylece kurulması hem bu davranışlar hipoksi kaynaklanan - ya doku hasarı veya düşük oksijen alımını düzeyleri tarafından indüklenen belirledi. Burada hemen larva tarama sonra gözlemleri ile başlayan bu iki hipoksi indüklenen davranışlar, quantitate için geliştirdiğimiz bir tahlil açıklayın.
Erken larva evresinde hipoksik yanıt daha önce muayene değil ve bu nedenle bir çözümlemesini larva hayatı boyunca bizim tahlil, değerli bir bileşenidir. Hipoksi-yavaş geliştirme, zavallı büyüme ve Lokomotor tembellik-belirgin belirtileri çoğu larva fenotipleri birçok mutasyon tarafından üretilen ile çakışıyor. Ama biz sadece üçüncü INSTAR larva hipoksi ile 7tünel için tam bir başarısızlık gösterir bulduk. Bu yüzden, biz bile larva daha büyüme ve hareket açısından bizim hipoksik larva uzlaşma, hipoksik larva asla 7tünel, ancak hala bazı tünel, gerçekleştirilen belirlenir. Başka bir değerli Bu testin böylece hipoksi başka stres veya metabolik bozukluk karşı pleiotropic fenotipleri belirli bir dizi kaynak olduğunda oluşturmak için bir yol sağlayan öğedir. Testin gücümüzü, burada tarif biz larva yanıt azaltılmış trakeal ifade ile karakterize içinde kullanımı uninflatable, larva Havayolları 9' fonksiyonları bir gen.
Bu tahlil zavallı büyüme ve halsiz davranışı içerir larva fenotipleri karakterize uğraşan araştırmacılar için değerli olacağını öngörmektedir. Sonuç olarak, dağıtım, kullanımı veya yanıt için etkisi yeni genlerin vücuda oksijen belirlenmiştir. Ayrıca, bu tahlil Protokolü eleme bir mutant birleşmeyle hipoksi üretmek mutasyonlar belirlenmesi için doğrudan bir yol sağlar. Bu tahlil de burada açıklanan hipoksi indüklenen doğuştan gelen davranışlarını ortaya çıkarır devre analiz değerli olacaktır. Bu tür sinir ağı analizi çok geçerli araştırma bir odak noktasıdır ve D. melanogaster larva basit sinir sistemi otomatik davranışları dissekan için değerli bir sistemdir. Duyusal nöronlar larva oksijen algı dahil zaten, hipoksi indüklenen yanıtları 10,11tam devre tanımlama yolunda ilk adım sağlayan tespit edilmiştir. Bizim tahlil GAL4-UAS sistem12 ile seçici sinirsel nakavt ile birlikte daha da operasyona neural ağ bileşenleri için açık bir yol kullanmaktır.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dehydrated yeast&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frozen grape juice concentrate</td><td>Welch&#039;s</td><td></td><td>&amp;nbsp;Available at most large supermarkets</td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila agar</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-para-hydroxybenzoate</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>20-658</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylene beakers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6.0 cm disposable Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>08757100B</td><td></td></tr><tr><td>10 cm disposable plastic Petri dishes</td><td>E+K Scientific</td><td>EK-24104</td><td></td></tr><tr><td>Plastic microspatulas</td><td>Corning Incorporated</td><td>3012</td><td></td></tr><tr><td>Bent teasing needle</td><td>Nasco</td><td>S08848MH</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td></td><td></td><td>Any microscope with 10-30X magnification</td></tr></tbody></table>

a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae

Oksijen yetmezliği hayvanlarda düşük atmosferik oksijen düzeyleri maruz veya oksijen dağılımı ile müdahale iç doku hasarına neden olabilir. Oksijen algılamalı nöronların anormal davranış hipoksi gibi davranış varlığında normal oksijen seviyesi neden mümkündür. D. melanogasteriçinde büyüme ve halsiz davranış inhibisyonu larva evreleri sırasında düşük oksijen düzeyleri geliştirme sonuçlanır. Ancak, oksijen açığı kurulan bu belirtileri önemli ölçüde büyüme, stres yanıt veya hareket düzenleyen birçok mutasyon fenotipleri ile çakışıyor. Sonuç olarak, orada şu anda hiçbir tahlil i) hücresel hipoksiyadan bir mutasyon veya II) hipoksi gibi davranış ne zaman anormal nöronal davranış tarafından indüklenen tarafından indüklenen tanımlamak kullanılabilir.
Biz son zamanlarda normal oksijen düzeyleri hipoksi dahili algılama yanıt olarak oluşan D. melanogaster larva iki farklı davranışları belirledik. İlk olarak, her aşamasında bu tür larva gıda kez uzak straying bir besin kaynağı, içine burrowing kaçının. Larva hipoksik ise ikinci olarak, yumuşak bir terkedilemeyen tünel, normalde göçebe üçüncü INSTAR aşamasında oluştuğu tamamen kaldırıldı. Burada açıklanan tahlil algılamak ve bu davranışları quantitate için tasarlanmıştır ve bu nedenle hipoksi indüklenen düşük dış oksijen yerine iç hasar tarafından tespit etmek için bir yol sağlamak için. Tahlil plakaları bir agar terkedilemeyen ve Maya hamur merkezi bir fiş ile hayvanlar larva ömrü boyunca desteklemek için kullanılır. Üçüncü ilk biçim devam ederken pozisyonları ve larvalar durumunu günlük izlenir. Göçebe aşamasında agar terkedilemeyen tünel ölçüde NIH ImageJ kullanarak pupation sonra quantitated. Tahlil ne zaman hipoksi bir mutant bir fenotip bileşenidir belirlemede değerli olacak ve böylece eylem söz konusu genin olası siteleri içgörü sağlamak.

Bu tahlil değerini bir gösteri biz larva genin Engelli fonksiyonu ile potansiyel hipoksi araştırmak için kullandık uninflatable (UIF) tracheae içinde. UIF larva trakeal hücrelerinin apikal yüzeye kuvvetle ifade büyük bir transmembran protein kodlar. UIF mutantlar doku hipoksi nedeniyle trakeal arıza 9gösterebilir anormal davranışlar gösteren önceden kaydedilmiştir. Özellikle Gal4-UAS sistemini kullanarak larva soluk borusu ifadede UIF bastırılır. İki Gal4 çizgiler kullanılmıştır: i) nefes nefese (btl)-Gal4, şiddetle kendi embriyonik geliştirme ve II başlangıcından itibaren tracheae olarak ifade edilir) (ue) kesmek-ifadesi bir bölgede küçük arka başlar Gal4 embriyogenez sonunda ana dorsal gövde tracheae ve güçlü ifade larva hayat 7tüm bu bölgede devam ediyor. Bir UAS -UIF RNAi satır Viyana Drosophila araştırma Merkezi'nden (VDRC ID #1050) elde edildi.
İletişim kuralı yukarıda açıklandığı gibi beş yeni taranmış ilk biçim larva her dört Haç için aşağıdaki gibi tuzağa düşürüldük plakaları çoğaltmak.
Deneme 1 1) kontrol 1 - kesme(ue)-Gal4 x Canton-S (+) 2) deneysel 1 - kesme(ue)-Gal4 x UAS-UIF RNAi
Deneme 2 3) denetim 2 - btl-Gal4 x Canton-S (+) 4) deneysel 2 - btl-Gal4 x UAS-UIF RNAi
Kesme(ue) davranışını-Gal4 > UAS -UIF RNAi larva deney 1 karşılaştırılabilir kontrol kesmek(ue) için-Gal4 > + hayvan tavşan çukuru, tünel ve pupation, (Resim 1 için hayatta kalma açısından ve Şekil 2). Buna ek olarak, aşağı düzenleyen UIF ifade erken geliştirme (deney 2) içinde tüm trakeal sistemden boyunca belirgin farklı tepkiler üretti. Btl-Gal4 > UAS -UIF RNAi larva görüntülenen doku hipoksi-her iki davranış belirtileri azaltılmış gıda tavşan çukuru ve larva ileride (Resim 1 ve Şekil 2 Tünel terkedilemeyen toplam yokluğunda ). Deneysel larvaları da belirgin bir şekilde daha küçük, daha ince ve daha denetimlerden (şekil 3) daha halsiz ve tahlil süresince yüksek ölüm oranı gösterdi. Yukarıda da açıklandığı gibi düşük büyüme, tembellik ve organizma ölüm larva hipoksi belirtileri bilinir. Buna ek olarak, denetim larva pupated sonra deneysel larva pupation girişimi başarısız oldu ve kaldı çoğu gibi üçüncü larvalar uzun biçim. Bazı larva pupating (şekil 1A) sonunda ölmek önce 15 günden fazla hayatta. Deneysel larva birkaç YavruIar istedim ama her durumda bu canlı yetişkin oluşturmadı anormal pupa kuruldu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig1.jpg"> Şekil 1. Nefelometri gıda tavşan çukuru ve larva gelişme. (A) dört genotip gıda Höyük dışında canlı larvaları yüzdesi burada okudu. Ortalama her genotip için kullanılan beş tahlil plakaları için gösterilir. 3 gün sonra yumurtadan, btl~ %70 tarafından-Gal4 > UAS UIF RNAi larva edildi gıda dışında hiçbir larvaları yemek dışında veya diğer üç genotip için agar yüzeyinde tespit edildi ise. Btl-Gal4 > UAS UIF RNAi larva ölmek yavaş yavaş bunların gün hayatta arasında 4-20, ~ %15 15 gün sonra tarama. X ekseni boyunca siyah oku burada ve (B) hangi üç genotip bütün larva pupated gün gösterir. (B) ölü larvaları yemek için dört genotip dışında görünür yüzdesi. Ortalama her genotip için beş tahlil plakaları için gösterilir. Ölü btl-Gal4 > UAS UIF RNAi larva birikir çoğu ölüyor ile zaman içinde gıda dışında. Tüm pupation için hayatta diğer genotip (C) yüzde hayatta kalması için pupation dört genotip için okudu. Ortalama her genotip için beş tahlil plakaları için gösterilir. Btlnormal hiçbir pupa-Gal4 > UAS UIF RNAi genotip üretildi. Hata çubukları şekil boyunca SEM'ler temsil eder. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig2.jpg"> Şekil 2. Nefelometri larva tünel. (A) tüm dört genotip için tahlil tabak örnekleri sonra Nefelometri tünel için hazırlık okudu. Not için btltünel olmaması-Gal4 > UAS UIF RNAi larvaları. Tahlil plakaları 10 cm Petri tabaklara. (B) tünel Nefelometri görüntü J dört genotip için türetilmiş. Piksel değerlerini her genotip için beş tahlil plakaları için ortalama. Hiçbir tünel için btlgözlendi-Gal4 > UAS UIF RNAi larvaları. Hata çubukları SEM'ler =. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig3.jpg"> Şekil 3. Btlkarşılaştırılması-Gal4 > UAS UIF RNAi ve btl-Gal4 > + larva Btliçin benzer yaş (gün 6 çıkım sonra) larvaları-Gal4 > UAS UIF RNAi (A) ve btl-Gal4 > + (B) genotip. Kırmızı oklar dorsal gövde tracheae gelin. Her iki larva aynı büyütme oranında yansıması. Ölçek çubuğu 0.5 mm. = <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae at JoVE.com

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Hipoksi normal atmosferik oksijen düzeyleri altında karşılaşan Drosophila melanogaster larva tanımlamak için basit bir tahlil protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı tembellik veya yavaş büyüme gibi örtüşen fenotipleri göstermek başka mutantlar dan ayırt edici olmak hipoksik larva sağlar.

Bir oyuk/tünel tahlil için algılama hipoksi Drosophila melanogaster larva içinde

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

a-burrowingtunneling-assay-for-detection-hypoxia-drosophila

Research

JoVE Journal

Behavior

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

7.8K Görüntüleme.  Rice University. Hipoksi normal atmosferik oksijen düzeyleri altında karşılaşan Drosophila melanogaster larva tanımlamak için basit bir tahlil protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı tembellik veya yavaş büyüme gibi örtüşen fenotipleri göstermek başka mutantlar dan ayırt edici olmak hipoksik larva sağlar.

Video: A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Test için Yöntemler Drosophila Davranış

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Nörobilim

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Içinde larvaların Devre Fonksiyonel Analiz Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

<meta charset="utf8"></head><body>Drosophila davranış çalışmaları için uygun fiyatlı ve verimli bir "ev yapımı" platform ve larva mitokondriyal respirometrisi için eşlik eden bir protokol

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

Drosophila davranış çalışmaları için uygun fiyatlı ve verimli bir "ev yapımı" platform ve larva mitokondriyal respirometrisi için eşlik eden bir protokol

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Davranış

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and diverse behavioral features. Identifying behavioral deficiency in animal models is a crucial measure of disease severity, for example, in neurodegenerative diseases where patients often experience impairments in motor function. However, with the availability of various systems to track and assess motor deficits in fly models, such as drug-treated or transgenic individuals, an economical and user-friendly system for precise evaluation from multiple angles is still lacking. A method based on the AnimalTracker application programming interface (API) is developed here, which is compatible with the Fiji image processing program, to systematically evaluate the movement activities of both adult and larval individuals from recorded video, thus allowing for the analysis of their tracking behavior. This method requires only a high-definition camera and a computer peripheral hardware integration to record and analyze behavior, making it an affordable and effective approach for screening fly models with transgenic or environmental behavioral deficiencies. Examples of behavioral tests using pharmacologically treated flies are given to show how the techniques can detect behavioral changes in both adult flies and larvae in a highly repeatable manner.

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

The present protocol assesses the locomotor activity of Drosophila by tracking and analyzing the movement of flies in a hand-made arena using open-source software Fiji, compatible with plugins to segment pixels of each frame based on high-definition video recording to calculate parameters of speed, distance, etc.

Drosophila'da Lokomotor Aktiviteyi Test Etmek İçin Basit Bir Teknik

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

için yiyecek arama yolu uzunluğu Protokolü<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating the neuronal regulation of these behaviors is essential for the understanding of the physiological and molecular mechanisms underlying nutritional homeostasis. The use of genetically tractable animal models such as worms, flies, and fish greatly facilitates these types of studies. In the last decade, the fruit fly Drosophila melanogaster has been used as a powerful animal model by neurobiologists investigating the neuronal control of feeding and foraging behaviors. While undoubtedly valuable, most studies examine adult flies. Here, we describe a protocol that takes advantage of the simpler larval nervous system to investigate neuronal substrates controlling feeding behaviors when larvae are exposed to diets differing in their protein and carbohydrates content. Our methods are based on a quantitative colorimetric no-choice feeding assay, performed in the context of a neuronal thermogenetic-activation screen. As a read-out, the amount of food eaten by larvae over a 1 h interval was used when exposed to one of the three dye-labeled diets that differ in their protein to carbohydrates (P:C) ratios. The efficacy of this protocol is demonstrated in the context of a neurogenetic screen in larval Drosophila, by identifying candidate neuronal populations regulating the amount of food eaten in diets of different macronutrient quality. We were also able to classify and group the genotypes tested into phenotypic classes. Besides a brief review of the currently available methods in the literature, the advantages and limitations of these methods are discussed and, also, some suggestions are provided about how this protocol might be adapted to other specific experiments.

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Described here is a protocol that enables the colorimetric quantification of the amount of food eaten within a defined interval of time by Drosophila melanogaster larvae exposed to diets of different macronutrient quality. These assays are conducted in the context of a neuronal thermogenetic screen.

Drosophila Larvaları Kullanılarak Termogenetik Nöronal Ekranda Makro besin alımının nicelleştirilmesi

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

Drosophila Larva Fototaksisanalizi için Hafif Nokta Tabanlı Tahlil

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Biyoloji

Drosophila Burrowing and Tunneling Assay: A Method to Assess Tissue Hypoxia in Fly Larvae

Source: Qiang, K. M., et al. <a href="https://www.jove.com/video/57131/" target="_blank">A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2018).
This video shows a method to test hypoxia in Drosophila larvae by assessing their burrowing and tunneling abilities. Using this technique researchers can distinguish larvae experiencing oxygen deprivation from those with developmental deficits. The example protocol demonstrates the setup for this assay.

Drosophila Oyuk Açma ve Tünel Açma Deneyi: Sinek Larvalarında Doku Hipoksisini Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Source: Qiang, K. M., et al. A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae. J. Vis. Exp. (2018).
This video shows ...

Bir oyuk/tünel tahlil için algılama hipoksi Drosophila melanogaster larva içinde

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Test için Yöntemler Drosophila Davranış

Içinde larvaların Devre Fonksiyonel Analiz Drosophila

Drosophila davranış çalışmaları için uygun fiyatlı ve verimli bir "ev yapımı" platform ve larva mitokondriyal respirometrisi için eşlik eden bir protokol

Drosophila davranış çalışmaları için uygun fiyatlı ve verimli bir "ev yapımı" platform ve larva mitokondriyal respirometrisi için eşlik eden bir protokol

Drosophila'da Lokomotor Aktiviteyi Test Etmek İçin Basit Bir Teknik

için yiyecek arama yolu uzunluğu Protokolü

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

Drosophila Larvaları Kullanılarak Termogenetik Nöronal Ekranda Makro besin alımının nicelleştirilmesi

Drosophila Larva Fototaksisanalizi için Hafif Nokta Tabanlı Tahlil

Drosophila Oyuk Açma ve Tünel Açma Deneyi: Sinek Larvalarında Doku Hipoksisini Değerlendirmek İçin Bir Yöntem